RNA结合基序单链相互作用蛋白3在人乳头瘤病毒16型相关宫颈癌细胞和鳞状细胞癌组织中的表达

目的探讨RNA结合基序单链相互作用蛋白3(RBMS3)在人乳头瘤病毒16型(HPV16)相关宫颈癌细胞和鳞状细胞癌组织中的表达。方法通过Western blotting方法检测RBMS3在HPV16 E7表达阳性和阴性宫颈癌细胞中的表达,通过免疫组织化学(IHC)染色方法检测RBMS3在HPV16 E7表达阳性和阴性宫颈鳞状细胞癌组织中的表达,并分析RBMS3和HPV16 E7表达的关系。结果 Western blotting结果显示,HPV16 E7在宫颈癌C33-A细胞中不表达,而HPV16 E7在宫颈癌Si Ha细胞中表达;C33-A细胞中RBMS3的表达显著高于Si Ha细胞(P<0.01)。IHC结果显示,RBMS3在HPV16 E7表达阳性宫颈鳞状细胞癌组织中的表达显著低于HPV16 E7表达阴性宫颈鳞状细胞癌组织(P<0.01),RBMS3和HPV16 E7表达呈负相关(P<0.01)。结论 HPV16相关宫颈鳞状细胞癌组织中RBMS3的表达与HPV16 E7的表达呈负相关,RBMS3可能与HPV16相关宫颈癌的发生有关。     

载体介导的RNAi技术抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达

目的 探讨HPV16E7特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞E7基因的抑制作用.方法 构建HPV16 E7特异性siRNA表达载体,利用脂质体转染CaSki细胞,以荧光定量RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白表达的影响.结果 3种表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7基因mRNA和蛋白的表达,其中载体P1抑制作用最强,在转染后3周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92.86%和81.0%.结论 HPV16E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达.     

宫颈鳞状细胞癌组织中锌指蛋白84和人乳头瘤病毒16E6的表达及关系

目的探讨锌指蛋白84(ZNF84)在人乳头瘤病毒16(HPV16)E6阳性和阴性宫颈癌细胞和鳞状细胞癌组织中的表达及关系。方法以HPV16 E6阳性和阴性的宫颈癌细胞系及宫颈鳞状细胞癌组织(211例)为研究对象,分别采用Western blotting和免疫组织化学(IHC)方法检测HPV16 E6和ZNF84的表达,并分析二者之间的关系。结果 Western blotting结果显示:C33-A细胞不表达HPV16 E6,Si Ha细胞表达HPV16 E6;C33-A细胞中ZNF84的表达显著低于Si Ha细胞(P<0.01)。IHC结果显示:HPV16 E6表达阳性的宫颈鳞状细胞癌组织中ZNF84的阳性表达率显著高于HPV16 E6表达阴性的宫颈鳞状细胞癌组织(P<0.01),HPV16 E6和ZNF84在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达呈正相关(P<0.01)。结论 ZNF84表达上调可能参与了HPV16 E6诱导宫颈癌发生发展的过程,ZNF84可能在HPV16相关宫颈癌发生过程中有一定作用。     

保妇康栓和干扰素α2b栓治疗高危型宫颈HPV持续性感染的效果比较

目的对比分析保妇康栓和干扰素α2b栓治疗高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV-DNA)持续性感染的临床疗效。方法选取经PCR加导流杂交技术行基因检测,持续高危型HPV感染患者共120例,随机分为保妇康栓组66例,干扰素α2b栓组54例,随访1 a,分析比较两组高危型HPV转阴率。结果保妇康栓组的总有效率优于干扰素α2b栓组(P<0.05);保妇康栓治疗高危型HPV16、HPV18、HPV33、HPV58的转阴率高于干扰素α2b栓组(P<0.05);保妇康栓治疗高危型HPV6、HPV31、HPV52的转阴率与干扰素α2b栓组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论保妇康栓及干扰素α2b栓临床治疗HR-HPV-DNA持续性感染感均有一定疗效,但保妇康栓优于干扰素α2b栓。     

Toll样受体4在宫颈癌细胞系中的表达及与HPV16感染的关系

目的探讨Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)在不同宫颈癌细胞系中的表达特点及其与人乳头状瘤病毒(human papillomavirus 16,HPV16)感染的关系。方法采用逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)检测细胞系中HPV16的感染情况;细胞免疫荧光法对H8、SiHa、Caski细胞进行TLR4抗体荧光标记;蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测H8、SiHa、Caski细胞中TLR4蛋白的表达量。结果 H8、SiHa、Caski细胞中均有HPV16E6的表达;荧光显微镜和激光共聚焦显微镜发现TLR4表达在HPV16阳性宫颈癌细胞的细胞膜和细胞浆中;TLR4在不同宫颈癌细胞系中的表达差异具有统计学意义(P<0.05),其中在Caski细胞中表达最高,在SiHa细胞中次之,在H8细胞中表达量最低。结论 TLR4在宫颈癌细胞系中的表达与HPV16感染有关,HPV16感染的程度对TLR4表达量有影响,推测TLR4参与了女性宫颈上皮HPV16的感染,两者共同对宫颈上皮病变发展过程发挥重要作用。     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞 凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki 4组细胞24和48 h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加(P＜0.05)。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达(P＜0.01),而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P 3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变(P＞0.05)。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24 h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48 h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞(P＜0.05),且两组细胞48 h的HPV16E6 mRNA表达均较24 h显著增高(P＜0.05);在24和48 h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少(P＜0.01);但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6 mRNA表达量无统计学差异(P＞0.05)。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型(p53mt/p53wt )无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。     

单磷酸阿糖腺苷对HPV16感染永生化宫颈上皮细胞株H8生物学影响

目的探讨单磷酸阿糖腺苷对HPV16感染永生化宫颈上皮细胞株H8增殖、凋亡及侵袭的影响。方法分别以0、20、40、60、80μg/mL浓度单磷酸阿糖腺苷处理体外培养HPV16感染永生化宫颈上皮细胞株H8,CKK-8法分别在12、24、48、72 h检测H8细胞增殖情况,筛选合适药物浓度及作用时间;将体外培养HPV16感染的H8细胞随机分为三组:对照组、单磷酸阿糖腺苷组及顺铂组,以CCK-8法检测细胞活力;以流式细胞技术检测细胞凋亡率;以Transwell侵袭实验和细胞划痕实验检测单磷酸阿糖腺苷对H8细胞侵袭能力的影响;以免疫印记法检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤因子相关X蛋白(Bax)及侵袭相关蛋白E-cadherin、Vimentin的表达。结果选择60μg/mL的单磷酸阿糖腺苷处理H8细胞48 h来进行H8细胞增殖、凋亡研究,选择单磷酸阿糖腺苷处理H8细胞12 h后检测细胞侵袭转移力。与对照组比较,单磷酸阿糖腺苷组与顺铂组H8细胞活力、H8细胞数目、侵袭能力、Bcl-2、Vimentin表达明显降低,差异有统计学意义(P0.05),凋亡率、E-cadherin及Bax表达显著增加,差异有统计学意义(P0.05);单磷酸阿糖腺苷组和顺铂组相比,各指标差异无统计学意义(P0.05)。结论单磷酸阿糖腺苷能抑制HPV16感染永生化宫颈上皮细胞H8增殖及侵袭转移能力,促进其凋亡。     

雌二醇促进正常宫颈上皮永生化细胞系End1/E6E7增殖的研究

[目的 ]研究在 17- β -E2 作用下正常宫颈上皮永生化细胞End1/E6E7的生长增殖和HPV16 /E6E7基因、ERβ表达的变化 ,探讨雌激素及HPV与ERβ在宫颈上皮病变发展过程中的作用。[方法 ]选取ERα(- ) /ERβ( )的正常宫颈上皮永生化细胞系End1/E6E7细胞 ,应用MTT比色实验及流式细胞术研究 17- β -E2 对其生长与增殖的调控作用 ;应用RT -PCR方法半定量研究 17- β -E2 对该细胞中HPV16 /E6E7基因及ERβ基因表达的影响。 [结果 ]随 17- β -E2 浓度增加 ,倍增时间缩短 ,MTT吸光度值增高 (P =0 .0 4 5 ) ,细胞周期G0 、G1期比例下降 ,G2 、M及S期比例上升 (P =0 .0 0 2 ) ;HPV16 /E6E7mRNA表达增强 (P =0 .0 19) ;ERβmRNA表达无明显改变 (P =1.0 0 )。 [结论 ]雌激素可能通过ERβ以外的途径促进HPV16 /E6E7基因的表达 ,进而促进永生化宫颈上皮的增殖生长。     

鸦胆子素D对HPV16感染细胞株的作用及其可能机制

目的:研究鸦胆子素D对高危型人类乳头瘤病毒(HPV)16感染细胞的增殖抑制作用、促凋亡作用及其可能机制。方法:以人宫颈鳞状上皮永生化细胞株(Ect1/E6E7)作为HPV16型感染的宫颈癌前病变的体外实验模型,用1、5、10、15、30μmol/L的鸦胆子素D分别体外作用于细胞24、48、72 h,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖活性改变;以1、5、10μmol/L的鸦胆子素D分别体外作用于细胞24、48、72 h后,Cell cycle staining solution检测细胞生长周期变化,Hoechst33258细胞核荧光染色法观察细胞凋亡情况,Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率。宫颈癌细胞株Caski含有完整的HPV16型E6、E7基因序列,以此作为阳性对照,通过实时荧光定量PCR技术检测两种细胞内HPV16 E6、E7基因m RNA的表达。结果:鸦胆子素D对Ect1/E6E7细胞具有明显的抑制体外增殖作用,MTT结果显示抑制作用呈时间和浓度依赖性(P<0.05)。经1、5、10μmol/L鸦胆子素D体外作用48 h后,细胞生长周期停滞于G1期。流式细胞仪检测显示,各实验组细胞经鸦胆子素D作用48 h后,细胞凋亡率分别为(6.25±0.76)%、(20.21±1.32)%和(8.61±1.59)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Hochest33258细胞核染色法显示细胞出现凋亡形态学改变。Real-time PCR技术检测结果显示Ect1/E6E7中HPV16 E6、E7m RNA表达水平无明显下降,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。而Caski中HPV16 E6、E7 m RNA表达水平下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:鸦胆子素D能有效地抑制Ect1/E6E7细胞增殖,其机制可能是通过抑制HPV16 E6、E7 m RNA表达从而促进细胞凋亡。     

HPV16相关宫颈癌组织中MUC16和E6表达的关系

目的:探讨人乳头瘤病毒(HPV)16相关宫颈癌组织中粘蛋白抗原16(MUC16)与E6表达的关系。方法:以HPV16 E6阳性和阴性的宫颈癌细胞系和宫颈鳞状细胞癌(简称鳞癌)组织(184例)为研究对象,采用Western blot和免疫组化方法检测HPV16 E6和MUC16的表达。结果:Western blot结果显示:C-33A细胞中HPV16 E6无表达,Ca Ski细胞和Si Ha细胞中可见HPV16 E6表达;C-33A细胞中MUC16的表达低于Ca Ski细胞和Si Ha细胞(P<0.05),Ca Ski细胞和Si Ha细胞中MUC16的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示:HPV16E6阳性的宫颈鳞癌组织中MUC16的表达高于HPV16 E6阴性的宫颈鳞癌组织(χ2=43.670,P<0.001)。结论:宫颈癌细胞系和鳞癌组织中MUC16与E6表达可能有关。     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki4组细胞24和48h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加（P〈0.05）。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达（P〈0.01）,而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变（P〉0.05）。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞（P〈0.05）,且两组细胞48h的HPV16E6 mRNA表达均较24h显著增高（P〈0.05）;在24和48h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少（P〈0.01）;但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6mRNA表达量无统计学差异（P〉0.05）。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型（p53mt/p53wt）无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。     

沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 采用RNA干扰抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤中人乳头瘤病毒(human papillomavirus-16,HPV16)E6基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将HPV16 E6特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)真核表达载体转染到人宫颈癌细胞株CaSki细胞中,经G418筛选,RT-PCR检测E6基因的表达;将细胞接种到BALB/c裸鼠背部皮下,同时将该质粒注射到人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的裸鼠中,观察肿瘤出现时间及体积变化;观察肿瘤组织的病理改变.结果 成功筛选到持续表达E6 siRNA的CaSki细胞,经RT-PCR检测该细胞中HPV16 E6基因表达降低;裸鼠成瘤实验结果显示,处理后的CaSki细胞成瘤能力明显降低,抑瘤率为71.4%;注射质粒进行基因治疗后,裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与质量明显低于CaSki细胞组,差异具有显著性(P＜0.05).病理检查结果显示,经pGensil-CH2处理的肿瘤生长不佳,细胞分裂像少见,组织内有较多坏死区域.结论 沉默CaSki细胞中HPV16 E6基因的表达能明显降低宫癌细胞的成瘤作用.     

HPV-16 E6基因沉默对宫颈癌CaSki细胞的影响

目的: 研究特异性抑制HPV E6基因的表达对宫颈癌CaSki细胞的影响. 方法: 构建表达HPV-16 E6基因siRNA重组质粒,体外转染CaSki细胞后检测E6 mRNA表达变化及E6主要作用靶分子P53的蛋白变化;流式细胞术分析细胞周期. 结果: 特异RNAi表达质粒转染CaSki细胞后明显降低了E6 mRNA水平,且P53蛋白水平增高. 流式细胞仪测定发现细胞停滞在G0-G1期,细胞增殖受到抑制. 结论: 采用RNA干扰技术能沉默CaSki细胞中整合的HPV-16 E6基因的表达,使细胞中抑癌蛋白P53水平增高,导致肿瘤细胞生长停滞.     

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。     

反义寡核苷酸对HPV16阳性人宫颈癌细胞增殖的影响

目的：探讨反义硫代寡核苷酸对ＨＰＶ１６阳性的人宫颈癌细胞增殖的影响，方法：人工合三段１８－ｍｅｒ的反义硫代寡核苷酸Ｓ－ＯＤＮ１－３，其中Ｓ－ＯＤＮ１（ＡＥ６），Ｓ－ＯＤＮ２（ＡＥ７）分别与ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因的起始码及其下游序列互补Ｓ－ＯＤＮ，为一随机序列，分别用三种反义寡核苷酸处理整合有ＨＰＶ１６基因组的人宫颈癌细胞ＳｉＨａ。通过四唑盐比色法，＾３Ｈ－ＴｄＲ参入试验观察不同浓度反义寡核苷酸对Ｓ     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

HPV16 E7"自杀性"DNA 疫苗的构建及其体外表达特性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因的"自杀性"DNA疫苗,并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32/E7质粒为模板,用PCR方法扩增HPV16 E7基因,构建真核表达重组质粒pSCA/E7,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转染BHK-21细胞,然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达,用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400 bp的目的基因片段,测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100%同源。免疫荧光技术检测证实,pSCA/E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实,pSCA/E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA/E7,该重组质粒可在BHK-21细胞中表达,并能诱导被转染的细胞发生凋亡。