胰岛素基因逆转录病毒载体在人骨髓间充质干细胞表达的实验研究

目的构建携带胰岛素基因逆转录病毒载体,使其在人骨髓间充质干细胞(hMSCs)内稳定表达。方法通过RT-PCR法从人胰腺组织中提取胰岛素基因片段,并将其连接入逆转录病载体pLNCX,经包装细胞PT67的包装后,获得含外源性胰岛素基因的病毒颗粒(病毒滴度达4.2×106cfu/ml)并感染hMSCs,经过G418筛选后,用RT-PCR法、免疫荧光法、放射免疫法、葡萄糖刺激试验分析胰岛基因的表达情况。结果携带胰岛素基因的逆转录病毒载体构建成功,转导入hMSCs后能够稳定表达胰岛素基因,并分泌至细胞外持续3周以上,但对葡萄糖刺激无明显反应。结论重组人胰岛素基因逆转病毒载体能够将胰岛素基因导入hMSCs并稳定表达。     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对外周血淋巴细胞的免疫调节作用比较

目的 比较人羊膜间充质干细胞(hAMSC)与骨髓间充质干细胞(hBMSC)对异体外周血淋巴细胞的免疫调节功能,为临床应用hAMSC治疗移植物抗宿主病提供实验依据.方法 通过酶消化法和Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分别分离出人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞,体外扩增培养间充质干细胞(MSC),获取第4代细胞,建立MSC与经植物血凝素(PHA)刺激的异体人外周血单个核细胞(PBMC)共培养体系,采用流式细胞术分析比较两种不同共培养体系中T淋巴细胞亚群的变化情况,采用ELISA法比较两种MSC共培养体系中细胞因子白介素2(IL-2)及白介素10(IL-10)的分泌水平.结果 (1)hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组Treg、Th2、Tc2细胞亚群的比例均较PBMC+PHA组明显上升(P<0.05),Th1、Tc1细胞亚群的比例均较PBMC+PHA组明显下降(P<0.05),且hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组T细胞亚群的变化差异无统计学意义(P>0.05);(2)ELISA结果提示,与PBMC+PHA组相比,hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PHA+PBMC共培养组上清液中IL-2的水平均明显下降(P<0.05),hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PHA+PBMC共培养组上清液中IL-10水平均明显上升(P<0.05),hAMSC+PBMC+PHA、hBMSC+PBMC+PHA共培养组上清液中IL-2、IL-10含量的变化无统计学差异(P>0.05).结论 hAMSC、hBMSC对外周血淋巴细胞具有相似的免疫调节功能,提示hAMSC可能为移植物抗宿主病的预防和治疗提供一种新的选择.     

人VEGF基因腺病毒表达载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞

目的 探讨含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因腺病毒表达载体Ad-VEGF转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的可行性.方法 采用贴壁培养筛选法富集大鼠BM-MSCs.将HEK293细胞中扩增并经效价分析后的Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,通过对细胞转染效率、生长和活力的观察分析,以确定理想的感染复数(MOI)值.结果 本实验经HEK293细胞扩增制备的Ad-VEGF的病毒效价达8×108 pfu/ml;当MOI值为50时,Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs效率可达最高值53％;而MOI值高于50时,Ad-VEGF转染对BM-MSCs活性抑制明显.结论 成功实现Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,其最适MOI值为50.     

人胚胎骨髓间充质干细胞的体外培养

目的 摸索体外培养人胚胎骨髓间充质干细胞的方法.方法 采用含5%胎牛血清的MEM(modified Eagle's medium)培养基培养人胚胎骨髓间充质干细胞,用流式细胞仪检测培养获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量.结果 培养获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量达93%.结论 本研究方法培养获得的人胚胎骨髓间充质干细胞纯度高,细胞活性好.     

逆转录病毒载体介导Fn-TPO基因修饰人骨髓间充质干细胞

目的 应用逆转录病毒载体介导纤维连接蛋白-血小板生成素(Fn-TPO)基因修饰人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察Fn-TPO基因修饰对于骨髓MSCs的影响.方法 构建携带Fn-TPO基因的重组逆转录病毒载体,并以其对骨髓MSCs进行体外基因修饰;台盼蓝拒染法计数活细胞数检测基因修饰后骨髓MSCs的体外增殖能力,RT-PCR检测Fn-TPO基因在骨髓MSCs中的表达情况,MTT法检测基因修饰后骨髓MSCs黏附造血细胞的能力,ELISA检测基因修饰后骨髓MSCs分泌至细胞培养液中的TPO浓度.结果 成功构建携Fn-TPO基因的重组逆转录病毒载体且以该逆转录病毒载体对骨髓MSCs进行体外基因修饰;Fn-TPO基因在骨髓MSCs内能够正常转录;基因修饰后的骨髓MSCs体外增殖能力无明显改变(P＞0.05);黏附造血细胞能力增强(P=0.01),分泌TPO的能力增强且不随培养时间延长而显著减弱(P＜0.01),但受细胞生长状态影响.结论 成功应用携带Fn-TPO基因的逆转录病毒载体对人骨髓MSCs进行基因修饰,使基因修饰后骨髓MSCs黏附造血细胞分泌TPO能力增强.     

逆转录病毒介导外源基因高效感染大鼠骨髓间充质干细胞

目的 通过逆转录病毒系统将小鼠同源盒基因Soxl转移至大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）。检测外源基因的表达，感染效率及感染时间。方法 常规分子生物学亚克隆技术构建重组逆转录病毒载体，转染至包装细胞株PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液，感染rMSC，并用带EGFP表达盒的pLEGFP-N1载体的逆转录病毒系统作为平行对照，评估感染率；使用Westernblot以及免疫组织化学的方法检测携带目的基因的重组逆转录病毒在rMSC中的感染和表达情况。结果 本实验成功地制备了pLXSN—Soxl重组逆转录病毒载体并制备出高滴度病毒颗粒；将病毒上清感染rMSC，EGFP阳性细胞为21％，感染时间持续20d，而对照脂质体转染法EGFP阳性细胞仅为3％。免疫组化及Westernblot显示用重组逆转录病毒液感染的rMSC可表达外源基因产物Soxl蛋白。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将外源性基因高效转移至rMSC中，并有外源性基因的稳定表达。     

人骨髓间充质干细胞分离培养鉴定及VEGF基因的转染

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离培养、鉴定方法及人血管内皮生长因子（hVEGF）165基因转染hMSC后表达情况,拟构建血管化组织工程皮肤.方法：用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,生长情况.检验细胞CD44、CD29、CD14、CI45等表面标记.利用基因重组技术,构建pCDN3.1＋VEGF表达质粒,并将其转染第3代hMSC.经G418抗性筛选后扩大培养并用Western blot实验检测其蛋白产物.结果：骨髓密度梯度离心法分离hMSC,接种培养瓶后26 h呈对数生长,6d后达到高峰.hMSC表达CD29,CD44,不表达造血细胞标记物CD14和CD45.通过酶切鉴定验证成功构建pCDN3.1＋ VEGF表达质粒.Western blotting实验证实转染后hMSCs表达VEGF增加.结论：成功建立hMSC分离培养鉴定体系.利用基因重组技术可成功将hVEGF基因导入hMSC并产生预期效应.     

稳定表达Bcl-2的骨髓间充质干细胞载体的建立及对缺血性损伤保护作用的实验研究

目的 构建稳定表达Bcl-2基因的大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)载体,观察Bcl-2基因转染对骨髓间充质干细胞生物特性的影响及体外模拟缺血性损伤的保护作用.方法 用RT-PER技术扩增小鼠Bcl-2 cDNA,慢病毒介导的基因转导骨髓间充质干细胞,转导后的细胞用Puromycin筛选,RT-PER法检测转染后Bcl-2的表达,采用血清剥夺和缺氧(SOD)处理建立MSC体外模拟缺血性损伤模型,通过流式细胞术评价转染Bcl-2基因的MSC和未转染的MSC的凋亡及存活情况.对转导Bcl-2的MSC神经诱导及检测.结果 转导Bcl-2基因的MSC经Puromycin筛选后可稳定、高效表达Bcl-2蛋白;流式细胞术检测显示:和MSC相比,转导Bcl-2基因的MSC在SOD后凋亡细胞较少,存活细胞较多.转导Bcl-2基因的MSC仍具有向神经细胞分化的潜能.结论 慢病毒介导的Bcl-2基因转导MSC有其蛋白的稳定表达,Bcl-2基因转导可对抗MSC体外模拟缺血性损伤引起的细胞凋亡,从而具有保护性作用,且不影响MSC向神经细胞分化的潜能.     

人骨髓间充质干细胞体外培养及鉴定

目的：体外分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（hBMSC）。方法：利用密度梯度离心法分离出人骨髓单个核细胞（MNC），通过贴壁筛选法建立hBMSC的体外培养体系，并通过一系列检测方法对所培养的细胞进行鉴定。结果：细胞主要呈“成纤维样”，但体积较大、形状不规则、细胞质突起多，细胞核大而疏松，核仁明显。流式细胞仪检测：CD34阳性率为2．09％、CD29阳性率为94．46％；CD54及CD105表达阳性。细胞周期及透射电镜检测提示细胞处于相对原始状态。免疫细胞化学染色显示：CD14、CD45、胶原蛋白Ⅱ呈阴性；CD106、CD166、纤维连接蛋白、波形蛋白及胶原纤维酸性蛋白呈阳性。细胞化学染色：糖原染色呈强阳性；碱性磷酸酶染色呈阴性。通过诱导分化培养可诱导出成骨细胞。结论：成功建立了稳定的hBMSC体外培养体系，按照此培养体系进行培养可获得hBMSC。hBMSC可传代培养，但在培养过程中细胞逐渐出现老化现象，且不能冻存。     

人骨髓间充质干细胞体外优化条件的研究

目的通过比较5种不同体外培养人骨髓问充质干细胞（hMSCs）条件，找到一种能在质和量上均能满足需要的体外培养条件。方法使用Percoll-Paque液（1．073g／ml）分离人骨髓血，采用DMEM＋15%的小牛血清、人体白蛋白、人血清、脐带血清及MesenCult培养基，在相同培养条件下，动态观察hMSCs的生长状况、细胞数量变化，通过流式细胞仪检测细胞的纯化状况。结果5种培养条件在一定时相内均能获得较为纯化的hMSCs，但在生长速度和纯化率上存在一定的差异。结论Mesen Cult是一种较为优秀的hMSCs培养基．胎儿脐带血清培养也能在短期内获得足量纯化的hMSCs．人血清的使用还需要做进一步的研究。     

人骨髓间充质干细胞的培养及研究

目的　了解间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的培养条件、生物特性及分化能力。方法　抽取健康成人骨髓,利用密度梯度离心分离培养人MSC,并用流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导MSC向成骨细胞分化。结果　成功地进行了人MSC的原代和传代培养;MSC CD34、CD45、HLA DR、CD62p等为阴性,CD29、CD44、CD166、CD90 等为阳性;MSC能够分化为成骨细胞。结论　人骨髓MSC在体外有较强的扩增能力,并能够向成骨细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

间充质干细胞双向调节肿瘤疾病

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是具有强大增殖能力和多向分化潜在能力的祖细胞,根据来源不同,可以分为骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。MSCs有望成为用于细胞治疗和促进组织修复的候选细胞。然而,MSCs 在某些情况下对肿瘤细胞的促进作用也不能忽视。该文回顾近年来关于MSCs 双向调节肿瘤细胞的文献,从中探究引起肿瘤细胞的增殖,迁移,侵袭产生抑制或者促进作用机制和规律,为科学合理地开展MSCs 的临床试验提供参考。     

The Chondrogenic Potential of Rabbit Bone-marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) Assayed under the Influence of Growth Factors

Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ (ＭＳＣｓ)ａｒｅｍｕｌｔｉ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｓ ,ｌｏｃａｔｅｄｉｎｐｅｒｉｏｓｔｅｕｍ ,ｂｏｎｅｔｒａ ｂｅｃｕｌａ,ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅａｎｄｄｅｒｍｉｓ,ｗｈｉｃｈｈａｖｅｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｓｅｖｅｒａｌｔｙｐｅｓｏｆｃｅｌｌ,ｓｕｃｈａｓｏｓｔｅｏｃｙｔｅ ,ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ,ｃａｒｄｉａｃｍｙ ｏｃｙｔｅａｎｄｎｅｕｒｏｎ[1,2 ] .ＳｅｐｅｒａｔｉｏｎｏｆＭＳＣｓｉｓｒｅｌａ ｔｉｖｅｌｙｃｏｎ…     

人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定

目的：探讨从人胎盘组织中分离羊膜间充质干细胞（hAMSCs）。方法：收集剖宫产足月胎儿胎盘,采用组织块贴壁法分离出羊膜问充质干细胞并传代培养,对P1-P3代细胞进行细胞形态的观察,用流式细胞仪检测细胞膜表面阳性分子CD73．APC、CD90-FITC、CIM4．PE、CDl05．Cy5．5和阴性分子CDllb-PE、CDl9．PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE,并采用六孔板法检测细胞增殖情况。结果：hAMSCs的细胞形态呈成纤维状,hAMSCs在培养3-d达到对数增长期,通过流式检测,发现细胞可表达CD73、CD90、CD44和CDl05,未表达CDllb、CDl9、CD34,CD45、HLA-DR。结论：从体外成功分离培养出人羊膜间充质干细胞。     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞的实验研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外诱导分化为人汗腺细胞（hSGCs）。方法：体外分别分离培养hMSCs和hSGCs,原代培养hSGCs融合后,收集细胞,制备汗腺细胞匀浆,用含10%汗腺细胞匀浆的汗腺培养基来诱导培养hMSCs。1周后,检测诱导培养的hMSCs的抗原表达。结果：培养的hSGCs表达CK19和CEA;hMSCs表达CD44、105,不表达CK19、CD34和CEA。诱导培养1周,免疫细胞化学染色示诱导培养组少量细胞表达CEA和CK19,而对照组未见CEA和CK19阳性细胞;流式细胞仪检测CEA在诱导培养组的阳性表达率约为（6.2±1.2）%,对照组（0.9%±0.0）%（P〈0.05）。结论：在无完整汗腺细胞存在的情况下,hMSCs在体外也可诱导分化为hSGCs。     

人骨髓间充质干细胞向骨骼肌定向分化的研究

目的 研究人骨髓间充质干细胞在裸鼠损伤腿部向骨骼肌定向分化。方法 在裸鼠腿部注入无水酒精造成肌肉损伤，取培养人骨髓间充质干细胞用荧光染料Dil标记后注入损伤处，术后6d及12d取损伤部肌肉进行形态观察和免疫荧光标记。结果 在术后6d可见Dil标记细胞向骨骼肌分化，Myoglobin阳性表达。术后12d后可见新生骨骼肌出现典型横纹，细胞核MyoD1阳性表达。结论 在裸鼠损伤肌肉的微环境中，人骨髓间充质干细胞可向骨骼肌定向分化，并伴有Myoglobin及MyoD1阳性表达。     

自噬相关基因MAPLC3在放射损伤人骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)放射损伤后自噬水平的变化。方法利用X线8Gy照射体外培养的hBMMSCs,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 light chain 3,MAPLC3)的mRNA表达。结果正常对照组中MAPLC3呈低表达,而8GyX线照射后2h其表达明显升高(P<0.05)。结论 hBMMSCs放射应激时存在自噬的活化。