人外周血γδ T细胞的可溶性anti-TCR γδ抗体扩增及其培养和保存的条件

目的:比较人外周血γδ T细胞不同的制备方法,摸索适于临床应用的培养和保存条件.方法:分离人外周血单个核细胞,分别以固相化和可溶性anti-TCRγδ抗体进行刺激,以添加小牛血清或人AB血浆的RPMI 1640培养液或AIM V无血清培养液进行培养,采用锥虫蓝染色法检测γδ T细胞存活率,采用免疫荧光染色法考察γδ T细胞的纯度和亚型,采用乳酸脱氢酶(lacate dehydrogenase,LDH)法检测γδ T细胞对不同肿瘤细胞系的杀伤作用.结果:添加15%小牛血清和添加5%人AB血浆的RPMI 1640培养液对γδ T细胞的培养效果接近,均优于AIM V无血清培养液.可溶性抗体与固相化抗体扩增外周血γδ T细胞的效果相似;可溶性抗体扩增的γδ T细胞受体(T cell receptor,TCR)库容完整,同时具有TCR Vδ1和Vδ2两种亚型;对肺癌、肝癌和卵巢癌细胞系均有体外杀伤活性.这些γδ T细胞在含1%人AB血浆或0.25%人血白蛋白的生理盐水中、4 ℃条件下保存12 h,细胞存活率仍达95%以上.结论:可溶性anti-TCR γδ抗体和含有人AB血浆的RPMI 1640培养液可以用于人外周血γδ T细胞的体外扩增,扩增得到的γδ T细胞在含有血浆或白蛋白的生理盐水中稳定性较好.     

比较不同磷酸抗原体外扩增前列腺癌患者外周血γδ T细胞的效率

目的:研究唑来膦酸(Zoledronate acid)和异戊烯焦磷酸(IPP)体外扩增前列腺癌患者外周血中γδ T细胞的效率.方法:密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞(PBMCs),分别加入5.0 μmol/L Zol 或10.0 μg/ml IPP联合1 000 IU/ml的rhIL-2于含10%自体血浆的AIM-V培养体系培养,观察并收集细胞,采用流式细胞仪检测刺激后 CD3+Vγ9+的γδ T细胞数量和比例,并计算其扩增效率.结果:经14天扩增培养后,两种磷酸抗原均能在体外扩增前列腺癌患者外周血中的γδ T细胞,Zol组的γδ T细胞在淋巴细胞中最高含量达64.7%,IPP组最高达55.9%,且扩增培养至第9天的γδ T细胞对肿瘤细胞有一定的杀伤活性,但Zol组的扩增效率以及细胞的杀伤活性均明显强于IPP组(P<0.05).结论:Zol具有与IPP体外扩增外周血中γδ T细胞的能力,Zol刺激法可能成为体外扩增前列腺癌患者外周血中γδ T细胞更为经济安全的选择.     

非小细胞肺癌患者γδT细胞和NKT细胞及其亚群检测的意义

 目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）患者γδT细胞、自然杀伤性T（NKT）细胞及相关亚群细胞免疫功能状态及其意义。方法 用荧光标记的单克隆抗体染色，流式细胞仪检测外周血γδ T细胞、NKT细胞及相关亚群的水平。结果 NSCLC 患者γδ T细胞、CD+56 γδ T细胞、CD-56 γδ T细胞、NKT细胞、γδ T+ NKT细胞绝对计数和γδ T细胞、γδ T- NKT细胞相对计数显著低于正常对照；NKT细胞、γδ T+ NKT细胞、γδ T- NKT细胞相对计数和γδ T- NKT细胞绝对计数与正常对照比较，差异无统计学意义。γδ T细胞与NKT细胞相关性分析结果，正常对照无相关性，NSCLC 人群呈正相关关系（r = 0.426，P = 0.009）。结论 NSCLC患者γδ T细胞、NKT细胞及其亚群细胞数量显著低于正常对照，NSCLC 人群γδ T细胞与 NKT细胞呈正相关关系。     

结核杆菌抗原特异性激活和扩增γδT细胞

目的探讨用结核杆菌低分子多肽抗原激活和扩增γδT细胞的方法。方法分离获取健康人PBMC,用结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb—Ag）或CD3mAb刺激PBMC,通过流式细胞仪检测总T细胞和佛细胞CD69分子的动态表达（6～72h）及细胞增殖培养10d后78T细胞的比例,用MTT试验检测细胞毒活性。结果对Mtb—Ag的刺激,总T细胞和柙细胞均在活化刺激24h时表达CD69分子达高峰,但总T细胞仅为16．0％,γδT细胞可达75．2％;新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为（5．37±0．64）％（n=5）,在刺激培养10d后,CD3mAb组为（1．37±0．38）％（n=5）,Mtb—Ag组为（69．67±1．46）％（n=5）。结论Mtb—Ag可特异性激活T细胞,用Mtb—Ag刺激T细胞活化增殖培养,可获得大量的T细胞。     

一种简单γδT细胞扩增培养方法及其抗肿瘤生物学功能研究

目的 :建立一种特异快速地诱导扩增人外周血γδT细胞的方法 ,并比较了γδT细胞 ,NK和LAK细胞的抗肿瘤的生物学特性。方法 :收集用不同单抗分别包被粘附的细胞 ,然后通过MACS细胞分选仪的分选 ,获取的细胞进行细胞增殖动力学、细胞表型、细胞杀伤活性的测定以及单抗阻断效应的分析。结果 :经MACS分离得到的γδT细胞 ,培养 2周后细胞数扩增 6 0 0～ 80 0倍 ,CD3,CD8和γδ细胞表达阳性率分别是 72 .2 9% ,5 8.0 2 %和 6 5 .98%。γδT细胞对NK敏感细胞K5 6 2以及NK不敏感细胞Raji和XG 7这 3种不同靶细胞均有较高的杀伤率 ,分别为 35 .98% ,5 2 .2 7%和 6 9.0 8% ;NK细胞对此 3种细胞的杀伤率分别是 45 2 1% ,12 .34%和 11.94% ;LAK细胞的杀伤率分别为 44 .0 1% ,2 9.2 7%和 2 5 .6 8%。γδT细胞对经MHC Ⅰ类单抗阻断前后的K5 6 2 ,Raji和XG 73种靶细胞的杀伤率无明显改变。结论 :γδT细胞、NK细胞和LAK细胞都具有一定的非特异性杀伤肿瘤细胞的作用 ;γδT细胞对MHC Ⅰ类单抗阻断后的肿瘤细胞的杀伤无明显变化。提示γδT细胞较NK细胞和LAK细胞有更广泛的抗瘤谱     

人外周血γδT细胞选择性增殖及其体内抗肿瘤的特性研究

观察人外周血γδＴ细胞在裸鼠体内的抗肿瘤效应。方法用ＭＥＰ和ＩＬ┐２共刺激培养方法,扩增人外周血γδＴ细胞,与人肠癌细胞系（ＬｏＶｏ）细胞混合接种于裸鼠体皮下。结果经共刺激培养１０天后,细胞总数可增加１００～３００倍,γδＴ细胞的比率上升到７０％以上。给裸鼠接种１×１０６ＬｏＶｏ细胞１个月后,不接种γδＴ细胞的对照组裸鼠皮下瘤块重量为０．４ｇ～０．９ｇ,瘤块病理切片显示有明显肿瘤细胞堆积;而同时接种１×１０７γδＴ细胞的实验组裸鼠瘤块重量仅为０～０．００５ｇ,瘤块病理切片显示其中除肿瘤细胞外,还伴有增生性淋巴细胞。结论人外周血γδＴ细胞能有效地抑制人肠癌细胞ＬｏＶｏ在裸鼠体内的生长。     

卵巢癌可溶性抗原和抗CD3单抗体外共同诱导产生细胞毒T细胞

目的 为提高肿瘤生物治疗效果提供其实验基础。方法 用卵巢癌细胞提取可溶性成分作为肿瘤可溶性抗原(TSA),和抗CD_3,单抗(CD_3—McAb)体外共同诱导正常人外周血单个核细胞(PBMC),在含IL—2的培养基中培养,产生杀瘤性效应细胞。结果 经细胞表型分析,CD_8 T细胞为94.62％。这种细胞毒T细胞(CTL)对TSA来源的卵巢癌细胞具有选择性杀伤作用:对其它卵巢癌细胞的杀伤无选择性。结论 CTL对TSA来源的肿瘤细胞具有选择性杀伤作用,对其它细胞的杀伤无选择性。     

胃癌患者外周血中γδT细胞水平升高

背景γδT细胞与免疫调节进程相关。然而,γδT细胞在胃癌病程中的特点目前尚无考据。本研究评价了胃癌患者外周血中γδT细胞和淋巴细胞亚群的产生情况。方法研究入组了48例患者,另设置49位健康受试者作为对照。采用流式细胞术分析γδT细胞和淋巴细胞亚群。     

人外周血γδT细胞对裸鼠人肺癌移植瘤治疗作用的研究

目的:探讨人外周血γδT细胞对已建立肺癌裸鼠的免疫治疗作用.方法:用人肺癌细胞株A549接种BALB/c裸鼠皮下,建立肺癌裸鼠模型.从健康人外周血中提取γδT淋巴细胞, 体外特异性扩增γδT细胞.将已建立肺癌的裸鼠随机分为两组,对照组用RPMI1640培养液,治疗组用γδT细胞分别注入裸鼠腹腔内,观察种植瘤裸鼠生存时间及肿瘤体积,并同时检测肿瘤细胞c-jun的表达.结果:裸鼠接种5×106肺癌细胞后第14天,在接种部位均有肿瘤形成,直径平均为2 mm.在首次治疗后49 d时,对照组、治疗组平均肿瘤体积分别为(0.97±0.32)和(0.46±0.25) cm3,差异有统计学意义,P<0.05.至75 d时,对照组种植瘤裸鼠全部死亡,治疗组生存天数较对照组差异有统计学意义,P<0.05.结论:人外周血γδT细胞对肺癌裸鼠种植瘤具有显著的抑瘤作用,为肺癌免疫治疗提供了一种新的治疗方法.     

食管鳞状细胞癌患者γδT细胞研究

 目的 探讨食管癌患者机体γδT细胞水平及与临床的关系，为γδT细胞在食管癌综合治疗中的应用提供依据。方法 采用流式细胞术测定食管癌患者外周血中和癌组织中γδT细胞水平，分析其与临床的关系。结果 癌组织中浸润γδT细胞水平显著高于癌旁组织（P = 0.045）；食管癌患者外周血中γδT细胞水平显著低于正常人（P = 0.011）；食管癌术后患者外周血中γδT细胞水平显著高于术前患者（P = 0.037）。食管癌T分期、N分期、M分期、大体分型、病变部位、病变长度（3 ~ 5 cm组和5 cm组）、组织学分级各组与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。食管癌患者外周血中总T细胞，各组与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；外周血中γδT细胞年龄、性别、病变长度（＜3 cm），各组与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 γδT细胞在机体抗食管癌中发挥重要作用，手术切除肿瘤后可使患者γδT细胞恢复正常水平。     

肺癌患者外周血γδT细胞的检测及意义

 目的　探讨肺癌患者群体的γδT细胞的功能状态。方法　应用流式细胞术检测124例手术前肺癌患者（肺癌组）和56名健康职工（健康对照组）外周血γδT细胞。结果　γδT细胞健康对照组为（6.54±2.90）%,患者组为（3.76±2.81）%（t＝3.568,P＜0.001）。肺癌患者外周血中γδT细胞水平显著低于健康人（P＝0.000 ）;肺癌组织学分类、T 分期、N分期、M分期、临床分期、大体分型、病变部位各组与健康对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;肺癌患者中不同年龄、性别各组患者外周血中γδT细胞比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论　γδT细胞减少对肺癌的发生有重要影响。     

γδT细胞识别机制研究进展

γδT细胞在肿瘤免疫治疗中具有重要潜力,其识别抗原的特异性和MHC非依赖性使其成为治疗的有力工具。然而,γδT细胞在肿瘤发生发展过程中发挥着复杂多样的双向作用,包括产生促进肿瘤生长的IL-17。近期的研究进一步揭示了γδT细胞的识别机制,包括Vγ9Vδ1 TCR对EphA2的识别机制、Vγ9Vδ2 T细胞激活依赖于磷酸抗原（pAg）介导的BTN2A1-BTN3A1蛋白相互作用,以及TCR链介导的Vδ3亚群识别机制。这些发现为肿瘤免疫治疗提供了新思路,例如通过促进EphA2的表达来增强Vδ1T细胞的杀伤作用,通过干预BTN3A1-BTN2A1相互作用来控制Vγ9Vδ2 T细胞的异常活化等。随着对γδT细胞识别机制研究的不断深入,将为深入理解它们在免疫监视中的角色、优化肿瘤免疫治疗策略提供了新视角和有力支持。     

流式细胞技术和CCK-8法检测 γδ T细胞活性的比较

目的:比较流式细胞技术和CCK-8法检测γδ T细胞的活性。方法:密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞（PBMCs）,经磷酸抗原IPP刺激扩增培养14天,收集 γδ T细胞。将收获的γδ T细胞分为两组:一组将乳腺癌MCF-7细胞与 γδ T细胞共培养4 h,Calcein-AM/PI 双染后流式细胞仪检测;另一组将乳腺癌MCF-7细胞与γδ T细胞共培养4 h,采用CCK-8试剂盒检测。比较两种方法检测γδ T细胞对MCF-7细胞毒活性的差别。结果:效靶比为5∶1、10∶1、20∶1两种方法检测细胞毒活性结果分别为:流式细胞术组为37.30%±0.14%、40.30%±0.11%、50.70%±0.19%;CCK-8法组为17.90%±1.14%、25.70%±1.99%、43.10%±1.42%,两组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。Calcein-AM/PI 双染后经流式检测法能较好的区分活细胞和凋亡细胞,且其结果的准确性、稳定性和重复性强于CCK-8法。结论:流式细胞术较CCK-8法稳定性好,准确性高,是一种优于CCK-8法的检测免疫细胞毒活性的方法。     

γδT细胞与疾病的关系

γδT细胞已是当今细胞治疗研究的热点,活化的γδT细胞具有较强的杀伤活性,具有抗感染、抗肿瘤作用;γδT细胞还可以维持免疫耐受,调节免疫应答,其异常可导致自身免疫性疾病的发生,本文就γδT细胞在这几方面的作用作一综述。     

γδT细胞在细胞免疫治疗骨肉瘤中的潜在作用

γδT细胞是T淋巴细胞中一类数量比较少的细胞,不受MHC I、Ⅱ类分子以及相关抗原肽配体限制,可直接识别抗原,分泌细胞因子溶解靶细胞,具有广泛的抗肿瘤活性.在骨肉瘤患者中,γδT细胞可通过识别骨肉瘤细胞表面相关抗原,溶解杀灭肿瘤细胞.未来以γδT细胞为基础的细胞免疫疗法联合手术、化疗等方法可在较大程度上提高骨肉瘤患者生存率.     

γδT细胞与疾病的关系

γδ T细胞已是当今细胞治疗研究的热点,活化的γδ T细胞具有较强的杀伤活性,具有抗感染、抗肿瘤作用;γδT细胞还可以维持免疫耐受,调节免疫应答,其异常可导致自身免疫性疾病的发生,本文就γδT细胞在这几方面的作用作一综述.     

人外周血γδT细胞CD107a的表达变化与细胞毒活性的关系

目的:探讨人外周血γδT细胞体外诱导过程中CD107a的表达变化及其与γδT细胞细胞毒活性的关系。方法:分离健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),加入含有IL-2和异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyro-phosphate,IPP)的培养基,体外诱导γδT细胞。分别在第7、10、14天以流式细胞仪对培养的γδT细胞进行鉴定,并同时检测其CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达。CCK-8试剂盒检测γδT细胞对胰腺癌细胞SW-1990的杀伤效应。采用SPSS13.0软件进行spearman相关分析。结果:在培养的第7、10、14天,γδTCR阳性细胞分别为(60.31±3.84)%、(66.45±4.25)%、(70.99±4.66)%。CD107a、穿孔素和颗粒酶B的表达在γδT细胞培养第7~10天达到峰值后呈下降趋势,第7天与第0天相比差异有统计学意义[(80.66±4.42)%、(70.11±3.34)%、(94.26±4.25)%vs(69.02±5.04)%、(62.31±4.66)%、(53.62±3.69)%,P<0.05]。培养第7天、第10天的γδT细胞对SW-1990细胞杀伤率显著高于第14天的γδT细胞[(58.86±5.12)%、(61.53±4.69)%vs(40.31±4.83)%,P<0.05]。γδT细胞CD107a表达与穿孔素、颗粒酶B、其对SW-1990细胞杀伤效应显著相关(r=0.853,r=0.785,r=0.839,均P<0.01)。结论:人外周血γδT细胞CD107a的表达与其抗肿瘤能力正相关,可能是γδT细胞细胞毒活性的一个标志。     

γδT细胞、NK细胞及LAK的生物学特性比较

过继性免疫治疗是肿瘤生物治疗的重要手段之一.80年代后期,开始进行LAK细胞抗肿瘤过继免疫治疗,并取得一定效果.近来,γδT细胞和NK细胞在非恃异性或半特异性免疫治疗中的作用逐渐被重视.我们通过体外分离和增殖培养γδT细胞、NK细胞和LAK细胞,比较研究了3种细胞的抗肿瘤的生物学特性,结果显示,以MACS分离γδT细胞,培养2周后细胞数扩增600～800倍,CD3,CD8和γδT表达阳性率分别是70.41%,42.69%和40.5%,γδT细胞对NK敏感细胞K562以及NK不敏感细胞Raji,XG-73种不同到细胞均有较高的杀伤率,分别为35.98%,32.27%和49.08%,高于对照组PBMC的19.56%,11.34%和10.58%;NK细胞对此3种细胞的杀伤率分别是45.21%,12.34%和11.94%;     

人γδT细胞、CD3AK细胞、CIK和DCs对荷胃癌裸鼠的疗效

Rosenberg等将LAK细胞应用于临床以来,人们对肿瘤的细胞免疫治疗进行了深入的研究.由于肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子和肿瘤微环境,以及荷瘤机体抗肿瘤免疫效应细胞不同程度地存在数量和质量上的异常,因此,在肿瘤细胞免疫治疗上必须用固有免疫细胞联合适应性免疫细胞进行治疗,才能有效地清除肿瘤细胞或抑制肿瘤生长.本研究应用术后2年末复发胃癌患者的树突状细胞(dendritics cells,DCs)、CIK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞对已建立的人胃癌(SGC-7901细胞株)模型裸鼠进行单独或联合治疗,以观察这些细胞单用和联用的治疗效果.