小鼠PGRP-L编码区基因的克隆及序列分析

目的：获得小鼠长型肽聚糖识别蛋白（mPGRP—L）全长编码区基因。方法：采用RT—PCR技术，从BALB／c鼠肝组织总RNA中扩增PGRP-L编码区基因片段，将其插入pUCm-T载体，以PCR和测序进行鉴定。结果：从BALB／c小鼠肝脏cDNA中，分别以Primer—F和Primer—R1、Primer—F1和Primer—R为引物对进行PCR，扩增得到约1050bp的上游基因片段和约540bp的下游基因片段。以纯化的上、下游片段为模板，Primer—F和Primer—R为引物进行PCR，扩增获得约16aHDbp的DNA片段，并将其克隆至pMD18-T载体获得重组质粒pMD18-mPGRP-L。鉴定结果表明，mPGRP—L编码区基因全长1593bp，与GenBank中mPGRP—LcDNA比较仅2个位置的核苷酸不同，两者的同源性为99．87％。结论：成功地克隆了mPGRP—L的cDNA，为mPGRP—L分子的研究奠定了一定基础。     

抗CD8单抗轻,重链可变区基因的克隆和序列分析

采用反转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法，从分泌特异性抗ＣＤ８单抗的杂交瘤细胞中扩增出该抗体轻，重链可变区（ＶＨ，ＶＬ）基因，并测定了其序列，经计算机分析，ＶＨ和ＶＬ基因均为新发现的基因序列，符合功能重排的鼠抗体可变区基因特征。     

THANK基因的克隆和序列分析

目的 克隆ＴＨＡＮＫ基因全长及胞外区片段并测序。方法 采用ＰＴ－ＰＣＲ技术,唑人白血病细胞系ＨＬ－６０细胞总ＰＡＮ中扩增人ＴＨＡＮＫ ｃＤＮＡ,并定向克隆于ｐＭＤ－１８Ｔ载体,转染大肠杆菌、抽提质粒后,用ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ＾ＴＭ３７７ＸＬＤＮＡ 自动测义测序。结果ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个８５８ｂｐ的ＤＮＡ片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示：该８５８ｂｐ片段为编码入ＴＨＡＮＫ的ｃＤＮＡ,与公布     

小鼠FasL基因的克隆和在软骨细胞中表达

目的：获得小鼠FasL(mFasL)的cDNA克隆，通过逆转录病毒表达系统pLNCX2在软骨细胞中进行表达，并分析其功能。方法：应用RT—PCR和T-A克隆技术，从激活的小鼠脾脏淋巴细胞总RNA中，扩增mFasL cDNA并克隆到T载体中，再亚克隆到pLNCX2中。转染软骨细胞后，以流式细胞仪检测mFasL蛋白的表达，以单向混合淋巴细胞反应鉴定其活性。结果：成功地克隆了0．855kb的mFasL cDNA，并经测序确证。通过pLNCX2转染软骨细胞，转染率为60．64％。流式细胞仪检测到FasL蛋白的表达，并能显著抑制同种异体的单向混合淋巴细胞反应，刺激指数下调到未转染软骨细胞的11．71％。结论：克隆到的mFasL基因，并能通过pLNCX2有效表达。表达产物具有显著抑制同种异体单向混合淋巴细胞反应的活性。     

小鼠BMP—McAb可变区基因的体外扩增,克隆与序列分析

从体外培养的ＢＭＰＭｃＡｂ杂交瘤中提取细胞总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ。以ｃＤＮＡ为模板，利用两对根据免疫球蛋白重链与轻链可变区５′端序列和Ｊ区序列设计合成的引物，通过ＰＣＲ方法，扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段（ＶＨ，ＶＬ）。将扩增产物分别克隆入ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９质粒，筛选出阳性克隆，利用双脱氧链终止法进行序列测定，经计算机分析，ＶＨ基因全长为３４５ｂｐ，编码１１５个氨基酸；ＶＬ基因全长为３１５ｂｐ，编码１０５个氨基酸。     

用TCRβ可变区基因阵列反映疾病的淋巴细胞克隆变化

将正常脐带血TCRβ（T细胞受体β）重排基因制备成因阵列,观察能否反映肿瘤或自身免疫疾患者的淋巴细胞克隆的变化。方法：采用RT－PCR扩增混合10例脐带血的cDNA不同家族的TCRβ可变区基因全部序列,经测序胶或SSCP电泳后,电转移到尼龙膜上,制成TCRβ可变区基因阵列。用同位素α－^32P dCTP标记正常成人、脐带血、待检患者的TCRβ基因,与基因阵列杂交。结果;从测序胶排列的基基阵列发现,正常成人及脐带血呈正常高斯分布,即呈多克隆性;一些肿瘤患者T淋巴细胞克隆有少数几个克隆的异常增生,即呈寡克隆性;1例急性T淋巴细胞白血病患者仅在Vβ16见单一的条带扩增,呈单克隆性。结论：该基因阵列可以反映正常人淋巴细胞的克隆分布和疾病时出现的淋巴细胞变化。     

中国人IκBα基因的克隆和序列分析

目的 克隆中国人IκBα基因，了解其与欧美人种有无不同，为进一步的研究工作打下基础。方法 从中国人外周血中分离单个核细胞，刺激细胞贴壁30min后提取总RNA。应用RT－PCR法扩增目的基因，胶回收法纯化。将其连接到pGEM-T质粒载体，进行测序并与已知IκBα序列进行同源性分析。结果 中国人IκBα基因与genebank中发表的人IκBα基因序列仅2个碱基不同且所编码氨基酸无改变。结论 我们已成功克隆了中国人IκBα基因。同源性分析表明，其与genebank中所报道的基因序列基本一致。     

柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）BJ株TA4基因的克隆的序列分析

对柔嫩艾美耳球虫（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）ＢＪ株ＴＡ４基因进行了克隆和测序分析。经纯化的Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａＢＪ株７ｈ孢子化卵囊的总ＲＮＡ为模板，根据国外报道的序列设计一对引物，用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出ＢＪ虫株的ＴＡ４基因。用常规基因克隆方法把ＢＪ株ＴＡ４基因插入ｐＧＥＭ－Ｔ克隆载体，选取正方向插入的一个阳性克隆进行酶切分析及插入片段的全序列测序分析。结果表明：该序列全长１２２７个核苷酸，有一个含２３０     

幽门螺杆菌ureB基因的克隆及序列分析

目的 对幽门螺杆菌（Hp)ureB核苷酸序列及推定氨基酸序列进行同源性比较分析,确定Hp菌株的ureB基因差异性,为疫苗的研究和诊断用品的评价提供依据。方法 自选设计引物,PCR扩增来自国内不同病人的4株Hp菌株的ureB基因,与pGEM-T载体克隆连接、测序;进一步同GenBank上发表的其他4株国外Hp菌株ureB的全基因序列进行比较分析。结果 8株Hp菌株的ureB基因序列出现了33种长度,CAPMF3和CPM630分别为1269bp和1680bp,其他为1710bp。6株1710bp的ureB基因序列的分析表明,国外3株Hp的ureB同源性较高,三者氨基酸的同源性达到100％。国内3株Hp的ureB变异较大,推定氨基酸同源性为98．7％－98．9％。结论 UreB作为保护性同时存在免疫保护覆盖率问题,研究疫苗和诊断用品时要注意选择使用在人群中流行占优势的Hp菌株的高度保守的UreB抗原肽,使其具有更高的覆盖率。     

中国人IL—18结构蛋白cDNA的克隆和序列分析

目的克隆人白介素 - 18结合蛋白 (h IL- 18BP)的 c DNA,以研究其结构与功能的关系。方法从中国汉族人的胎盘组织中提取总 RNA,以 RT- PCR方法扩增出全长 5 85个 bp的 IL- 18BP c DNA,将其与表达载体 pc DNA3连接 ,转化大肠杆菌 DH5 α,建立了 h IL- 18BP的 c DNA克隆。结果序列分析表明 ,与国外文献报道的人 IL- 18BP的 c DNA序列完全一致。结论 h IL- 18BP已成功地得到克隆。     

Secreted proteophosphoglycan of Leishmania mexicana amastigotes activates complement by triggering the mannan binding lectin pathway

Cutaneous lesions induced by infection of mice with the protozoan parasite, Leishmania mexicana, contain abundant amounts of a high molecular mass proteophosphoglycan (PPG), which is secreted by the amastigote stage residing in phagolysosomes of macrophages and can then be released into the tissue upon rupture of the infected cells. Amastigote PPG forms sausage-shaped but soluble particles and belongs to a novel class of serine-rich proteins that are extensively O-glycosylated by phosphooligosaccharides capped by mannooligosaccharides. The purified molecule is shown here to efficiently activate complement (C) and deplete hemolytic activity of normal serum and may prevent the opsonization of L. mexicana amastigotes. Complement activation is Ca²⁺ dependent but does not depend on antibodies or the complement component C1. PPG binds to serum mannan binding protein (MBP), thus activating the MBP-associated serine protease, P100. Subsequently, the C cascade is triggered through C4 leading to covalent modification probably of carbohydrate hydroxyls of PPG by C3 fragments. Thus, PPG is able to activate C via the mannan binding lectin pathway which is unusual for secreted, soluble products of microbial origin. The proteophosphoglycan-induced complement activation is postulated to contribute to the lesion development and pathology caused by the parasite.     

小鼠canstatin cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:从小鼠肝脏组织克隆canstatin cDNA并在大肠杆菌(E.coli)中表达, 为进一步研究其抗肿瘤血管生成活性奠定基础。方法: 用Trizol试剂提取小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin(m canstatin)的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin cDNA 定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中, 在大肠杆菌E.coli BL21中经IPTG诱导表达。结果:小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatin的cDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。IPTG诱导原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中表达。结论: 首次成功克隆了小鼠canstatin的cDNA, 其原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达,小鼠canstatin抗肿瘤血管生成活性有待进一步研究。     

人神经系统特异表达RNA结合蛋白HuC cDNA的克隆、表达及纯化

目的克隆人神经系统表达RNA结合蛋白HuC的cDNA并原核表达纯化。方法提取人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株总RNA,经RT-PCR扩增得到人HuC全长cDNA的克隆。将HuC cDNA克隆到原核表达载体pGEX4T-3载体中,并转化到大肠杆菌中,在获得高效表达后,利用GST纯化系统,对HuC重组蛋白进行纯化。结果经过表达及纯化条件的摸索,最终获得重组HuC蛋白。结论HuC蛋白是一种神经系统表达RNA结合蛋白,重组HuC蛋白的获得为HuC抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

小鼠白细胞介素-18的cDNA克隆及在真核细胞中初步表达的研究

目的 克隆小鼠白细胞介素－１８（ＩＬ－１８）编码区的ｃＤＮＡ,并实现在真核细胞中的表达。方法 用小鼠白细胞介素 －１８（ｍＩＬ－１８）的ｃＤＮＡ核苷酸序列,设计、合成基因序列特异性引物,应用逆转录多聚酶链反应ＲＴ－ＰＣＲ,以植物血凝（ＰＨＡ）和细胞脂多糖（ＬＰＳ）刺激的小鼠非粘附性脾细胞的ｍＲＮＡ为模板,扩增获得全长ｍＩＬ－１８,转染小鼠成纤维细胞系ＳＶＴ２,并进行ＩＬ－１８生物学活性的检测。结果     

人类一条新的类蛋白质二硫键异构酶cDNA的克隆和表达

利用SMART技术构建了人胎脑cDNA文库，通过大规模测序筛选出一条1645bp的人类cDNA。此cDNA含有一个888bp的开放阅读框（ORF），编码一个296个氨基酸的蛋白质，预测分子量34．0KD。与目前数据库中序列比较，该cDNA编码的蛋白质与蛋白质二硫键异构酶的同源性达36％，命名为类蛋白质二硫键异构酶（PDI－L）基因，多组织Northern blot分析显示PDI－L cDNA在心、脑、肝肾等组织中均有表达，该cDNA的读框片段正确插入到改造后的pBV220表达载体中，获得了预期的表达蛋白。     

人白细胞介素10（hIL－10）基因的克隆和序列测定

应用逆转录多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，自行设计并合成一对引物，成功地从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ基因。并定向插入ｐＵＣ１８载体中，经ＤＮＡ序列测定最终确定为ｈｌＬ－１０ｃＤＮＡ基困，这将为令后ｈＩＬ－１０基因探针的制备和基因表达，进一步在基因水平上探讨ｈＩＬ－１０的生物学功能提供了物质基础。     

EV71感染手足口病患儿临床表现与甘露糖结合凝集素表达及基因多态性相关性研究

目的 探讨EV71感染的普通手足口病患儿和重症患儿的临床表现差异与甘露糖结合凝集素(MBL)血清水平、基因多态性的相关性.方法 2009年6月至2011年7月在无锡市儿童医院门诊及住院EV71感染的手足口病患儿作为研究对象,用ELISA方法测定普通病例组、重症病例组的急重期和恢复期、对照组的血清MBL水平,同时对各组作MBL2基因测序,对比分析各组血清MBL,水平和MBL2基因6个常见位点变异频率.结果 重症循环肺衰竭组MBL的血清水平在危重急重期时较普通病例、重症病例脑炎组、对照组有显著升高(P＜0.05);而在恢复期时,重症病例循环肺衰竭组血清MBI.水平较急重期低约40％,有显著降低(P＜0.05).普通病例组、重症病例组、对照组的MBL2基因启动子区-550位点H/H野生型、+4P野生型、+230位点B/B纯合变异型的变异频率有显著不同(P值分别为0.006、0.043、0.028).缺少型基因的LYPB/LYPB和充足型基因的HYPA/HYPA频率在3组间差异有统计学意义(x2=7.17,P=0.028;x2 =8.55,P=0.014).重症病例组的缺少型基因LYPB/LYPB频率较对照组、普通病例组有显著升高,而充足型基因HYPA/HYPA频率较对照组、普通病例组有显著降低.结论 MBL2基因多态性导致的血清MBL蛋白水平低下与感染EV71的手足口病患儿病情轻重相关,可以作为患儿免疫状况和手足口病危险因素评估依据之一.     

小鼠白细胞介素6的cDNA克隆及其在昆虫细胞中的表达

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＬＰＳ刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞，扩增小鼠ＩＬ－６ｃＤＮＡ，并克隆构建ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）ＩＬ－６质粒，继将小鼠所得ｃＤＮＡ克隆到ｐＶＬ１３９２载体上，利用杆状病毒ＡｃＮＰＶ表达系统在Ｓｆ９中进行瞬间表达，用ＩＬ－６依赖细胞株ＭＨ６０·ＢＳＦ２检测其表达活性，结果表明，感染后４８ｈ后就具有明显ＩＬ－６表达，由此可见，利用该系统可成功地表达小鼠ＩＬ－６基因。     

人白介素1受体拮抗剂的cDNA克隆和原核表达

从活化的正常人外周血单核细胞中提取总ＲＮＡ，经逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获得了人白介素１受体拮抗剂（ＩＬ－１Ｒａ）ｃＤＮＡ。经过ＤＮＡ测序分析，发现该片段和国外发表的ＩＬ－１ＲａｃＤＮＡ序列一致，将该目的基因插入ｐＢＶ２２０载体，并转入大肠杆菌ＨＢ１０１中，经热诱导表达重组蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后发现，菌体超声裂解后，在可溶性上清中有一Ｍ１７０００的特异带，约占菌体可溶性总蛋白的８０％以上