丹参诱导类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞中Fas/FasL的表达

目的 观察丹参对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者成纤维样滑膜细胞中Fas/FasL mRNA表达的影响.方法 RA患者关节滑液经原代培养,获取成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs),分别用终浓度为0、0.2 mg/ml和0.4 mg/ml的丹参作用24 h后,提取总RNA并逆转录成cDNA保存.随机选取正常人外周血,通过分离单个核细胞提取总RNA并逆转录成cDNA保存作为阳性对照.分别采用RT-PCR和SYBR Green适时荧光定量PCR方法检测Fas/FasL mRNA的表达.结果 RT-PCR结果显示,FasL只在外周血标本上有表达,而在各浓度处理的RA FLSs没有检测到;Fas无论在外周血还是不同浓度处理的RA FLSs上均有表达.定量PCR结果显示,Fas的表达量随丹参浓度增加而增加,并且在丹参浓度为0.4 mg/ml时具有统计学差异(P<0.05).Fas mRNA的表达与相应浓度下RA FLSs的凋亡率存在相关性(r=0.998,P<0.05).结论 丹参可体外诱导RA患者成纤维样滑膜细胞Fas mRNA表达上调;未检测到FasL mRNA在RA患者FLSs中的表达.Fas mRNA的上调可能与丹参诱导RA FLSs凋亡有关.     

佐剂诱导关节炎大鼠模型的建立及成纤维样滑膜细胞的分离

目的建立类风湿性关节炎(RA)动物模型；从炎性关节滑膜中分离成纤维样滑膜细胞(FLS)。方法应用热灭活结核杆菌H37Ra菌株与矿物油混合制备改良的佐剂,尾根部皮内注射Lewis大鼠诱导关节炎；剪取成功诱导关节炎大鼠的病变踝关节,从中剥离滑膜组织,充分剪碎后采用胶原酶消化法分离成纤维样滑膜细胞。结果成功诱导了大鼠关节炎,发病率为100%,发病时间有规律,组织学表现与RA相似；成功在体外培养了FLS并对其进行了鉴定,掌握了其生长形态和特征。结论成功制备RA动物模型并获得FLS,为今后RA发病机制探索和药物评价提供了良好的体内动物模型和体外细胞模型。     

炎性复合体mRNA在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及意义

目的研究炎性复合体(inflammasomes)在类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)中的表达及对细胞自身的影响。方法 (1)用Real-time PCR检测IPAF和NALP1 mRNA在3例关节创伤(正常组)、4例骨关节炎(OA组)和6例RA(RA组)患者滑膜细胞中的表达情况;(2)分别用培养液(对照组)、脂多糖(LPS,LPS组)、LPS+苄氧羰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-(O-甲酰)-氟甲基酮(Z-VAD-FMK,Z-VAD-FMK组)、肿瘤坏死因子(TNF,TNF组)及TNF+Z-VAD-FMK处理6例RA患者滑膜细胞24 h后,应用Real-time PCR技术检测IPAF和NALP1 mRNA表达情况。结果 (1)OA组IPAF和NALP1的mRNA表达均明显高于正常组和RA组(P<0.01),RA组IPAF和NALP1的mRNA表达均高于正常组,但差异无统计学意义。(2)TNF组IPAFmRNA较对照组表达增加达408%(P<0.05);TNF组NALP1 mRNA较对照组表达增加达119%(P<0.05),LPS组的水平是TNF组的1.18倍(P<0.05)。结论炎症因子TNF影响炎性复合体mRNA在RA-FLS中的表达。     

IL-27诱导人成纤维样滑膜细胞产生IL-6的免疫机制

目的：探讨白介素-27（interleukin-27,IL-27）对人成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte,FLS）的体外活化效应及细胞内信号传导机制。方法：IL-27处理FLS后,酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6,IL-6）水平的变化;信号通路抑制剂处理FLS后1 h,用IL-27刺激FLS 48 h,ELISA检测细胞上清液中IL-6的水平变化;Western blot检测IL-27刺激FLS不同时间细胞内信号通路蛋白的磷酸化水平。结果：IL-27能刺激正常关节来源的FLS（N-FLS）和RA患者关节来源的FLS(RA-FLS)产生IL-6,IL-27（50 ng/mL）刺激N-FLS产生的IL-6水平[（1329.10±113.15） pg/mL]和刺激RA-FLS产生的IL-6水平[（1 583.70±129.54） pg/mL]较其阴性对照明显升高（P=0.001,P=0.001）。用不同浓度（0、10、20、50、100 ng/mL）IL-27分别处理2种细胞不同时间（0、12、24、48 h）,产生IL-6的水平随浓度和时间增加而升高,具有时间和剂量依赖性。JAK抑制剂AG490和JNK抑制剂SP600125可显著抑制IL-27诱导N-FLS和RA-FLS产生IL-6。IL-27刺激N-FLS和RA-FLS后,细胞内信号通路蛋白JAK2和JNK的磷酸化水平明显升高（JAK2：F=303.000,P=0.000;F=640.400,P=0.000;JNK：F=98.840,P=0.000;F=54.820,P=0.001）。结论：IL-27可通过激活FLS细胞内JAK2和JNK信号通路上调FLS产生IL-6水平,从而增强关节滑膜的炎症反应。     

E2F2在类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞中的表达研究

目的 研究E2F2在类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞（RA FLs）中的表达,分析其表达与类风湿关节炎病理特征的关系,以及调控E2F2表达的机制。方法 采用瞬时转染的方法将E2F2 siRNA转染入RA FLs后,应用RT-PCR 法筛选干扰效率最高的siRNA,并应用MTS法检测干扰E2F2表达后对RA FLs增殖的影响,采用ELISA法检测E2F2下游基因表达的变化。采用RT-PCR法检测分别使用TNF-α和PDTC刺激RA FLs以及共同使用TNF-α和PDTC刺激RA FLs后E2F2的表达。通过染色质免疫沉淀法（ChIP）检测调控E2F2表达的方式。结果 在siE2F2后,与对照组相比E2F2在mRNA水平表达显著降低（P<0.01）,细胞增殖能力减弱（P<0.05）。在RA FLs中TNF-α通过NF-κB信号通路调控E2F2表达。结论 在RA FLs中E2F2存在高表达现象,并且E2F2的高表达参与RA的病变过程,TNF-α通过NF-κB信号通路调控E2F2表达,可做为治疗类风湿关节炎的新靶点。     

成纤维样滑膜细胞Toll样受体在类风湿性关节炎的研究进展

Toll样受体（toll-like receptor,TLRs）是一种I型跨膜蛋白受体,可识别微生物上特定结构的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）和宿主自身损伤细胞产生的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMPs）,在天然免疫中发挥着重要作用。     

类风湿关节炎患者滑液NK-22细胞对成纤维样滑膜细胞增殖的影响及其机制研究

目的探讨类风湿关节炎患者滑液NK-22细胞对成纤维样滑膜细胞增殖的影响及其可能机制。方法采用流式细胞术检测20例RA患者及20例健康对照外周血(peripheral blood,PB)、10例RA患者滑液(synovial fluid,SF)中NK-22细胞(NKp44+CCR6+NK细胞)比例。流式细胞术分选滑液NK-22细胞,鉴定细胞纯度;体外悬浮培养2周,佛波酯(PMA()20ng/ml)和ionomycin(0.5μmol/L)刺激后NK-22细胞培养上清液分别作用于成纤维样滑膜细胞(fibroblastlike synoviocytes,FLS)24 h、48 h、72 h、96 h,MTT法检测成纤维样滑膜细胞增殖情况。ELISA检测NK-22细胞培养上清中IL-22、T0.N05F)-;αR浓A度患。者结滑果液①NKR-A22患细者胞外比周例血为N4K.5-62%2细,明胞显比高例于为自0身.9外56周%,血明比显例高1于.31健5%康(对P<照0.外05)周。血②N流K式-22分细选胞2比×1例04个0.0N0K3%-2(2P细<胞,细胞纯度>90%。③PMA和ionomycin刺激后NK-22细胞培养上清作用于成纤维样滑膜细胞24 h、48 h、72 h、96 h可明显刺激成纤维样滑膜细胞增殖(P<0.05)。④PMA和ionomycin刺激后NK-22细胞培养上清中IL-22、TNF-α浓度分别为941.82 pg/ml和368.10 pg/ml。结论类风湿关节炎患者关节液NK-22细胞可明显刺激成纤维样滑膜细胞增殖,其可能机制与NK-22细胞能分泌白介素-22(IL-22)、肿瘤坏死因子(TNF-α)有关。     

成纤维样滑膜细胞激活在类风湿关节炎中的关键作用及其靶向治疗的研究进展

类风湿关节炎(RA)是临床常见病和多发病,以滑膜组织增生、间质炎性细胞浸润、微血管新生、血管翳形成及软骨和骨组织的破坏等为主要病理特征。目前,其发病机制尚未明确,有越来多研究表明成纤维样滑膜细胞的异常激活在疾病发生、发展中起着关键的作用。靶向成纤维样滑膜细胞的研究策略可为有效治疗RA提供新思路。     

赤芍801对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞fas/faslmRNA表达的影响

目的 :探讨赤芍801对类风湿关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞(FLS)中fas/fasl mRNA表达的影响。方法:RA患者关节液原代培养获取FLS,分别用浓度为0、4和64μg/mL的赤芍801作用24h后,提取总RNA并逆转录成cDNA,分别采用RT-PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR检测fas/fasl的表达。结果:逆转录PCR结果显示,fasl mRNA在RA FLS中未被检测出,fas mRNA在RA FLS中有表达。实时荧光定量PCR结果表明fas mRNA相对表达量在4μg/mL赤芍801刺激24h后增加无统计学意义。但在64μg/mL赤芍801刺激24h后增加有统计学意义(P<0.05)。结论:赤芍801可体外诱导RA FLS fas mRNA表达上调;未检测到fasl mRNA在RA FLS中的表达。     

CXCL16/CXCR6在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及其在滑膜细胞增殖中的作用

目的：探讨趋化因子CXCL16及其受体CXCR6在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）中的表达及其对FLS增殖的作用。方法:纳入RA 8例、骨关节炎（osteoarthritis,OA）7例、健康对照3例,采用组织块贴壁方法体外分离培养人膝关节FLS,第3~5代细胞用于后续研究。Western blot方法检测CXCL16及其受体CXCR6在3组FLS的表达水平;不同浓度的重组人CXCL16(0、10、50、100、200 μg/L)刺激3组FLS后,细胞活性检测试剂盒-8（cell counting kit,CCK-8）检测FLS增殖水平;Western blot方法检测重组人CXCL16刺激后RA-FLS中pAKT/AKT水平;ELISA法检测重组人CXCL16刺激后RA-FLS培养上清中TNF-ɑ、IL-6、MMP-3、RANKL水平。结果: RA-FLS中CXCL16、CXCR6蛋白表达水平均明显高于OA组和对照组（P<0.05）,OA组和对照组间差异无统计学意义;重组人CXCL16（50、100、200 μg/L）刺激后RA-FLS增殖能力明显高于非刺激组（P均<0.05）,OA组和对照组FLS经CXCL16刺激后细胞增殖水平无明显变化（P>0.05）;200 μg/L CXCL16刺激后,RA-FLS表达pAKT/AKT明显增高;CXCL16（50、100、200 μg/L）刺激后,RA-FLS培养上清中IL-6和RANKL表达明显增加（P < 0.05）,而MMP-3、TNF-ɑ水平无明显变化。结论:CXCL16及其受体在RA-FLS中表达增高,重组人CXCL16可促进RA-FLS增殖活化、分泌炎性因子增加,提示CXCL16参与了RA的滑膜炎症。     

滑膜成纤维细胞的原代培养及生物特性

目的研究滑膜成纤维细胞的原代培养方法及生物特性。方法收集行关节腔镜术或关节置换术的患者的膝关节滑膜标本,其中类风湿关节炎、骨关节炎、关节创伤病例各6例,分别采用酶消化法、组织块法进行滑膜成纤维细胞的原代培养并进行生物特性的观察及鉴定。结果总共有6例类风湿关节炎、4例骨关节炎、4例关节创伤患者关节滑膜成功培养出成纤维样滑膜细胞,其中9例应用酶消化法,5例应用组织块法,经鉴定成纤维样滑膜细胞的纯度99%。结论本课题成功应用酶消化法和组织块法进行滑膜成纤维细胞的原代培养,所培养细胞适用于进行滑膜成纤维细胞相关的研究。     

miR-let-7d-HMGA2通路调控缺氧诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞增殖

目的 研究缺氧在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）滑膜成纤维样细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS）增殖中的作用及机制。 方法 采用HE染色法检测RA和对照骨关节炎（osteoarthritis, OA）滑膜组织FLS增生情况。分离原代RA-FLS并采用流式细胞术鉴定;将RA-FLS置于常氧（21%O2）或缺氧环境（3%O2）中培养,CCK-8法检测细胞增殖水平的变化,RT-PCR检测miR-let-7d表达的变化。通过类似物或抑制物改变miR-let-7d的表达,观察其对RA-FLS增殖、凋亡的影响;探究miR-let-7d靶基因在缺氧诱导的RA-FLS增殖中的作用。 结果 FLS在RA滑膜中增生明显,在缺氧环境下RA-FLS增殖加快,miR-let-7d表达水平降低;过表达miR-let-7d抑制RA-FLS增殖,但对细胞凋亡水平无明显影响;进一步的研究证实miR-let-7d靶基因HMGA2参与缺氧诱导的RA-FLS增殖。 结论 miR-let-7d-HMGA2通路调控缺氧诱导的RA-FLS增殖。     

肥大细胞和类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞共培养对白细胞介素-6分泌的影响

目的 观察肥大细胞和关节成纤维样滑膜细胞(FLS)共培养对FLS分泌白细胞介素(IL)-6的影响及其作用机制.方法 应用免疫组化染色法观察肥大细胞在关节滑膜中的分布.分离培养RA患者的FLS,加入肥大细胞系LAD-2共培养或用Transwell小室隔离共培养,观察上清中FLS分泌的细胞因子IL-6的变化.结果 LAD-2几乎不产生IL-6,FIS组IL-6的浓度为(3019±57)μg/L,而FLS与等量LAD-2细胞共培养的IL-6浓度为(7150±114) μg/LL(P<0.01).且其增加程度与LAD-2细胞数量呈正相关.以4%甲醛固定和Transwell小室隔离两种方法分别阻断可溶性介质分泌和细胞间相互黏附,前一组中IL-6增加可被阻断,但在后一组中不受影响.结论 肥大细胞与FLS通过可溶性介质相互作用可增加FLS的IL-6分泌,在RA发病中可能有重要意义.     

miR-26a-5p通过JAK2/STAT3 信号通路对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响

探讨miR-26a-5p对人类风湿关节炎（RA）-成纤维样滑膜细胞（FLSs）凋亡及炎性因子分泌的影响,阐明其作用机制。     

白头翁皂抑制佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞凋亡

目的：研究白头翁皂苷(pulchinenoside,PULC)对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠成纤维样滑膜细 胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)凋亡的影响。方法：60只 SD大鼠被随机分为正常对照组、AA组、PULC低剂量组 (50 mg/kg)、PULC中剂量组(100 mg/kg)、PULC高剂量组(150 mg/kg)、布洛芬8 mg/kg阳性药物组,每组10只。原代 培养AA大鼠FLS,real time qPCR检测PULC灌胃治疗对AA大鼠FLS抗凋亡基因Bcl-2,促凋亡基因Bax和细胞凋亡因子 caspase-3表达的调控作用;MTT 检测PULC治疗对FLS增殖的影响;ELISA检测PULC对FLS的IL-6和IL-8表达的影响。结 果：与AA组比较,各治疗组FLS中抗凋亡基因Bcl-2表达明显降低(均P<0.05),促凋亡基因Bax和细胞凋亡因子caspase-3 表达显著升高(均P<0.05),AA大鼠FLS增殖活力明显降低(均P<0.05),IL-6和IL-8表达显著下降(均P<0.05)。结论： PULC可能通过促进FLS凋亡而抑制AA大鼠滑膜的异常增殖。     

p53 in fibroblast-like synoviocytes can regulate T helper cell functions in patients with active rheumatoid arthritis

Background  p53 is a tumor suppressor and plays a key role in regulating cell hyperplasia, repairing DNA and inducing apoptosis. This study was to investigate p53 expression in fibroblast-like synoviocytes (FLS) and its effect on CD4⁺ T lymphocytes from patients with active rheumatoid arthritis (RA).

Methods  Human FLS were transfected with p53 siRNA and cocultured with CD4⁺ T lymphocytes from patients with active RA. The expressions of osteoprotegerin and interleukin (IL)-6 were detected in p53 siRNA and scramble siRNA-transfected FLS. In addition, protein levels of interferon (IFN)-γ, IL-17, IL-4 and CD25 as well as mRNAs of IFN-γ, retinoic acid-related orphan receptor (ROR)-γt, IL-17 and Foxp3 in cocultured CD4⁺ T lymphocytes were also measured.

Results  IL-6 decreased in p53-knockdown FLS while osteoprotegerin expression was not altered. FLS with p53 deletion significantly increased the production of IL-17 and IFN-γ by CD4⁺ T cells and upregulated Foxp3 mRNA expression without effects on the proportion of CD4⁺CD25^high T lymphocytes.

Conclusion  p53 in FLS might regulate Th1 and Th17 functions in patients with RA and participate in the pathogenesis of RA.

     

小乌桂颗粒剂含药血清对CIA大鼠膝关节成纤维滑膜细胞体外增殖的干预研究

目的通过观察小乌桂颗粒剂含药血清对胶原诱导关节炎（CIA）大鼠成纤维滑膜细胞（CIA-FLS）体外增殖的影响,探讨其治疗类风湿关节炎（RA）的可能机制。方法采用鸡Ⅱ胶原建立CIA大鼠模型,运用关节炎指数评分法及病理切片炎症程度评分系统对其进行评价。组织块培养法体外分离培养CIA大鼠膝关节滑膜组织中CIA-FLS。实验分为空白对照组、甲氨蝶呤（MTX）组及高、中、低剂量小乌桂颗粒剂含药血清组5组,分别干预CIA-FLS24、48、72h,MTT法检测其增殖情况,ELISA检测干预前和各组细胞上清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的水平。结果高、中剂量小乌桂颗粒剂含药血清组和MTX组干预CIA-FLS24、48、72h均可明显抑制其增殖,细胞培养上清中TNF-α、MMP-1水平明显降低,与干预前及空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;低剂量小乌桂颗粒剂含药血清组干预CIA-FLS48、72h可明显抑制CIA-FLS增殖,细胞培养上清中TNF-α水平明显降低,其干预CIA-FLS24、48、72h细胞培养上清中MMP-1水平均明显降低,与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论小乌桂颗粒剂含药血清可能通过抑制FLS增殖,并抑制FLS分泌TNF-α、MMP-1来减轻滑膜炎症反应,该过程是其发挥治疗RA的可能机制。     

白藜芦醇抑制低浓度H2O2处理佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞增殖的机制研究

目的 探讨抗氧化剂白藜芦醇(Res)对低浓度H2 O2处理的佐剂性关节炎(AA)大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖的抑制作用.方法 弗氏完全佐剂足趾皮下注射SD雄性大鼠,建立AA模型,14 d后股动脉放血处死AA大鼠,取血清检测氧化应激指标,组织块培养法培养大鼠滑膜细胞,CCK-8法观察不同浓度的H2O2对FLS的增殖影响,Western blot法检测氧化应激相关蛋白去乙酰化酶3(SIRT3)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)蛋白的表达.结果 AA模型大鼠血清氧化应激指标升高,体外实验表明,随着Res的浓度增加,低浓度H2O2处理的AA大鼠FLS增殖受抑制,SIRT3、MnSOD蛋白表达降低.结论 Res可减轻AA大鼠体内的氧化应激状态,机制与降低抗氧化应激蛋白SIDT3、MnSOD的表达有关.     

银杏内酯B对CIA大鼠成纤维样滑膜细胞增殖的影响

①目的探讨银杏内酯B对胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）大鼠成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synovi-al cells,FLS）的影响。②方法雄性Wistar大鼠皮内注射Ⅱ型胶原,建立CIA大鼠模型,然后取其滑膜组织用胶原酶消化法进行原代培养,取3~5代的滑膜细胞。应用MTT比色法检测1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L的银杏内酯B作用24、48和72h后FLS的增殖水平。③结果（1×10-9~1×10-5）mol/L的银杏内酯B作用24、48和72h,均能明显抑制FLS的增殖（P〈0.05）,且具有时间、剂量依赖性。④结论银杏内酯B能明显抑制CIA大鼠FLS的增殖并呈时间、剂量依赖性改变。