耐受调节性CD8+NKT细胞体外稳定性的研究

目的:探讨超抗原SEB活化并扩增的CD8+NKT细胞耐受调节功能的稳定性.方法:超抗原SEB活化并体外扩增的10 d、20d、30 d和冻存效应细胞被用于本研究.以正常C57BL/J鼠脾细胞为对照,将各个效应细胞与刺激剂刀豆蛋白(ConA)或脂多糖(LPS)共同培养72 h,测定效应细胞对刺激剂的应答反应能力.在正常小鼠淋巴细胞与上述刺激剂反应的同时添加各效应细胞,72 h后测定效应细胞抑制正常淋巴细胞对刺激剂的应答反应能力.体外扩增和冻存的效应细胞与异源鼠脾细胞做混合淋巴细胞培养,MTT法测定细胞的增殖情况.效应细胞用荧光抗体染色,用流式细胞术(FCM)解析NKT细胞亚群.结果:与正常淋巴细胞对刺激剂的应答反应能力相比,体外扩增10 d、20 d、30 d和冻存效应细胞对ConA或LPS的应答反应能力明显降低,细胞增殖的A值分别由正常值0.67和0.61分别下降至0.30和0.31,0.28和0.20,0.26和0.24,以及0.22和0.23(P＜0.05,n=3).效应细胞抑制正常淋巴细胞对上述刺激剂ConA或LPS的应答反应,分别由正常值0.67和0.61下降至0.33和0.39,0.30和0.43,0.36和0.43,以及0.26和0.29(P＜0.05,n=3).效应细胞与异源鼠脾细胞反应与对照组相比明显的降低,分别由正常值0.70下降至20d的0.42,30 d的0.42以及冻存效应细胞的0.54(P＜0.05,n=3).在这群效应细胞中,主要是CD8+NKT细胞,由原始的0.36%增加到41.59%(P＜0.05,n=3).结论:耐受调节性CD8+NKT细胞可以在体外进行传代培养,并且这些传代培养细胞的耐受调节功能依然存在.     

NK 细胞的高效扩增及其对体外肿瘤模型的杀伤效果研究

目的:高效扩增NK 细胞,并确定其对不同肿瘤的杀伤作用,为临床应用提供参考。方法:从成人外周血中分离PBMCs 并利用表面表达4-1BBL、IL-15 和IL-21 的K562 滋养细胞对其进行共刺激培养,15 d 后计数并检测CD3- CD56+细胞纯度;利用间接免疫荧光及Real-time PCR 方法检测NK 细胞Granzyme B 及Perforin 表达变化的同时检测其对肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌的杀伤作用,确定其对不同肿瘤的杀伤效果。结果:扩增15 d 后,细胞数量高于110 ‘,CD3-CD56+比例达95%以上;培养后的NK 细胞高表达Granzyme B、Perforin,且对A549 的杀伤效果(E:T=10 :1)约为90%,同时对其他肿瘤细胞(E:T=10:1)的杀伤效果由强到弱的顺序为:胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、肝癌(P<0.05);NK 细胞对宫颈癌、肝癌、胰腺癌的杀伤效果呈现一定的时间依赖性。结论:此方法可以扩增出高数量、高纯度的NK 细胞,同时该NK 细胞具有高效杀伤多种肿瘤细胞的能力。     

K652重组表达IL-6基因对NK细胞表型和功能的影响

目的:为了研究表达IL-6的重组K562细胞对自然杀伤细胞(NK)细胞的扩增数量、表型和功能的影响。方法:根据人类IL-6 c DNA的5'端序列,设计PCR引物以K562细胞c DNA文库的DNA为模板进行扩增,表达,转染,在K562细胞上表达IL-6基因,构建重组的K562工程细胞作为刺激细胞,以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增培养对象,使NK细胞在体外培养条件下得到大量的扩增。流式细胞仪分析NK细胞表型。将NK细胞作用到K562细胞,对其杀伤性进行功能分析,51Cr释放实验检测NK细胞对K562细胞杀伤水平的影响。结果:成功构建了表达IL-6的重组K562细胞,和PBMC共同孵育后,培养体系经过21 d的刺激后,IL-6重组K562细胞诱导PBMC扩增,CD56+CD16+CD3-细胞数量比诱导前扩增了(760±18)倍,CD56+CD16+CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的6%±0.4%,扩增后第3组结果比未扩增的多了91%±2%。细胞毒实验表明,在NK效应细胞∶K562靶细胞为5∶1时,扩增的NK细胞的杀伤率达到了92%±2%。结论:本方法以重组K562为刺激细胞,能够实现NK细胞体外的大规模制备,建立了优化的NK细胞体外扩增方法,且扩增的细胞杀伤K562细胞的活性较好。对于NK的大量扩增和应用于临床具有重要的指导意义。     

人外周血自然杀伤T细胞体外扩增及其功能的初步研究

为了建立人自然杀伤T(NKT)细胞在体外扩增的方法并对其功能进行初步的研究,通过不同的方法从人外周血单个核细胞(MNC)和纯化T淋巴细胞中扩增TCRVα24+/Vβ11+NKT细胞,并采用流式细胞术测定NKT细胞中IL-4、IFN-γ、TNF-α分泌水平。采用CD4/CD8免疫磁珠去除CD4+和CD8+细胞进一步纯化NKT细胞,并用DIOC18染色及流式细胞术测定NKT细胞杀伤活性。α半乳糖神经酰胺(α-Galcer)和IL-2可以使NKT细胞在体外扩增。扩增19d后,TCRVα24+/Vβ11+细胞比率最高上升到25.5%±7.2%,NKT细胞最大扩增倍数达到(1.51±0.91)×104倍。体外扩增的NKT细胞高表达TCRVα24、Vβ11、CD3、CD161,低表达CD56。在CD3单克隆抗体和IL-2刺激下,TCRVβ11+细胞分泌IL-4和IFN-γ的细胞比例均高于TCRVβ11-细胞(P<0.05)。去除CD4+和CD8+细胞后NKT细胞含量上升到80%。NKT细胞对肿瘤细胞株U937和HL60以及树突状细胞具有较强的细胞毒效应。NKT细胞可以通过α-Galcer直接从人外周血MNC扩增获得,从而简化实验步骤。     

肿瘤抗原联合CD40L致敏树突状细胞诱导CTLs杀伤K562细胞的实验研究

目的：以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导为树突状细胞（DCs），负载K562细胞冻融抗原，并联合CD40L诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对K562细胞的杀伤作用。方法:密度梯度离心法、贴壁法分离健康人外周血单核细胞，应用rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α等细胞因子诱导扩增，培养DCs，用K562细胞冻融抗原联合rhsCD40L致敏DCs。实验分4组：K562细胞冻融抗原致敏DCs为实验组A，联合CD40L致敏DCs为实验组B，未致敏DCs为对照组A，单核细胞+异体淋巴细胞组为对照组B，观察CTLs对K562细胞的杀伤效应。结果:培养出具有典型特征的DCs，表达CD40最高达96%、CD86达97%、CD80为77%、CD1a为 69%，体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。在效靶比为 20∶1 时，实验组A对K562细胞的杀伤率为71.3%，实验组B为86.9%，对照组A为37.6%，对照组B为21.1%。实验组均显示高水平杀伤率，与对照组比较差异显著（P＜0.05），实验组B加CD40L杀伤率高于实验组A（P＜0.05） 。结论：K562细胞冻融抗原冲击致敏DCs能有效诱导T细胞特异性抗白血病作用，联合CD40L能增强其CTL的杀伤作用。     

超抗原SEB活化耐受性NKT细胞亚群的研究

目的:探讨超抗原SEB活化的效应细胞参与免疫耐受的NKT细胞亚群及分化特征.方法:采用C57BL/J小鼠脾细胞经SEB诱导, 收集体外扩增10 d的淋巴细胞为效应细胞, 与刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)和白介素-2(IL-2)共同培养3 d, 测定效应细胞对刺激剂的应答反应能力.在正常小鼠淋巴细胞与上述刺激剂反应的同时添加效应细胞, 3 d后测定效应细胞抑制正常淋巴细胞对刺激原的应答反应能力.用MTT染色方法记录细胞增殖的A值.以ConA活化的淋巴细胞做参照, 用流式细胞术(FCM)解析了耐受性效应细胞中NKT细胞亚群并显示分化来源与功能的相关性.结果:与正常淋巴细胞对抗原应答反应能力相比, SEB活化的效应细胞对ConA、LPS和IL-2的应答反应能力明显降低, 细胞生长的A值从正常组的0.80±0.04、0.60±0.03和0.55±0.07下降到0.60±0.05、0.30±0.05及0.27±0.04 (P＜0.01, n=3).效应细胞抑制正常淋巴细胞对上述抗原的应答反应, 尤其抑制ConA 活化的T淋巴细胞的应答反应;A值分别由正常值降低到0.26±0.002、0.48±0.04及0.34±0.02(P＜0.01, n=3).效应细胞中CD4 NK1.1 、CD8 NK1.1 、TcRVβ8 /NK1.1 NKT细胞亚群显著增加(P＜0.05和P＜0.01, n=4).ConA活化的淋巴细胞是T淋巴细胞并包括CD4-CD8-/CD3 NK1.1 NKT细胞.结论:超抗原SEB活化的耐受功能与CD4 NK1.1 、CD8 NK1.1 、TcRVβ8 NK1.1 NKT细胞亚群有关, 它们由T细胞分化而来. CD4-CD8-/CD3 NK1.1 NKT细胞没有参与耐受性调节.     

TLR7激动剂增强人CIK细胞杀伤功能的研究

目的研究Toll样受体7(toll-like receptors 7,TLR7)激动剂(Tlr7a)对人细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller cell,CIK)杀瘤效果的影响。方法采集3名健康志愿者外周血,分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),按照常规CIK细胞培养(Control组)或day0额外添加Tlr7a(Tlr7a组)2种方案培养2周。采用细胞计数法检测细胞的增殖效率,流式细胞术检测细胞亚群的比例,CCK-8比色法检测CIK细胞对人红白血病细胞(K562细胞)的杀伤活性。结果与对照比,Tlr7a处理后,总细胞中主要效应细胞CD3+~CD56+~双阳细胞占比增加4.1%,分别为(11.9±2.9)%和(16.0±5.8)%。杀伤实验结果显示,当E∶T为20∶1时,2组细胞对K562杀伤率分别为(98.8±4.2)%和(74.4±12.3)%。相比于Control组,Tlr7a组的细胞杀伤功能明显增强(P0.05)。结论 TLR7激动剂(Tlr7a)具有增强CIK效应细胞的扩增能力,其刺激后获得的CIK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤效果更好。     

树突状细胞对脐血来源细胞因子诱导杀伤、自然杀伤细胞杀伤活性及CD45RO表达的影响

目的:探索同一来源脐血树突状细胞(DCs)对细胞因子诱导杀伤(CIK)、自然杀伤(NK)细胞杀伤活性和CIK细胞上CD45RO表达的影响。方法:通过细胞因子组合诱导、扩增脐血来源的DCs、CIK和NK细胞,杀伤效应细胞分为两组:A组为接受DCs共孵育6d刺激的CIK、NK细胞,B组为未接受任何刺激的CIK、NK细胞,了解DCs对相应效靶比下CIK、NK细胞杀伤K562、HL-60细胞株细胞毒活性的影响;通过流式细胞术检测两组CIK细胞上CD45RO、CD45RA的表达率。结果:随着效靶比的升高,脐血CIK、NK细胞对肿瘤细胞株的杀伤力增加。在20∶1、10∶1效靶比下,A组CIK、NK细胞对HL-60的杀伤率分别为76.77％±5.76％、55.87％±2.09％,B组为61.14％±3.72％、49.96％±1.51％,A组对HL-60的杀伤明显高于B组;在20∶1效靶比下,A组对K562的杀伤明显高于B组;而在10∶1效靶比下两组之间的杀伤活性未见显著差异;A组CIK细胞上CD45RO表达率显著高于B组。结论:DCs与CIK、NK细胞共孵育可提高CIK、NK细胞的细胞毒活性及增加CIK细胞上CD45RO的表达。     

肺结核患者CD3~+ CD56~+ NKT细胞对IL-2刺激的反应性研究

目的:观察IL-2刺激后肺结核患者CD3+CD56+NKT细胞活化的规律和增殖情况。方法:结核病患者和健康人外周血单个核细胞用IL-2刺激和培养不同时间,采用多色荧光染色和流式细胞术检测NKT细胞的CD69的表达率以及培养前后NKT细胞数量的变化。结果:肺结核患者外周血NKT细胞的比率在刺激培养前与正常人比较无明显差异;经IL-2刺激0、8、16、40和64 h后,患者组和正常组NKT细胞表面CD69的表达量均显著增加,但患者组NKT细胞的CD69表达水平高于正常组(P0.05);培养14 d后,患者组NKT细胞的数量扩增(108.69±59.22)倍,正常组NKT细胞的数量扩增(246.26±134.06)倍,明显高于患者组(P0.05)。结论:肺结核患者外周血NKT细胞在IL-2刺激后表现为高度活化和低增殖的特点。     

IL-23单独或联合IL-2对人PBMC增殖及抗白血病活性影响的研究

目的比较单独应用IL-23或联合应用IL-23和IL-2对人外周血单个核细胞(PBMC)增殖及抗白血病活性的影响。方法密度梯度离心法分离人PBMC,以不同的细胞因子培养液培养,MTT比色法测定PBMC的增殖情况及PBMC对白血病K562细胞株的杀伤活性,流式细胞术分析诱导前后PBMC的细胞表型变化。结果细胞因子各组培养PBMC 1 d、3 d、5 d后,PBMC的增殖以及对K562细胞的杀伤活性均增强(P<0.05),IL-23与IL-2联合后PBMC的增殖以及杀伤活性进一步增强(P<0.05);IL-23(50 ng/ml)与IL-23+IL-2(50 ng/ml+100 IU/ml)组作用于PBMC 5 d后,检测CD3+细胞为(80.7±4.37)%和(83.2±4.04)%,CD16+CD56+细胞为(8.4±0.28)%和(12.7±0.9)%,CD4+细胞为(45.2±1.4)%和(47.0±1.72)%,CD8+细胞为(34.5±2.53)%和(35.4±2.11)%;与对照组相比,两组对PBMC细胞表型的增加有显著性差异(P<0.05);两组间比较CD16+CD56+细胞的表达上有显著性差异(P<0.05),对CD3+、CD4+、CD8+细胞的表达以及CD4+/CD8+比值的变化无显著性差异(P>0.05)。结论 IL-23对PBMC的增殖,以及PBMC对K562细胞的杀伤均有促进作用,与IL-2联合有协同作用。IL-23单独或联合IL-2诱导后PBMC中CD3、CD16/56、CD4、CD8抗原的表达均增加,二者联合后可以进一步增加CD16/56抗原的表达。     

吸烟者外周血不同T淋巴细胞亚群在体外扩增中的异常增殖及功能研究

目的检测吸烟对外周血T淋巴细胞体外扩增培养过程中免疫杀伤细胞和调节性T细胞增殖和功能的不同影响。方法选择平均年龄30岁的男性吸烟者27例与不吸烟男性健康对照组16例,采用密度梯度离心法从外周血中分离淋巴细胞,添加抗CD3和抗CD28抗体,以及IL-2和IFN-γ等多种细胞因子扩增培养15 d,计算细胞的增殖率,并利用流式细胞术检测扩增后各组淋巴细胞中免疫杀伤细胞(CD3~+CD8~+细胞、CD3~+CD56~+细胞)以及调节性T细胞(CD4~+CD25~+细胞)的比率;CCK8法检测扩增后的免疫杀伤细胞对HeLa细胞的杀伤力,PCR方法检测扩增后淋巴细胞部分功能相关基因的表达。结果吸烟者外周血淋巴细胞增殖能力减弱,且免疫杀伤细胞所占比例低,调节性T细胞所占比例高;吸烟者细胞免疫杀瘤细胞的杀伤力明显低于不吸烟对照组,吸烟组淋巴细胞表达的TNF-α、颗粒酶、穿孔素和IFN-γ等均有不同程度降低,其中颗粒酶和颗粒溶解素下调较为明显;但吸烟组TGF-β1的表达量显著上调,约为对照组的7倍。结论吸烟导致扩增后的外周血淋巴细胞中免疫杀伤细胞所占比例减少,调节性T细胞比例增加,吸烟组TGF-β1的表达增加进一步抑制了免疫杀伤细胞的活化和增殖。     

人γδT细胞识别肿瘤抗原的分子机理研究

作者在自建体外扩增人γδT细胞的基础上,分析了γδT细胞识别肿瘤细胞的分子机理.主要结果:(1)γδT细胞能够杀伤K562、Daudi、XG-7等肿瘤细胞,杀伤率分别高达62±7.2%,73±8.7%和84±6.1%;(2)γδT细胞对正常淋巴母细胞(自体和异体)的细胞毒活性均低于20%;(3)抗热休克蛋白70(HSP-70)单克隆抗体可阻断γδT细胞对XG-7细胞的杀伤作用,但对Daudi,K562肿瘤细胞却无明显的阻断作用.提示γδT细胞可通过识别肿瘤细胞表面的HSP或相关分子,并以MHC非限制性方式杀伤肿瘤细胞.     

MAPK信号转导途径在Mtb-Ag激活的γδT细胞杀伤肿瘤细胞中的作用

目的：探讨MAPK信号转导途径在结核杆菌抗原(Mtb-Ag)活化的γδT细胞杀伤肿瘤细胞中的作用。方法：用Mtb-Ag刺激正常人PBMC以诱导γδT细胞扩增，并用磁珠阳性分选法分离高纯度的γδT细胞；用MTT比色法测定γδT细胞对肿瘤细胞系K562和Raji的细胞毒活性，并观察MEK／Erk特异性抑制剂PD98059和p38 MAPK特异性抑制剂SB203580，对细胞毒活性的阻断作用：用流式细胞仪检测肿瘤细胞诱导γδT细胞上CD69的表达，并观察PD98059和SB203580对CD69表达的抑制作用。结果：新鲜分离的PB-MC，用Mtb-Ag刺激培养第10天，用磁珠阳性法分离的细胞中γδT细胞的比率，分别为3．56％、74．63％和98．20％。PD98059可抑制γδT细胞的杀瘤活性，且对γδT细胞杀伤Fas低表达的K562细胞的抑制率(39．27％)高于对γδT细胞杀伤高表达Fas的Raji细胞的抑制率(26．58％)。PD98059还能明显抑制肿瘤细胞诱导γδT细胞表达CD69；而SB203580对γδT细胞的杀瘤活性和肿瘤细胞诱导的CD69的表达均无影响。结论：MAPK途径中的Erk通路(而不是p38通路)参与了γδT细胞对肿瘤细胞细胞毒活性的启动，且可能对γδT细胞的颗粒外吐作用较大，而对Fas／FasL介导的细胞毒活性的作用较小。MAPK途径的Erk通路可能还参与肿瘤细胞诱导γδT细胞的活化。     

不同原位肝移植模型大鼠的CD4~+CD25~+调节性T细胞数量变化的研究

目的建立稳定的大鼠原位肝移植模型,并检测大鼠外周血中CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)比例的变化。方法采用近交系成年雄性BN、LEW大鼠,改良"二袖套"法建立肝移植模型31例。术前随机分为3组:排斥组(LEW→BN,n=9),耐受组(BN→LEW,n=11),同基因组(BN→BN,n=11)。存活的受体分别于术后5 d、10 d、30 d取外周血,分离外周血中的单个核细胞,由流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg比例。并于相应时间点每组随机各处死2只,取肝脏标本观察病理学变化。每组选取5例来观察生存期,存活>100 d时各处死2只,取肝脏标本。结果中位生存期:排斥组14 d,耐受组112 d,同基因组129 d。耐受组与同基因组术后未见明显排斥反应。术后7 d,排斥组肝脏病理Banff评分Ⅲ级。肝移植早期,排斥组和自发耐受组的外周血中CD4+CD25+Treg比例均增加,术后10 d耐受组CD4+CD25+Treg比例明显高于同基因组(P<0.01)。术后30 d,耐受组CD4+CD25+Treg比例仍维持在较高水平。结论 BN与LEW大鼠组合可建立稳定可靠的急性排斥模型与自发耐受模型。CD4+CD25+Treg可能参与自发免疫耐受的形成。     

人血淋巴细胞亚群杀伤K562细胞活性的比较及其相互作用

应用单克隆抗体盤选法,从人外周血中分离出CD4、CD8、CD19(B)和CD57(NK)四种淋巴细胞亚群,发现各群细胞对K562肿瘤细胞均有杀伤活性,其中以CD57细胞的杀伤活性最强.CD4和CD57细胞混合培养后的杀伤活性超过两者之和,而CD8、CD19分别与CD57细胞混合培养后,杀伤活性与两者单独培养之和相比无显著性差异.结果表明,人外周血杀伤K562细胞活性受到多种亚群细胞的影响,因此常规用K562作靶细胞测定外周血NK活性所反映的可能并非单纯NK细胞的杀伤活性.     

耐受性CD8~+ NKT细胞体外增殖能力的鉴定

目的:利用CFSE标记细胞,流式细胞术(FCM)检测法,解析超抗原SEB活化的耐受性CD8+ NKT细胞在体外增殖的情况。方法:利用CFSE标记新鲜分离的C57BL/J鼠脾细胞,分别与ConA和LPS共同培养3d,收集细胞进行荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69分子的表达率和增殖能力。CFSE标记的鼠脾细胞与SEB共培养5d和10d后,荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69的百分数和增殖能力。SEB活化的第10天细胞经CFSE标记后在IL-2的协同作用下继续培养10d,荧光染色,FCM解析这群细胞的增殖能力、活性分子CD69的表达率和NKT细胞亚群的变化情况。结果:ConA、LPS和SEB三者均可以刺激小鼠脾细胞增殖。ConA和LPS在3d内可以使细胞增殖3代,且CD69的表达率为74.19%和41.56%;SEB在5d和10d内分别可以使细胞增殖5代和7代,细胞表面CD69的表达率为32.09%和48.66%。SEB活化的10d细胞可以在IL-2的协同下继续传代培养10d,可以增殖7代;这群细胞中CD8+ NKT细胞亚群,由原始的0.36%增加到38.58%;细胞表面CD69分子由正常值的0.11%提高到83.74%。结论:超抗原SEB活化的CD8+ NKT细胞可以在体外进行增殖培养,且这些细胞是活性化的细胞。利用CFSE标记细胞,FCM可以检测耐受性CD8+ NKT细胞在体外的增殖水平。     

超抗原SEB诱导的免疫耐受与细胞因子无关

目的 研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)诱导的耐受效应和耐受调节机制.方法 收集SEB活化10天的细胞,充分洗涤后做为效应细胞,分别与刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)和白介素-2(IL-2)共同培养,用MTT方法测定细胞的耐受性应答反应.正常淋巴细胞在与ConA、LPS、IL-2共同培养的同时添加效应细胞,用MTF方法测定效应细胞的抑制性应答反应功能.流式细胞技术解析耐受性效应细胞类型.结果 效应细胞对ConA、LPS和IL-2的应答反应能力明显降低(P<0.01,n=3),但保持对ConA的应答反应能力.效应细胞抑制正常淋巴细胞与ConA、LPS和IL-2的应答反应(P<0.01,n=3),尤其抑制ConA和IL-2诱导的细胞增殖.SEB活化的效应细胞中CD8+NK1.1+、TcRVβ8+NK1.1+和CD4+NK1.1+NKT细胞以及TcRVβ8+T、CD8+T细胞数量明显增加(P<0.01和P<0.05,n=4).结论 超抗原SEB诱导的耐受性应答反应是效应细胞的直接作用,与细胞因子无关;这些效应细胞能抑制T淋巴细胞增殖,并保存识别ConA的受体功能.     

不同刺激因子组合诱导NK细胞体外扩增及其功能的研究

目的探讨不同刺激因子组合对人自然杀伤细胞(NK细胞)体外扩增及其功能的影响。方法 VarioMACS分选健康成人外周血单个核细胞(PBMC)中的NK细胞,依据添加刺激因子的不同分为A组(IL-2)、B组(IL-2+IL-15)、C组(IL-2+IL-15+饲养细胞),饲养细胞为30 Gyγ射线照射后的同种异体外周血单个核细胞(allogeneic PB-MNCs,AlloMNCs),未添加任何刺激因子的细胞的作为对照组,在干细胞生长培养基(SCGM)中进行培养扩增14 d,第1天添加PHA及OKT3,第5天离心洗去;台盼蓝拒染法进行活细胞计数;流式细胞术检测分选及扩增前后CD56+CD3-NK细胞纯度;改良的MTT法检测NK细胞对K562、HO8910及PBMC的杀伤活性。结果经VarioMACS免疫磁珠阴性分选后NK细胞纯度由分选前的(9.2±2.9)%提高到(93.5±3.2)%,培养14 d后,除对照组NK细胞纯度降低外,其余组与扩增前无明显差异(P>0.05)。细胞扩增倍数分别为17.2±1.7、51.3±6.6和82.4±9.8倍,均显著高于对照组(5.7±1.2)(P<0.01)。实验组组间比较,C组明显高于A组和B组(P<0.01)。细胞杀伤实验表明,当效靶比为10∶1时,各组的杀伤活性显示为C组>B组>A组>对照组,C组扩增的NK细胞对K562及HO8910的杀伤率可分别达到(70.1±8.9)%和(64.6±6.2)%,显著高于对照组、A组(P<0.01)和B组(P<0.05),对PBMC的杀伤率仅为(4.2±1.2)%。结论经VarioMACS分选获得的NK细胞,在体外使用SCGM培养基培养,添加IL-2、IL-15和照射后AlloMNCs作为刺激因子,可获得高效扩增和有效活化的NK细胞,为NK细胞的肿瘤过继免疫治疗提供了一种简单有效的扩增高纯度NK细胞的方法。     

TLR7/8配体(R848)对人NK细胞杀伤功能的作用及其机制的探讨

目的研究R848对人自然杀伤细胞(NK)杀伤功能的作用及其机制。方法分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)、纯化NK细胞,加或不加R848进行培养。分别在0、2、6、24、48h收集培养细胞,流式细胞术检测R848对NK细胞表面活化分子CD25和CD69表达的影响;检测R848活化的NK细胞杀伤靶细胞K562的作用、通过检测颗粒酶A、B、穿孔素、TRAIL和NK细胞与靶细胞共孵育后CD107a/b的表达,探讨R848促进NK细胞的杀伤功能机制。结果 R848活化的NK细胞在培养24h时CD69和CD25分子的表达百分率和平均荧光密度达到峰值,随后活化分子的表达有所下降;R848活化的NK细胞对靶细胞的杀伤功能明显增强,TRAIL在不同NK细胞亚群的表达显著增加(P0.05)。当NK细胞与K562共孵育后,R848活化的NK细胞表面CD107a/b的表达较未刺激条件明显增加。结论 R848可直接作用于NK细胞促进其杀伤功能,其作用机制与NK细胞活化后释放颗粒酶和穿孔素增加,并且TRAIL的表达增加有关。     

急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞亚群的特征及临床意义

目的通过检测急性髓细胞白血病患者外周血各淋巴细胞亚群的分布,探讨该类患者免疫功能状况。方法通过流式细胞术检测健康对照组(n=20)、急性髓细胞白血病初发患者(n=31)及完全缓解期患者(n=31)外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞、TCRγδ+T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)、CD16+CD56+NK细胞比例;通过细胞杀伤实验分析NK细胞和γδT细胞的杀伤活性以及与Treg的关系。结果与对照组相比,初发白血病患者和完全缓解患者外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞比例无明显差异,但CD4+CD25+Treg比例明显增高,TCRγδ+T细胞和CD16+CD56+NK细胞比例明显下降。初发病患者NK细胞和γδT细胞具有杀伤活性,但Treg能明显抑制其杀伤活性。结论急性髓细胞白血病患者外周血γδT和NK细胞虽具有杀伤功能,但比例明显下降,Treg对其杀伤功能具有抑制作用。