转B7—1基因的人多发性骨髓细胞XG—7在激发杀肿瘤细胞CTL？…

为调查Ｂ７－１分子在人多发性骨髓瘤细胞的表达是否可诱导出具有抗肿瘤作用的ＣＤ＾＋８的ＣＴＬ，我们用含Ｂ７－１基因逆转录病毒载体ＰＴＧ５１９２的包装细胞２９３Ｅ培养上清，感染人多发性骨髓瘤细胞系ＸＧ－７（不表达Ｂ７－１分子）用新霉素Ｇ４１８选择并经流式细胞仪筛选，获得了稳定高表达式Ｂ７－１分子的ＸＧ－７细胞（命名为ＸＧ－７－Ｂ７细胞）在体外增殖实验中，ＸＧ－７－Ｂ７细胞显示出比母系细胞ＸＧ－７对外周     

携带B7-1基因的Hep-2细胞瘤苗诱导CIK细胞特异性抗肿瘤作用

目的探讨以转染B7-1基因的喉癌细胞Hep-2瘤苗刺激CIK细胞能否激活其特异性抗肿瘤杀伤活性。方法将以携带B7-1基因的重组腺病毒载体转染Hep-2细胞的瘤苗与CIK细胞共培养,检测CIK细胞的增殖率、表型改变、细胞毒活性。结果经21天培养后,对照组和转染组增殖倍数分别约为2216倍和5246倍,差异有非常显著意义(P<0.01);未转染组约为2299倍,与对照组相比差异无显著意义(P>0.05)。转染组CD3 CD56 细胞和CD3 CD8 细胞的百分含量明显高于对照组(P<0.01),而未转染组与对照组细胞表型改变无显著差异(P>0.05)。细胞毒杀伤实验中,在效靶比为40:1条件下,以Hep-2细胞为靶细胞时,转染组杀伤活性明显高于对照组(P<0.01),未转染组与对照组无显著差异(P>0.05),以K562细胞为靶细胞时,三组CIK细胞的毒性作用无明显差异(P>0.05)。结论转染B7-1的Hep-2细胞瘤苗与CIK细胞共培养,可提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。     

急性白血病细胞B7-1及MHC分子的表达

目的：探讨共刺激分子B7-1(CD80)及MHC分子在急性白血病(acute leukemia，AL)中的表达，方法：应用一组mAb，采用免疫荧光法对AL52例瘤细胞及34例正常人骨髓单个核细胞（BMMC)表面B7-1及主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子的表达进行了检测．结果：所有患瘤细胞及正常人BMMC上MHCI类分子表达强阳性，MHCⅡ类分子表达920k，阳性，而B7-1表达差异较大，急性单核细胞白血病(M5)表达阳性率最高(8／11)，而急性粒细胞白血病(M1，M2，M3)均无表达．结论：B7-1缺陷是白血病细胞逃避宿主免疫监视的重要原因，转染B7-1基因的瘤苗可能是免疫基因治疗的有效途径。     

人B7-1转基因肝癌瘤苗的制备

目的:制备人B7-1(hB7-1)转基因肝癌瘤苗.方法:用逆转录病毒转移系统将hB7-1基因导入人肝癌细胞株HepG2,并用RT-PCR、PCR-Southern杂交法检测转染空载体 pLXSN的HepG2/neo细胞和转染重组质粒pLXSN/hB7-1的HepG2/hB7-l细胞中hB7-1 mRNA表达;间接免疫荧光法检测HepG2细胞、HepG2/neo细胞、HepG2/hB7-1细胞形态,计算当日细胞绝对数,绘制生长曲线.结果:所建立的肝癌瘤苗(HepG2/hB7-1)细胞可高效表达hB7-1分子.基因转染对HepG2细胞的生长形态及生长曲线无明显影响.结论:逆转录病毒基因转移系统是使肝癌细胞高效表达hB7-1分子的有效途径.     

共刺激分子B7-1与汉坦病毒核蛋白基因共表达载体的构建及免疫调节作用

目的:探讨共刺激分子B7-1(CD80)对汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫调节作用.方法:构建双启动子共表达B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的真核表达载体pcDNA 3.1-B7-S,酶切鉴定后直接肌注免疫BALB/c小鼠,同时设对照组pcDNA 3.1 空质粒接种组、pcDNA 3.1-S接种组.ELISA法检测血清特异性抗体,MTT法检测T细胞增殖反应.结果:pcDNA 3.1-B7-S接种组鼠在抗体的产生水平及淋巴细胞增殖指数上均较pcDNA 3.1-S接种组明显增高.结论:接种B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的共表达质粒优于注射单目的抗原基因表达质粒,为探索增强基因疫苗的免疫作用提供了新的途径.     

PD153035对人多发性骨髓瘤细胞XG-1的诱导凋亡作用及机制

目的研究表皮生长因子受体(EGFR)在多发性骨髓瘤细胞增殖与生存中的作用及机制.方法采用EGFR抑制剂PD153035对多发性骨髓瘤细胞XG-1上的EGFR进行阻断.采用3H掺入法、MTT法和Annexin V染色检测细胞的增殖与凋亡情况,同时采用Western blot方法分析PD153035对STAT3磷酸化的影响.结果 PD153035可以使XG-1细胞增殖能力下降,并诱导XG-1细胞凋亡.而且PD153035还可以阻断HB-EGF诱导的STAT3的磷酸化,但对IL-6诱导的STAT3的磷酸化无阻断作用.结论 PD153035可以通过特异性阻断STAT3分子磷酸化,切断EGFR活化的转导通路,导致骨髓瘤细胞的增殖能力下降,并诱导其凋亡.     

重组人BAFF对多发性骨髓瘤细胞BAFF-R表达调控的初步研究

目的 :研究多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)中重组人B淋巴细胞刺激因子(recombinant human B lymphocyte stimulator,rh BAFF)对其特异性受体(B lymphocyte stimulator receptor,BAFF-R)基因、蛋白水平表达的影响;并进一步研究重组人BAFF与JNK信号通路之间的作用与BAFF-R之间的关系。方法:应用RT-PCR、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、细胞免疫荧光技术检测BAFF-R在MM细胞KM3中的表达、功能及调节;Western Blot分析BAFF/BAFF-R对NF-κB信号通路的激活情况。结果:细胞免疫荧光结果显示BAFF-R定位在KM3细胞的细胞膜上;重组人BAFF(50 ng/m L)能够促进BAFF-R m RNA和蛋白的表达;可溶性BAFF(50 ng/m L)促进p-JNK表达的上调,且随作用时间的延长而增加。结论 :重组人BAFF对BAFF-R表达有重要的影响,JNK信号通路可能参与了MM的发生发展过程。     

重组腺病毒介导的人野生型p53,GM-CSF和B7-1基因在胰腺癌细胞中的表达

目的: 以复制缺陷型重组腺病毒为载体,使用人野生型p53基因、人GM-CSF基因和B7-1基因为目的基因,探讨三基因在胰腺癌细胞BxPC-3中的表达.方法: 免疫组织化学方法检测外源性p53蛋白在BxPC-3细胞中表达.ELISA方法测定GM-CSF表达量;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测BxPC-3细胞转染B7-1的表达效果.结果: 重组腺病毒介导的p53基因、GM-CSF基因、B7-1基因在BxPC-3细胞中得到高效表达.结论: 重组腺病毒介导的外源基因在BxPC-3细胞中得到高效的表达,为进一步探讨其体内外治疗胰腺癌的实验研究提供了理论基础.     

过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞共刺激分子B7-1、B7-2与CD28的表达及意义

目的 探讨免疫共刺激分子B7-1、B7-2和CD28在过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞（PBMc）中的表达及其意义。方法 应用流式细胞仪（FCM）从蛋白质水平检测了38例过敏性紫癜（HSP）患儿（其中11例诊断为紫癜性肾炎）和20例正常儿童PBMC中B7-1、B7-2和CD28的表达，并分析其与24h尿微量白蛋白的关系。结果 过敏性紫癜患儿B7-2蛋白和CD28蛋白的表达水平（相对平均荧光强度，RMFI）均高于正常对照组（P〈0．05），各组间B7-1蛋白表达水平的差别无显著性意义（P〉O．05）。18例24h尿微量白蛋白（24hUMA）增高的HSP患儿共刺激分子B7-2、CD28蛋白的表达与24hUMA呈等级正相关。结论 过敏性紫癜患儿PBMC共刺激分子B7-2、CD28表达异常增加，可能参与HSP的起病，而且B7～2、CD28蛋白的表达与24h尿微量白蛋白呈等级正相关，提示可以作为监测HSP患儿病情以及检测早期肾脏损害的免疫学指标。     

γ射线诱导人肝癌细胞表达B7—1共刺激分子的研究

目的 研究电离辐射与肿瘤细胞Ｂ７－１分子表达之间的关系，探讨肿瘤细胞辐粕免疫原性增强的机制。方法 采用间接免疫荧光－流式细胞仪分析技术，研究在用不同剂量γ射线照射ＳＳＭ－７７２肝癌细胞后，培养不同时间内ＳＭＭＣ－７７２细胞Ｂ７－共刺激分子的表达水平。并用＾３Ｈ－ＴｄＲ释放法测定照向射肿瘤细胞与人反应后的细胞知性。结果 未燠才经１０、２０、３０Ｇｙ照射的人肝癌细胞不表达Ｂ７－１分子经４０、５０、６０     

用射线照射的B7-1转基因细胞进行肿瘤疫苗的研究

目的探讨用放射的B71转基因细胞进行肿瘤疫苗疗法的效果。方法将重组人B7-1基因真核表达载体导入CAK-1肾细胞瘤细胞,利用转基因细胞治疗观察其抗肿瘤效果。结果转基因细胞的肿瘤原性较CAK-1／Wt、CAK-1／pCDNA3组明显降低（P〈0．001）。同时免疫原性明显增强,以^60Co照射的CAK-1／B7-1细胞免疫后,小鼠体内诱发了抗CAK-1／Wt的系统性、保护性免疫。用^60Co灭活的转基因细胞作为瘤苗进行实验性治疗,能够延长小鼠的生存时间,减慢肿瘤的生长速度,CAK-1／H7-1的应用提高了肿瘤治疗效果（P〈0．01）。结论放射的转基因细胞及其表达的H7细胞因子可以有效地激发机体的抗肿瘤免疫应答,B71表达肿瘤细胞应用可以成为一种很有前景的肿瘤疫苗。     

B7-1基因转染对小鼠前胃癌细胞增殖活性的影响

目的 观察B7—1基因转染对小鼠前胃癌细胞(MFC)增殖活性的影响。方法 通过脂质体介导将B7—1基因转染MFC细胞，G418筛选阳性克隆后，用MTT法和流式细胞仪(FCM)分别测定转染然细胞增殖活性的变化，并以空载体pcDNA3转染MFC细胞作为对照。结果 转染B7—1基因的MFC细胞增殖活性受到抑制。结论 转染B7—1基因的MFC细胞增殖活性受到抑制，提示B7—1基因对MFC有免疫调节作用。     

小鼠B7-1和B7-2基因转染EL4细胞瘤苗抗肿瘤免疫作用的比较研究

目的：研究冠状动脉分流（CABG）术后冠状动脉竞争血流对左乳房内动脉（LIMA）桥血流中内皮素（ET）、一氧化氮（NO）含量的影响，探讨动脉桥血管早期衰坏的分子机制。方法：建立猪CABG术后桥血管竞争血流动物模型，利用血流闭塞器造成冠状动脉不同程度狭窄，测量桥血管血流量及方向变化，并采用放射免疫分析法及硝酸还原酶法分别检测LIMA桥血流中ET、NO含量并进行对比分析。结果：冠状动脉左前降支（LAD）近端狭窄程度越轻，LIMA桥血流量越少；LAD近端未完全闭塞时，LIMA桥均出现双向血流。CABG术后LIMA桥血流ET含量明显高于移植前(P＜0.05)，NO含量明显低于移植前(P＜0.05)。LAD近端冠脉竞争血流越大，LIMA桥血流NO含量越低。LIMA桥血流NO含量与LIMA桥血流量呈正相关（r=0.957,P＜0.05）。LAD近端30％狭窄时，NO含量明显低于LAD近端90％狭窄及全部闭塞时(P＜0.05)，LAD近端50％狭窄时，NO含量明显低于LAD近端全部闭塞时(P＜0.05)。LIMA桥血流ET含量有随LAD近端冠脉竞争血流增加而升高的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：来自未完全闭塞冠状动脉的竞争血流可引起LIMA桥血流量下降，产生双向血流，并导致桥血流中NO含量显著下降。     

狼疮性肾炎外周血单个核细胞B7-1和B7-2 mRNA表达异常及其与疾病活动的关系

目的观察活动期和静止期狼疮肾炎(LN)外周血单个核细胞(PBMC)B7-1(CD80)和B7-2(CD86)mRNA表达及其与疾病活动的关系,以探讨B7-1和B7-2mRNA表达异常在LN自身免疫发生中的作用及临床意义.方法以正常人为对照,分离15例活动期和13例静止期的LN患者PBMC,采用半定量反转录PCR的方法,检测PB-MC的B7-1和B7-2mRNA表达.B7-1和B7-2mRNA表达与SLE疾病活动评分指数(SLEDAI)的相关关系用直线相关分析.结果静止期LN组B7-1和B7-2mRNA表达与正常人对照组相比无显著性差异(P＞0.05),活动期LN组B7-1mRNA有明显的上升(P＜0.05),B7-2mRNA表达增高更加显著(P＜0.01).B7-2mRNA的增高与SLEDAI呈直线正相关关系(r＝0.8641,P＜0.05).结论活动期狼疮性肾炎存在着B7mRNA表达的异常,B7-2mRNA的增高与SLEDAI呈直线正相关关系.     

X射线对小鼠腹腔巨噬细胞表达B7-1和B7-2的影响

目的 :观察 X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 1和 B7- 2的影响。方法 :采用免疫组织化学法 ( ABC法 )。结果 :小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 2达到高峰的时间早于 B7- 1,而且 B7- 2表达幅度也高于 B7- 1。剂量 -效应关系的研究表明 ,B7- 1和 B7- 2的表达均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时也出现一个峰值。但在不同分度分析结果中发现 ,低剂量 X射线照射组的高密度细胞百分数比较大剂量组多。结论 :B7分子的表达上调可能是参与低剂量电离辐射免疫增强效应的重要因素。     

双表达B7-1、B7-2基因肿瘤疫苗治疗小鼠肝癌优于单表达疫苗的研究

目的:研究B7-1、B7-2基因对肿瘤的免疫治疗作用。方法:应用转染有B7-1、B7-2基因的肝癌细胞株H22/B7-1、H22/B7-2,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小。结果:各实验组动物都发生肿瘤,接种H22/B7-1 H22/B7-2组成瘤率低,对照组动物肿瘤呈进行性生长;组间成瘤潜伏期不同,与对照组相比,凡接种有H22/B7-2的小鼠肿瘤形成有迟发性;接种转B7基因细胞的小鼠肿瘤生长都较对照组慢;同时接种H22/B7-1和H22/B7-的小鼠能负载大于107的肿瘤细胞。转基因细胞在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显增强。结论:B7-1、B7-2都能增强肝癌细胞的免疫原性。B7-2在抗肿瘤早期发挥作用,B7-1随后起放大和调节作用。B7-1与B7-2联用效果优于单一应用。     

吸烟对大鼠肺组织B7-1/B7-2及其相关配体表达的影响

目的 通过研究吸烟对大鼠肺组织B7-1/B7-2及其相关配体表达的影响,探讨专职抗原提呈细胞(APC)在吸烟所致肺部慢性炎症发生发展中的作用.方法 将30只健康雄性Wistar大鼠随机分为不吸烟组、吸烟6周组和吸烟12周组,每组10只.采用免疫组化半定量法测定大鼠气道周围肺间质中慢性炎症细胞胞膜B7-1B7-2、CD28和CTLA-4的表达水平.结果 吸烟6周组与吸烟12周组大鼠肺组织B7-1、B7-2、CD28和CTLA-4表达量较不吸烟组均显著增高(P＜0.01),吸烟12周组较吸烟6周组表达量也均增高(P＜0.01),随吸烟时间的延长各指标表达量均呈上升趋势.结论 吸烟可引起大鼠肺组织B7/CD28/CTLA-4表达水平的增高,提示APC可能在吸烟所致肺部慢性炎症发生发展中起重要作用.     

负载LMP-1基因的树突状细胞诱导CTL对鼻咽癌细胞的杀伤效应

目的：探讨超声联合微泡造影剂能否增强绿色荧光蛋白（GFP）质粒pEGFP—C3－LMP－1转染树突状细胞（Dendriticcells,DC）,进而探讨转染LMP－1基因的DC诱导细胞毒性T淋巴细胞（cTL）对鼻咽癌（NPc）细胞株的体外杀伤作用。方法：体外培养的人DC分为四组：①单纯质粒组（A组）：加入质粒;②超声照射组（B组）：质粒＋超声辐照;③微泡造影剂组（c组）;质粒＋微泡造影剂;④超声＋微泡造影剂组（D组）：质粒＋微泡造影剂＋超声辐照。荧光显微镜观察GFP质粒在DC内的表达,流式细胞仪评价GFP质粒的转染效率。另将体外培养的DC分为两组用于检测DC表面袁型的表达及体外杀伤实验：①空白对照组,单纯培养的DC;②基因转染组,具体实验方法同上述D组。流式细胞仪检测DC表面分子表型的表达。DC和T细胞混合共培养获得的CTL为效应细胞,LMP－1表达阳性的NPC细胞株C666—1为靶细胞,按效靶比10：1的比例混合培养24h后,MTT法检测CTL对靶细胞的杀伤作用。结果：D组DC内有较多的绿色荧光表达,且转染效率最高（14．86±2．36）％,和其余各组均有显著性差异。LMP—1基因转染组DC表面标志CD80、CD83、cD86、CD40、HLA—DR的表达明显高于对照组。所诱导产生CTL对靶细胞有明显的杀伤作用,其杀伤效率为（41．72±3．53）％,明显高于空白对照组（7．62±2．36）％。结论：超声联合微泡造影剂可有效地介导GFP质粒转染DC。LMP－1基因转染组De诱导产生特异性的CTL对靶细胞有明显的杀伤作用。     

人B7-1基因的cDNA克隆及其重组腺病毒载体制备

目的：构建并制备含人B7-1基因的重组腺病毒（Ad-B7-1)载体,为后续的肿瘤基因治疗研究提供实验基础。方法：应用逆转录-套式PCR方法从人骨髓细胞中克隆B7-1的cDNA后,将其克隆至小片段腺病毒载体pCI′中,后与pHBG10在293细胞内重组包装产生腺病毒,感染SGC7901细胞。结果：成功克隆了人B7-1的cDNA并构建Ad-B7-1载体,且经过酶切鉴定和测序验证,感染Ad-B7-1的细胞经PCR鉴定,表明B7-1基因已整合入细胞基因组。结论：本实验构建的腺病毒载体可有效地转B7-1基因进入肿瘤细胞,该结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了实验基础。