PCR-SSCP研究中国日本血吸虫线粒体DNA的遗传变异

目的 研究中国日本血吸虫线粒体DNA的遗传变异。方法 试剂盒抽提我国11个地域株日本血吸虫基因组总DNA,以特异性引物对其线粒体NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)脱氢酶1(ND1)和细胞色素C氧化酶1(CO1)片段进行PCR扩增,PCR产物纯化后作SSCP分析。结果 SSCP结果共出现15种条带类型,其中NDl片段中出现7种条带类型,分别是湖北省5地2种;中国台湾、湖南、安徽与江西各为1种;四川、云南同为1种。CO1片段中出现8种条带类型,其中湖北境内5个地域株中有2种;中国台湾株、湖南、安徽与江西各为1种,四川、云南株各为1种。结论 我国各地域株日本血吸虫存在不同程度的遗传变异。     

安徽省不同地区日本血吸虫群体线粒体基因遗传变异研究

目的 探讨安徽省不同地区日本血吸虫种群的遗传进化关系。 方法 分别从安徽省山丘型流行区(池州市石台县)和湖沼型流行区(安庆市大观区、铜陵市枞阳县)采集钉螺,逸出尾蚴后感染小鼠,每只小鼠感染(50±3)条尾蚴。 35 d 后解剖小鼠,门静脉灌注法收集成虫,提取成虫 DNA,PCR 扩增、克隆和测序成虫的线粒体 NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)脱氢酶 1(ND1)和细胞色素 C 氧化酶亚基Ⅰ( COⅠ)基因,利用生物信息学软件 Dnasp6. 0 和 Mega X 分析所得序列基本特征并构建系统进化树作遗传进化分析。 结果 安徽省三个地区日本血吸虫样本的 ND1 基因序列存在 15 个变异位点,COⅠ序列存在 74 个变异位点;ND1 基因和 COⅠ基因的核苷酸多样性(Pi)分别为 0. 004 7、0. 017 3,样本间 COⅠ基因序列差异高于 ND1 基因;来自湖沼型流行区的样本 ND1 基因和 COⅠ 基因的变异位点数、核苷酸多样性(Pi)均高于来自山丘型流行区样本。 来自山丘型流行区的样本在 ND1 系统进化树中与来自湖沼型流行区的样本聚集在一起,而在 COⅠ基因系统进化树中单独成簇。 结论 来自湖沼型流行区的日本血吸虫样本群体的基因多样性高于来自山丘型流行区的样本。 安徽省三个地区日本血吸虫群体的 COⅠ基因存在遗传分化,而 ND1 基因尚未产生较明显的遗传分化。     

日本血吸虫线粒体DNA两个分子的遗传变异

目的　从线粒体DNA的2个分子,探讨我国日本血吸虫的遗传变异。　方法　试剂盒抽提基因组总DNA后,以特异性引物对线粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶1(ND1)和细胞色素c氧化酶I(COI)进行PCR扩增,将PCR产物分别测序,并以生物信息学方法加以比较,构建系统进化树。　结果　序列系统进化树显示日本血吸虫中国大陆株与中国台湾株之间差异较大,在树状图中可归为2类;中国大陆山区型地域株,即云南洱源和四川天全在树状图中归为1类;中国大陆湖沼洲滩型地域株,即湖南岳阳、江西新建和安徽贵池3个地域株在树状图中处于并列位置;湖北省境内不同地域株在树状图中归为1类。　结论　我国各地日本血吸虫存在不同程度的遗传变异,各地域株间亲缘关系密切,存在共同的起源     

日本血吸虫 NADH脱氢酶 1和细胞色素 C氧化酶 1基因部分序列

目的 :测定和比较日本血吸虫浙江株和安徽株 NADH脱氢酶 1( NADH1)和细胞色素 C氧化酶 1( Cytc1)基因部分序列。方法:用 PCR方法从特定的引物扩增出 NADH1和 Cytc1DNA基因 ,然后进行测序。结果 :获得两株日本血吸虫成虫 NADH1和 Cytc1基因及其序列。结论 :两株日本血吸虫成虫 NADH1基因及其部分序列除第 382位核苷酸不同 ( C/T)外 ,其余的均相同。两株日本血吸虫成虫Cytc1基因及其部分序列完全相同。     

日本血吸虫 NADH脱氢酶 1和细胞色素 C氧化酶 1基因部分序列(英文)

目的 :测定和比较日本血吸虫浙江株和安徽株 NADH脱氢酶 1( NADH1)和细胞色素 C氧化酶 1( Cytc1)基因部分序列。方法 :用 PCR方法从特定的引物扩增出 NADH1和 Cytc1DNA基因 ,然后进行测序。结果 :获得两株日本血吸虫成虫 NADH1和 Cytc1基因及其序列。结论 :两株日本血吸虫成虫 NADH1基因及其部分序列除第 382位核苷酸不同 ( C/T)外 ,其余的均相同。两株日本血吸虫成虫 Cytc1基因及其部分序列完全相同。     

不同地域株湖北钉螺CO1基因的差异研究

目的　研究中国大陆及台湾地区不同地域株湖北钉螺CO1基因的差异,为湖北钉螺种下分类提供依据。方法　收集13个地域株的湖北钉螺,高盐法抽提细胞内全部DNA ,PCR法扩增线粒体CO1基因,纯化并测序。将测序结果输入MEGA2程序,Kimura双参数法计算遗传距离,并分别用UPGMA法和最小进化法构建系统发生树。结果PCR扩增获得CO1基因大小约70 0bp(含两侧引物)。遗传距离显示:13个地域株明显被分为两组,其中四川株和云南株为一组,组内遗传距离为0 .0 35 ,其余为另一组,组内平均遗传距离为0 .0 14。而两组间的遗传距离为0 .12 9。两种方法构建的进化树拓扑结构基本一致。进化树分两大支,四川株和云南株位于一支,其它地域株位于另一支。结论13个自然隔离株湖北钉螺CO1基因总体差异不大,显示为一个种,其中四川、云南株与其它地域株差异显著,支持以往滇川亚种的结论,长江中下游各地域株CO1基因非常相近,支持指名(或湖北)亚种的分类方法。福建株、台湾株的分类地位有待进一步探讨。光壳和肋壳钉螺CO1基因无差异。     

细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)CO1与ND1基因序列分析

目的 为了明确内蒙古锡林郭勒盟西乌旗羊株和锡林浩特市人株细粒棘球蚴之间的基因型及其遗传变异情况。方法 利用分子生物学技术对采自两地区细粒棘球蚴的线粒体CO1基因与ND1基因进行了克隆和测序,并运用DNAStar5.0中的MegAlign工具对已测出的序列进行了分析。结果 西乌旗羊株细粒棘球蚴与锡林浩特市人株细粒棘球蚴CO1基因片段和ND1基因片段大小分别均为936 bp和895 bp。西乌旗羊株细粒棘球蚴CO1基因序列与新疆羊株细粒棘球蚴的CO1基因序列同源性为99.3%;锡林浩特市人株细粒棘球蚴CO1基因序列与新疆人株细粒棘球蚴的CO1基因序列同源性为98.6%;且西乌旗羊株和锡林浩特市人株细粒棘球蚴ND1基因与国内外已报道的G1型ND1基因序列完全相同。结论 表明内蒙古上述两地区细粒棘球蚴的同源性很高,且基因型均为G1型,这为内蒙古某些地区细粒棘球蚴流行虫株的确定提供了重要依据,同时也对当地细粒棘球蚴病的预防和控制具有重要意义。     

中国大陆三个地区日本血吸虫基因组DNA的RFLP的初步研究

本文用三种限制性内切酶(HaeⅢ,EocRⅠ,HindⅢ)分析了中国大陆的四川西昌、安徽贵池和湖南君山三个地区的日本血吸虫基因组DNA的限制性片段长度差异(RFLP)。构建了三个地区日本血吸虫两种内切酶的RFLP的图谱。HaeⅢ和EcoRⅠ内切后经电泳检出四川地区日本血吸虫与湖南、安徽两地的日本血吸虫DNA重复序列的差异。其中HaeⅢ酶切图谱中有差异的片段为20.0kb、6.5kb、5.3kb、4.3kb和0.6kb;EcoRⅠ的图谱中为3.3kb、1.2kb和0.9kb。本实验结果从DNA分子水平为中国大陆日本血吸虫地域株分类问题提供了依据。     

微卫星锚定PCR研究日本血吸虫的遗传变异

目的　对中国不同自然隔离群的日本血吸虫进行遗传变异研究 ,并为中国日本血吸虫地域品系的划分提供依据。方法　采用微卫星锚定PCR(SSR -PCR)技术对中国 7省 10地日本血吸虫标本基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物 ,计算遗传距离 ,并构建系统进化树。结果　各地域标本PCR扩增产物均呈多态性 ,其中中国大陆与中国台湾日本血吸虫之间的遗传距离为 0 316± 0 0 6 7(0 176～ 0 378) ;中国大陆日本血吸虫山区型之间的遗传距离为 0 0 6 7;湖区型之间的遗传距离为 0 0 6 3～ 0 176 ;山区型与湖区型之间的遗传距离为 0 0 6 7～ 0 2 5 0 ;湖北省境内 4个地域的日本血吸虫 ,其遗传距离为0 0 6 3～ 0 111。结论　根据我们所采集的日本血吸虫标本和SSR -PCR的实验结果 ,认为中国大陆日本血吸虫在基因分类水平上至少可分为不同层次的 5类 :①云南洱源、四川天全为一类 ;②安徽贵池、湖南岳阳为一类 ;③湖北武汉、湖北钟祥为一类 ;④江西新建、湖北阳新为一类 ;⑤湖北松滋单独为一类。其中①与②③④⑤在总体上可分为两大类 ,②③④⑤又可再分为②③与④⑤两类 ,②③与④⑤还可再各分为两类 ,此外 ,中国台湾日本血吸虫单独列为一类。     

中国大陆日本血吸虫随机扩增多态DNA(RAPD)的初步研究

目的对中国大陆浙江、安徽、江西、湖北、湖南、四川、云南7省日本血吸虫种群进行遗传变异研究。方法应用随机扩增多态DNA（RAPD）技术，对5条寡核苷酸随机引物扩增。结果获得32条DNA片断，17个基因位点，长度在100bp～2600bp之间。各种群多态百分率（P）为52．9～70．6，平均杂合性（H）为0．269～0．363。中国大陆湖区日本血吸虫各种群间遗传距离（D）为0．000～0．023．山区种群间为0．155，湖区种群与山区种群间遗传距离为0．036～0．139。同时，P235-930bp，P293－910bP分别为四川种群和云南种群特异性DNA片断，P256－720bp为日本血吸虫雌虫特异性DNA片断。对中国大陆日本血吸虫虫株复合性和系统发生作简要讨论。     

照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库

目的从日本血吸虫尾蚴cDNA文库中获得日本血吸虫新的蛋白编码基因,为防治血吸虫病提供候选疫苗和治疗药物靶点.方法制备致弱尾蚴免疫兔血清作为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,挑取阳性克隆,测序并进行生物信息学分析.结果共筛选出8个阳性克隆,长度分布于0.6～3.0kb.随机选取4个阳性克隆进行PCR扩增及测序,获得2个日本血吸虫新基因:整合酶相似蛋白编码基因和蛋白磷酸酶1催化亚单位编码基因.前者长度为636 bp,含一个462 bp完整开放阅读框(ORF);后者1 879 bp,含一个984 bp完整ORF.两者GenBank的登录号分别为:AY855919、AY879341.结论致弱尾蚴免疫兔血清可作为筛选日本血吸虫新基因的有效探针;发现了2个日本血吸虫新基因.     

中国不同种拟钉螺CO1基因序列差异分析及其系统学初探

目的研究中国拟钉螺线粒体CO1基因的差异并初步探讨其系统发生。方法收集4省7地拟钉螺标本,抽提基因组DNA,PCR扩增线粒体CO1基因,扩增产物纯化后进行序列测定,所测序列用Kimura双参数法计算遗传距离,NJ和UPGMA法构建系统进化树。结果PCR扩增得到大小约700bp的片段。遗传距离显示:台湾邱氏拟钉螺与湖北钉螺滇川亚种亲缘关系最近距离为0.124,而与其余6种拟钉螺遗传距离较远,遂将其分为两组。6种拟钉螺组内距离为0.127,两组间距离为0.179。两种方法构建进化树拓扑结构基本一致。台湾邱氏拟钉螺与湖北钉螺滇川亚种聚为一支,其余6种拟钉螺位于另一支。结论台湾邱氏拟钉螺应归入湖北钉螺,钉螺与拟钉螺属单源进化。中国不同种拟钉螺CO1基因存在差异。     

Bioinformatics analysis of CO I gene of Simulium quinquestriatum

The genomic DNA was extracted from Simulium quinquestriatum (Sq) and its CO I gene was amplified by PCR. The PCR product was purified and cloned into plasmid pMD18-T vector. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli DH5alpha and then identified by digestion with restriction enzyme and PCR amplification. The amplified fractions (1 621 bp) included complete CO I gene (1 542 bp, GenBank accession number: DQ534949), 5' tRNA-Tyr and 3' tRNA-Leu partial fraction. The CO I gene sequence had a high identity (99%) with that of S. quinquestriatum (GenBank accession number: AY251520). Bioinformatics analysis showed that the Sq-CO I open reading frame encoded a 513-amino acid protein with M(r) 5565, pI5.84. Structural prediction showed this protein possessed a conservative domain of CO I gene.     

日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建

目的 构建日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。 方法 用Trizol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA，分离纯化mRNA，经随机引物反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头，再用EcoRⅠ和HindⅢ消化，使其成为两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。收集300 bp以上的双链cDNA片段，与T7Select 10-3b载体连接，经体外包装后，以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。通过滴度测定及PCR技术鉴定文库质量，用7种特异性引物以PCR法从文库中钓取目的基因以检测文库的代表性。 结果 原始文库的库容量为4.98×10⁶ pfu，扩增后文库滴度为3.85×10¹¹ pfu/ml。对随机挑取的96个噬菌斑进行PCR鉴定，重组率为93.8%，其中95.6%的插入片段大于300 bp。7种特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。 结论 构建了日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。     

A new subtype of 3′ region of cagA gene in Helicobacter pyloristrains isolated from Zhejiang Province in China

AIM: To isolate the subtypes of 3′ region of cagA gene in Helicobacter pylori (H pylon) strains from Zhejiang Province in China and to investigate their relations to H pylori-associated gastroduodenal diseases. METHODS: One hundred and thirty-seven H pylori clinical strains were isolated from the gastric mucosa specimens of 74 patients with chronic gastritis, 61 with peptic ulceration, and 2 with gastric cancer. Bacterial genomic DNA was extracted and 3′ region of cagA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Subtypes of 3′ region of cagA gene were determined by the size of PCR amplified segments. The sequences of the subtypes were analyzed by PCR-based sequencing. RESULTS: Of the 137 H pyloriisolates from Zhejiang Province, 132 (96.4%) yielded PCR products that could be classified into three groups of subtypes, named as subtypes Ⅰ, Ⅱ, and Ⅲ according to their sizes. The sizes of subtypes Ⅰ, Ⅱ, and Ⅲ were 648-650bp, 705-707bp, and 815bp, respectively. Among the 132 cagA-positive H pylori strains, 123(93.2%) belonged to the group of subtype Ⅰ, 6 (4.5%) presented subtype Ⅱ, 1(0.8%) was subtype Ⅲ, and 2(1.5%) presented subtypes Ⅰ and Ⅲ both. The primary structure of subtype Ⅰ was composed of 3 repeats of R1, 1 repeat of R2 and 1 repeat of R3. Subtype Ⅱ possessing 4 repeats of R1, 2 repeats of R2 and 1 repeat of R3 was a newly found type of 3′ region of cagA gene which had not been reported before. The primary structure of subtype Ⅲ consisted of 4 repeats of R1, Ⅰ repeat of R2 and 2 repeats of R3. Comparison of the sequences of subtype Ⅰ strains with the corresponding sequences deposited in GenBank, showed a similarity of 95.0% (94.0-96.1%) for nucleotide sequences and 95.9% (94.9-97.4%) for deduced amino acid sequences. Comparison of the sequences of subtype Ⅲ strains with the corresponding sequences deposited in GenBank, showed a similarity of 93.9% (90.8-96.9%) for nucleotide sequences and 93.2% (90.2-96.2%) for deduced amino acid sequences. Among subtype Ⅱ strains, the nucleotide and deduced amino acid sequences showed a similarity of 95.2% (94.1-96.5%) and 96.4% (93.8-97.9%),respectively. There were no statistical differences in the distribution of subtypes of 3′ region of cagA gene among different H pylori-associated gastroduodenal diseases (x^2=11.544, P>0.05). CONCLUSION: There are three subtypes (Ⅰ,Ⅱ, and Ⅲ) of 3′ region of cagA gene in Hpylori strains isolated from Zhejiang Province, and subtype Ⅰ is predominant. Subtype Ⅱ is a newly found subtype of 3′ region of cagA gene. The result of this study does not support the view that the subtypes of 3′ region of cagA gene in H pylori isolated from Zhejiang Province are correlated with the clinical outcomes of H pylori infection.