RNA干扰在抗HCV、HBV方面的研究进展

HCV、HBV感染引起的慢性肝炎、肝硬化、肝癌已成为全世界关注的健康问题。而防治这些严重肝病的关键仍是抗病毒治疗。RNA干扰自发现以来，已在病毒、肿瘤及功能基因组学等研究方面显示出良好的应用前景。本文就RNA干扰在抗HCV、HBV方面的研究进展作一综述。     

RNA干扰在抗HCV、HBV方面的研究进展

HCV、HBV感染引起的慢性肝炎、肝硬化、肝癌已成为全世界关注的健康问题.而防治这些严重肝病的关键仍是抗病毒治疗.RNA干扰自发现以来,已在病毒、肿瘤及功能基因组学等研究方面显示出良好的应用前景.本文就RNA干扰在抗HCV、HBV方面的研究进展作一综述.     

丁型肝炎病毒基因组和抗原研究进展

丁型肝炎病毒(HDV)属于缺陷性RNA病毒。HDV RNA是由单链基因组RNA和互补的反基因组RNA组成的闭合环状分子,具有酶活性,能自身催化断裂,进行滚环式复制。反基因组上的可读框编码大小两种抗原。HDV的装配需要乙型肝炎病毒(HBV)的帮助,其包膜是HBV表面抗原。HDV感染者可同时有HBV感染,这种双重感染可加重肝脏损害和病情。     

丙型肝炎病毒核心抗原在静脉吸毒者血清中的检测

目的 调查丙型肝炎病毒核心抗原（HCVcAg）在静脉吸毒者血清中的检出状况。方法 对93例静脉吸毒者血清同时进行HCVcAg、HCV RNA定量、抗HCV IgG、HBsAg检测,分析HCVcAg检出率与HCV RNA定量及合并HBV感染之间的关系。结果 在93例静脉吸毒者中,抗HCV IgG阳性79例,HCV RNA阳性68例,HCVcAg阳性37例。以HCV RNA作比较,HCVcAg检测的特异性和敏感性分别是100％和54％;HCVcAg检出率与HCV RNA载量对数值呈正相关,r=0.958,P=0.010;HCV RNA阳性静脉吸毒者中,HBsAg阳性和HBsAg阴性时HCVcAg的检出率分别为38％和69％,两者比较P＜0.01;2例抗HCV IgG阴性、HCV RNA阳性静脉吸毒者,HCVcAg检测呈阳性。结论 HCVcAg在静脉吸毒者血清中检测其特异性好,而敏感性较差;HCVcAg的检出率与HCV RNA载量的对数呈正相关;在静脉吸毒者,合并HBV感染可能是血清HCVcAg检测的干扰因素,可能是HBV抑制了HCVcAg的表达。     

HBV、HCV合并感染患者血清抗丙肝抗体分片段与HCVRNA测定的意义

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）合并感染患者与单HCV感染者血清抗HCV抗体分片段阳性率以及HCV RNA阳性率是否有显著性差异以及检测意义。方法 对76例同时感染HBV和HCV患者进行抗HCV抗体分片段以及HCV RNA检测,同时从同期仅感染HCV患者中随机抽取163例作为对照组进行以上检测。结果 HBV、HCV合并感染患者与单HCV感染者比较：抗HCV抗体分片段相同片段间比较差异无统计学意义,但其S/CO值比较差异有统计学意义（P〈0.01）;相同片段组合间除抗-C＋抗-NS3组合阳性率HBV、HCV合并感染患者比仅HCV感染患者显著要低（P〈0.05）外,其余各组合间比较差异无统计学意义（P〉0.05）;HBV、HCV合并感染患者HCV RNA阳性率比仅HCV感染患者低（P〈0.01或P〈0.05）。结论 HBV、HCV合并感染时HBV对HCV复制存在抑制作用,从而导致HCV RNA含量显著降低,合并感染与单独感染间抗HCV抗体分片段无显著性差异,但由于HCV复制受到抑制从而导致抗HCV抗体分片段含量降低,这对研究HBV、HCV合并感染时患者体内HBV对HCV间的抑制作用有一定意义。     

RNA干扰抗乙型肝炎病毒的现状和应用前景

RNA干扰(RNA interference,RNA i)是指细胞利用外源性或者内源性的双链小干扰RNA(sm all interfer-ing RNA,siRNA)激发相关的酶复合物对同源性mRNA进行切割、降解,从而在转录后水平阻断基因的表达,达到同源基因的减效表达或不表达。国内外细胞实验和动物实验均表明,在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)治疗中,RNA i由于具备特异、高效、无明显副作用等许多特点,较目前常用的干扰素和核苷类药物具有许多优势,在抗HBV治疗研究中展示了良好的应用前景。     

利用RNA干扰技术干扰HBeAg表达的研究

构建针对乙肝病毒HBeAg前c/c区(HBV prec/c)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(psiHBV),观察其在体内外对HBV复制的抑制作用。构建RNA干扰真核表达载体psiHBV,与1.5倍HBV真核表达质粒pHBV1.5共转染HeLa细胞,用微粒子化学发光分析仪(MEIA)分别检测细胞上清和细胞裂解液中HBeAg表达水平;用半定量PCR检测prec/cmRNA的转录情况。随后用水动力学方法,向小鼠尾静脉注射pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型。采用此感染模型,将pHBV1.5与在体外实验筛选到有明显抑制作用的shRNA表达载体(psiHBV4)共注射,注射后第6天用同样方法检测其干扰效果。结果显示,成功构建了针对HBV前c/c区的shRNA表达载体psiHBV4、psiHBV5、psiHBV6及无关shRNA表达载体psiC,筛选到在体外对HBeAg有明显的抑制作用的psiHBV4载体;注射pHBV1.5的动物血清高表达HBsAg和HBeAg。而共注射干扰性psiHBV4明显抑制了HBeAg的表达,与单纯感染组相比有显著差异,RT-PCR显示肝内HBV C mRNA水平亦明显降低。上述结果表明,siRNA能特异抑制HBV的复制和表达,对乙型肝炎的治疗有潜在应用前景。     

广州地区HBV/HCV重叠感染患者流行及临床特征研究

目的 探讨广州地区乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒（HBV/HCV）重叠感染患者的流行及临床特征,为提高其诊治提供依据.方法 回顾2005年4月至2011年10月我院收治慢性HBV感染患者临床资料,分析HBV/HCV重叠感染患者流行特征,按照HBeAg状态以及HBV DNA、HCV RNA水平分组分析HBV/HCV重叠感染患者临床特征.结果 HBV/HCV重叠感染率为1.9％（128/6604）,主要见于伴静脉吸毒史的男性中年患者.HBeAg阳性与阴性重叠感染患者之间的生化指标和终末期肝病发生率均无差异.HBeAg阳性患者HBV DNA阳性率高于阴性患者（P ＜0.001）,而HCV RNA水平阳性率低于阴性患者（P =0.007）.HBV DNA阳性患者终末期肝病发生率较阴性组升高（58.1％比37.9％,P=0.027）,而HCV RNA阳性与阴性患者之间发生率相似（43.6％比49.2％,P=0.540）.结论 广州地区HBV/HCV重叠感染率较低,HBV DNA水平可能与患者的疾病进展相关.     

慢性乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV DNA含量与庚型肝炎病毒感染的关系

目的：观察慢性乙型肝炎（CH－B）患者血清、肝组织中HBV DNA含量与庚型肝炎病毒（HGV）感染的关系，探讨HGV感染对CH－B患者乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）、免疫组织化学法、荧光定量PCR（FQ－PCR）技术方法对56份CH－B患者血清HGV RNA、肝组织HGV Ag、血清及肝组织中HBV DNA含量分别进行了检测，并将血清HGV RNA与肝组织HGV Ag的表达、HGV RNA、HGV Ag阳性与阴性患者HBV DNA含量分别进行了对比研究。结果：血清HGV RNA、肝组织HGV Ag阳性分别为10份（17．9％）、8份（14．3％）。血清HGV RNA阳性与肝组织HGV Ag表达显著相关（P＜0．01），但部分肝组织HGV Ag阴性患者亦有血清HGV RNA表达。血清HGV RNA、肝组织HGV Ag阳性与阴性患者血清及肝组织中HBV DNA含量差异无显著性（P＞0．05）。结论：HGV感染对CH－B患者HBV复制无影响。HGV可在肝脏中复制，但致病性可能较微弱。     

HBV感染者外周血白细胞中HBVcccDNA检测的临床价值

在HBV感染的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒DNA——共价闭合环状DNA（HBVcccDNA），不与蛋白共价结合，是乙肝病毒基因组的复制中间体，是病毒mRNA和前基因组RNA转录的模板，它的存在是病毒复制的一个重要指标，也是评价HBV感染状态及药物疗效最重要的指标，但取材困难。文献报道，乙肝患者外周血单个核细胞（PB-MC）中存在HBV—DNA及乙肝病毒复制中间产物RNA，但感染PBMC的HBV是否可在其内进行复制尚有争议。外周血单个核细胞中是否存在HBVcccDNA亦存在争议，临床价值并不确定。我们对105例HBV感染者进行了外周血白细胞HBVcccDNA的检测，现将结果报告如下。     

Suppression of bovine ephemeral fever virus by RNA interference

RNA interference (RNAi) was used to suppress bovine ephemeral fever virus (BEFV). Plasmids expressing continuously shRNAs were used against G gene of BEFV to induce RNA interference in cultured cells. A GFP reporter assay was established to determine the efficiency and specificity of siRNA and the potential of BEFV to hamper RNAi. Two of five small interfering RNAs (siRNAs) were shown to suppress BEFV. Suppression of the G gene of BEFV corresponded with reduction of viral plaques and progeny titer. The results suggest that RNAi has the potential for use in suppression of BEFV infection with possible therapeutic implications.     

附睾血管内皮生长因子基因慢病毒干扰载体的构建

目的：以血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA 为靶点,设计、构建VEGF 的RNA干扰慢病毒载体,并 对其在大鼠附睾的沉默效果进行验证。 方法：构建3 种附睾VEGF-shRNA 慢病毒表达载体VEGF-shRNA-1、 VEGF-shRNA-2、VEGF-shRNA-3, 提取3 种阳性克隆质粒测序, 转染HEK293-T 细胞后产生慢病毒质粒。大鼠随 机分为空白对照组、NC-shRNA 阴性感染组、VEGF-shRNA-1 感染组、VEGF-shRNA-2 感染组、VEGF-shRNA-3 感染组,将病毒液分别注射到各组大鼠双侧附睾;实时荧光定量 PCR及蛋白免疫印迹检测各组大鼠附睾VEGF 的mRNA 及蛋白沉默效果。结果： 测序结果证明3 种慢病毒载体被包装成功。感染大鼠附睾后,VEGF 感染组 mRNA 及蛋白表达量均较阴性感染组和空白对照组明显降低,其中以VEGF-shRNA-3 感染组干扰效果更为有效。 结论：成功设计了VEGF 基因的RNA干扰靶点和制备了VEGF 基因的慢病毒载体,VEGF-shRNA-3 能有效抑制 附睾VEGF 的表达。     

小干扰RNA与壳聚糖复合纳米粒制备及基因沉默性能研究

小干扰RNA引发的RNA干扰过程在沉默靶基因表达方面表现出高特异性和高效性,有望成为癌症和流感、肝炎等病毒感染疾病治疗的有效药物,但缺少安全高效的载体系统是其发挥强大功能的主要障碍。本研究以天然阳离子壳聚糖为载体材料,利用聚电解质静电作用,直接复合沉默绿色荧光蛋白的siRNA(siRNA-eGFP),制备出siRNA复合率83%~94%、尺寸90~180 nm、Zeta电位10~30 mV的稳定纳米粒,细胞活性保持率达80%,绿色荧光蛋白基因沉默效率近80%。     

RNAi Therapy for HIV Infection

Inside eukaryotic cells, small RNA duplexes, called small interfering RNAs (siRNAs), activate a conserved RNA interference (RNAi) pathway which leads to specific degradation of complementary target mRNAs through base-pairing recognition. As with other viruses, studies have shown that replication of the HIV-1 in cultured cells can be targeted and inhibited by synthetic siRNAs. The relative ease of siRNA design and the versatility of RNAi to target a broad spectrum of mRNAs have led to the promise that drug discovery in the RNAi pathway could be effective against pathogens. This review discusses the current experimental principles that guide the application of RNAi against HIV and describes challenges and limitations that need to be surmounted in order for siRNAs to become practical antiviral drugs. The practical use of RNAi therapy for HIV infection will depend on overcoming several challenges, including the ability to establish long-term expression of siRNA without off-target effects and the capacity to counteract mutant escape viruses.     

线虫基因组功能的高通量研究

线虫是研究细胞生物学的一个理想模型,RNA i现象也是最早在线虫中发现的。由于RNA i技术不仅具有高度特异性靶定基因的特点,而且简便、易于操作,从而成为研究基因组功能的高通量方法。很多研究小组已经使用大规模RNA i系统地研究线虫各个基因的功能缺失表型。线虫独特的RNA i方法和以此为基础的基因组大规模分析有利于对线虫的各种生物学过程产生新的认识。     

腺病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2的下调及生长抑制效应

目的:探讨采用腺病毒做为载体介导基于RNA干涉的针对高HER2肿瘤的基因治疗的可能性。方法:构建HER2-绿色荧光蛋白融合蛋白表达质粒pHER2-GFP,并与9种针对HER2不同靶序列的siRNA表达质粒分别共转染CHO-K1细胞,根据荧光蛋白表达量从中筛选出沉默效率最高的质粒。将筛选出的质粒转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞,检测它们对HER2表达的影响。随后,将siRNA转录单元克隆入腺病毒载体,成功包装病毒后感染SKBR3细胞,再次测定其下调HER2的效应及其对细胞生长的影响。结果:2种有效下调HER2表达的质粒被筛选出来。将此2种质粒所含siRNA转录单元包装入腺病毒后仍然保持了原有的基因沉默效应。HER2下调增加了SKBR3细胞中G1期细胞的比例,并且诱导部分细胞凋亡。MTT和细胞长期增殖抑制实验表明腺病毒介导的RNA干涉抑制了SKBR3细胞生长。结论:重组腺病毒介导的RNA干涉能够下调HER2的表达并且对高表达HER2的乳腺癌细胞有生长抑制作用。     

Development of RNA interference (RNAi) as potential antiviral strategy against enterovirus 70

Enterovirus 70 (EV70) is recognized as the main causative agent of acute hemorrhagic conjunctivitis (AHC), a highly contagious viral infection of the eye. Currently, there is no available treatment for EV70 infections. In this study, we developed a potential intervention strategy using RNA interference (RNAi) against EV70 infection in an in vitro system. Two synthetic 19-mer siRNAs, si-3D1 and si-3D2, were designed to target the 3Dpol region of the EV70 genome. Significant dosage dependent inhibition of EV70 in rhabdomyosarcoma cell line, as shown by reduction of viral RNA and VP1 production, was observed. Both siRNAs prevented EV70 replication in RD cells when transfected into these cells 48 hr prior to virus infection. Introduction of these siRNAs into RD cells 1-3 hr after infection with EV70 reduced production of viral RNA by approximately 60%. Thus, RNAi is a promising strategy to prevent EV70 infections and may have therapeutic potential.     

RNA干涉技术在功能基因组学和医学研究中的应用

RNA干涉 (RNAi)能特异性降解 m RNA,在转录后水平抑制基因活动 ,作为新的技术平台将对功能基因组学研究和疾病的防治产生重要影响。RNAi能特异地“剔出”靶基因的表达及功能 ,可广泛地运用于基因功能的分析。 RNAi是动植物在抗御病毒、转座子等外来基因侵袭或内源性基因变异的进化过程中发展起来的 ,利用这种内在的防御机制可望发展成为征服感染、肿瘤等疾病的有效的手段。