小鼠HAX-1基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定

目的构建小鼠Hax-1基因的重组腺病毒载体,以期进一步进行系统性红斑狼疮模型BXSB小鼠的体内实验研究。方法用RT-PCR方法扩增小鼠全长Hax-1基因,经T／A克隆后,亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细菌中和AdEasv-1进行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转染AD-293细胞进行包装,扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度。RT-PCR鉴定重组腺病毒转染AD-293细胞后Hax-1的表达,同时进行野生型腺病毒的检测。结果经酶切及测序证实Hax-1基因重组腺病毒载体构建成功。PCR检测转染后AD-293细胞内Hax-1基因水平的表达,且无野生型腺病毒的产生。结论成功构建了含小鼠Hax-1基因的重组腺病毒载体,为探讨Hax-1的生物学功能奠定了基础。     

小鼠noggin基因的重组腺病毒构建与鉴定

目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR 方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP 报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果：酶切鉴定及 PCR 结果证明 noggin 基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6．3×10~(10)pfu/ml。结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体。     

重组HIV-1腺病毒伴随病毒的构建及表达

目的 构建带有ＨＩＶ－１ ｇａｇ或ｇｐ１２０基因的重组腺病毒伴随病毒ＡＡＶ－ＨＩＶ ｇａｐ或ＡＡＶ－ＨＩＶ ｇｐ１２０。方法 共转染法获取重组ＡＡＶ－ＨＩＶ;免疫酶法检测病毒滴度。结果 测定制备的重组腺病毒伴随病毒ＡＡＶｇａｇ４２,ＡＡＶＧＰ４２,ＡＡＶｇｒＲｊ６,病毒滴度在１０＾４～１０＾５范围。结论 构建了带有ｇａｇ和ｇｐ１２０基因的重组ＡＡＶ－ＨＩＶ,可以感染真核细胞并有较高的表达,可以用于做靶细胞,为发展新型的ＨＩＶ－１重组ＡＡＶ病毒载体活疫苗打下基础。     

抑制RAGE表达的siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性针对细胞膜上晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的小干扰RNA(siRNA)腺病毒载体,鉴定其对大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞RAGE表达的影响.方法 设计并合成针对大鼠RAGE基因的siRNA的靶DNA序列,克隆于穿梭载体pAdTrack中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,脂质体法转染至QBI293A细胞中包装,获得RAGE-siRNA的重组腺病毒,荧光显微镜观察RAGE-siRNA感染INS-1细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western印迹检测RAGE的蛋白表达.结果 成功制备RAGE-siRNA重组腺病毒,在INS-1细胞中RAGE-siRNA感染效率达到90 %以上,并能够抑制INS-1细胞RAGE的表达.结论 成功构建了携带RAGE的siRNA重组腺病毒载体,能有效沉默INS-1细胞中RAGE的表达.     

小鼠TERT启动子调控的CD80-SEA基因重组腺病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达鉴定

目的:构建小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体,并观察其介导的SEA和CD80在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中的表达情况。方法:采用AdEasy腺病毒体系,亚克隆mTERT核心启动子区至穿梭质粒pShuttle2,并在其上游插入myc-Max反应元件MMRE,用来调控SEA及CD80基因的表达,构建SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS,制备病毒并纯化,然后将病毒以感染复数为100的浓度分别感染肝癌细胞系Hepa1-6和成纤维细胞系NIH3T3。采用免疫荧光染色法检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况。结果:重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS感染的Hepa1-6肝癌细胞膜上能够共表达SEA和CD80;而病毒感染的NIH3T3细胞不能表达SEA和CD80。结论:成功地构建了mTERT启动子调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,能够调控SEA和CD80基因在肝癌细胞中的靶向表达,为进一步研究肝癌的靶向基因治疗奠定了基础。     

MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定

目的 构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体,并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响,为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具.方法 人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA;在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染表达MKRN1的HeLa细胞株,用RT-PCR法及Western 印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响,用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化.结果 成功构建了MKRN1的siRNA重组腺病毒载体;MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达,并显著上调细胞中端粒酶的活性.结论 构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性,从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具.     

小鼠p38MAPK重组腺病毒载体的构建及其在成骨细胞系中的表达

目的:利用AdEasyTM system构建携带小鼠p38MAPK基因的重组腺病毒,感染成骨细胞系MC3T3-E1,检测外源p38MAPK在细胞中的表达。方法:用PCR的方法扩增p38MAPK基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行测序。经BglⅡ和HindⅢ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-CMV-p38MAPK。将经PmeI线性化的pShuttle-CMV穿梭载体与pAdEasyTMDNA电穿孔共转化BJ5183重组细菌,获取重组腺病毒质粒Ad-p38MAPK,再将经PacI线性化的Ad-p38MAPK重组病毒骨架质粒转染AD293包装细胞,包装并扩增病毒。用Ad-p38MAPK感染小鼠MC3T3-E1成骨样细胞,以Western blot法检测p38MAPK在小鼠成骨细胞中的表达。结果:构建并包装表达p38MAPK蛋白的重组腺病毒,该重组腺病毒在体外能有效感染小鼠成骨细胞系MC3T3-E1并高表达p38MAPK蛋白。结论:成功地构建了携带小鼠p38MAPK基因的重组腺病毒,为研究p38MAPK在成骨细胞中的作用奠定了实验基础。     

小鼠淋巴细胞趋化因子重组腺病毒载体的构建及其在骨髓树突状细胞中的表达

经ＲＴ－ＰＣＲ克隆小鼠淋巴细胞趋化因子（Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ，Ｌｔｎ）的全长编码ｃＤＮＡ，将其置于ＣＭＶ启动子下游，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘ１ｃｗ。Ｌｔｎ重组腺病毒载体ｐＡｘ１ｃｗ．ＣＩｍＬｔｎ与经ＥｃｏＴ２２Ｉ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞，制备Ｌｔｎ重组腺病毒，扩增到的病毒滴度为３．６×１０９ｐｆｕ／ｍｌ。用重组ＧＭ－ＣＳＦ从小鼠骨髓中扩增到的树突状细胞本身并不表达Ｌｔｎ；体外感染Ｌｔｎ重组腺病毒后４ｈ即可经ＲＴ－ＰＣＲ检测到Ｌｔｎ的表达，其２４ｈ的细胞培养上清体外对ＣＤ４＋Ｔ细胞和ＣＤ８＋细胞具有显著的趋化活性，表明所制备的Ｌｔｎ重组腺病毒能有效介导Ｌｔｎ在树突状细胞中的表达，为研究Ｌｔｎ基因修饰的树突状细胞诱导Ｔ细胞免疫应答奠定基础。     

表达miR-10a的重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建表达miR-10a的重组腺病毒(adenovirus,Ad)载体.方法 用红色荧光蛋白mCherry基因替换穿梭质粒pDC316-EGFP-U6的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因.利用表达siRNA的策略,合成编码miR-10a的长链DNA序列,双链退火后克隆至pDC316-mCherry-U6获得pDC316-mCherry-U6-miR-10a.pDC316-mCherry-U6-miR-10a与骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒Ad-miR-10a,空斑形成实验纯化、扩增、滴定重组腺病毒.Ad-miR-10a感染HeLa细胞后在荧光显微镜下观察mCherry表达,用RT-qPCR检测miR-10a表达.结果 构建的pDC316-mCherry-U6-miR-10a序列正确,荧光显微镜下可见mCherry的表达,重组腺病毒Ad-miR-10a滴度为1.8 × 107pfu/mL,感染HeLa细胞后miR-10a表达较mock高40倍.结论 成功构建了表达miR-10a的重组腺病毒,siRNA表达策略可用于miRNA的人工表达.

Abstract：

Objective To develop a miR-10a-expressing recombinant adenoviral vector. Methods The EGFP gene in shuttle plasmid pDC316-EGFP-U6 was replaced by red fluorescent protein mCherry gene. Long DNA sequence coding miR-l0a was synthesized. After annealing, the double-stranded miR-10a-coding sequence was inserted into pDC316-mCherry-U6. The resultant pDC316-mCherryU6-miR-10a was co-transfected with adenoviral skeleton plasmid pBHGlox△E1, 3Cre into HEK293 cells. The replication-defective adenovirus Ad-miR-10a was purified, amplified, and tittered by plaque assay. The mCherry expression was detected by fluorescence microscope. The expression of miR-10a by Ad- miR- 10 a in HeLa cells was determined by RT-qPCR. Results The sequence of pDC316-mCherryU6-miR-10 a was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. mCherry expression could be detected under fluorescence microscope. The titers of Ad-miR-10a was 1.8 × 107 pfu/mL, and the level of miR-10a expression in HeLa cells infected with Ad-miR-10a was 40 times higher than that with Admock. Conclusion A miR-10a-expressing recombinant adenovirs Ad-miR-10a has been successfully constructed. The strategy for artificial expression of siRNA is applicable for expression of miRNA.     

表达miR-10α的重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建表达miR．10a的重组腺病毒（adenovirus,Ad）载体。方法用红色荧光蛋白mCherry基因替换穿梭质粒pDC316-EGFP—U6的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）报告基因。利用表达siRNA的策略,合成编码miR-10a的长链DNA序列,双链退火后克隆至pDC316,mCherry—U6获得pDC316-mCherry—U6-miR-10α。pDC316-mCherry-U6-miR-10α与骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒Ad-miR-10α空斑形成实验纯化、扩增、滴定重组腺病毒。Ad-miR-10α感染HeLa细胞后在荧光显微镜下观察mCherry表达,用RT—qPCR检测miR-10α表达。结果构建的pDC316-mCherry—U6-miR-10α序列正确,荧光显微镜下可见mCherry的表达,重组腺病毒Ad—miR-10α滴度为1．8×10^7pfu／mL,感染HeLa细胞后miR-10α表达较mock高40倍。结论成功构建了表达miR-10α的首组腺病毒．siRNA表达策略可用于miRNA的人工表达。     

BMP4-siRNA重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建靶向抑制骨形态发生蛋白BMP4基因RNA的siRNA腺病毒,为进一步研究其在乳腺癌骨转移中的作用打下基础。方法以PCR扩增获得BMP4全长片段,插入筛选质粒pSOS载体,同时设计6段靶向BMP4基因RNA的干扰片段,分别经酶切、连接及鉴定后获得pSOS-sirBMP4。脂质体转染293细胞,根据荧光表达量筛选获得干扰效率较高的4个干扰片段,插入穿梭质粒pSES-HUS,经重组、HEK-293细胞包装获得BMP4-siRNA腺病毒。感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,RT-PCR、Western blot检测其干扰效率。MTT法检测其对MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果筛选获得4个干扰效率较高的片段,插入穿梭质粒,经重组、包装获得腺病毒pAd-sirBMP4。感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231后,明显抑制BMP4的表达并促进MDA-MB-231细胞增殖。结论成功构建具有较高干扰效率的腺病毒pAd-sirBMP4,为进一步研究BMP4在乳腺癌中的作用打下基础。     

表达miR-10a的重组腺病毒的构建与鉴定

Objective To develop a miR-10a-expressing recombinant adenoviral vector. Methods The EGFP gene in shuttle plasmid pDC316-EGFP-U6 was replaced by red fluorescent protein mCherry gene. Long DNA sequence coding miR-l0a was synthesized. After annealing, the double-stranded miR-10a-coding sequence was inserted into pDC316-mCherry-U6. The resultant pDC316-mCherryU6-miR-10a was co-transfected with adenoviral skeleton plasmid pBHGlox△E1, 3Cre into HEK293 cells. The replication-defective adenovirus Ad-miR-10a was purified, amplified, and tittered by plaque assay. The mCherry expression was detected by fluorescence microscope. The expression of miR-10a by Ad- miR- 10 a in HeLa cells was determined by RT-qPCR. Results The sequence of pDC316-mCherryU6-miR-10 a was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. mCherry expression could be detected under fluorescence microscope. The titers of Ad-miR-10a was 1.8 × 107 pfu/mL, and the level of miR-10a expression in HeLa cells infected with Ad-miR-10a was 40 times higher than that with Admock. Conclusion A miR-10a-expressing recombinant adenovirs Ad-miR-10a has been successfully constructed. The strategy for artificial expression of siRNA is applicable for expression of miRNA.     

表达Cre酶复制缺陷型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建Cre-loxP条件性基因敲除系统中Cre酶的重组腺病毒表达载体,作为体细胞条件性基因敲除的基础,并为传统ES细胞条件性基因敲除提供新的选择。方法用pAd-easy系统在大肠杆菌内经同源重组的方法构建Cre酶的复制缺陷型重组腺病毒载体;W estern b lot方法鉴定Cre蛋白的表达。结果在大肠杆菌内构建出重组腺病毒质粒,在包装细胞系内包装出重组病毒颗粒;测定病毒滴度为106pfu/L;重组病毒在细胞内表达Cre蛋白。结论表达Cre酶的重组腺病毒载体构建成功,阳性重组质粒的鉴定方法得以改进,为进一步的体细胞Cre-loxP条件性基因敲除提供了基础。     

小鼠Hsp27基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

Hsp27是小分子量热休克蛋白亚家族的重要成员之一,主要参与细胞内蛋白质的折叠、抗凋亡、甾体激素合成、氧化应激及信号通路等生理过程。为进一步研究其生理与病理生理功能,本文构建了针对小鼠Hsp27基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体,并在AD-293细胞中与Hsp27超表达载体共同转染,观察其对Hsp27表达的影响。根据siRNA靶序列的设计要求,设计并合成针对小鼠Hsp27的siRNA靶DNA序列,克隆至穿梭载体pShuttle-H1中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染AD-293细胞,包装得到含siHsp27的重组腺病毒,在体外与Hsp27超表达载体共转AD-293细胞。通过酶切鉴定、序列测定和Westernblot鉴定,确定小鼠Hsp27siRNA重组腺病毒载体构建成功,且该重组腺病毒能降低67％的Hsp27蛋白表达。本文构建的针对小鼠Hsp27基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究Hsp27基因的功能奠定了基础。     

重组腺病毒载体vAd-tat的构建及其在细胞中的表达

目的 构建含HIV-1 tat基因重组腺病毒,观察在不同细胞中外源蛋白Tat的表达,作为DC抗HIV疫苗的基础.方法 通过PCR扩增,获得HXB2 tat的cDNA片段,定向克隆入腺病毒转移载体pTrack-CMV,线性化后转化含有腺病毒骨架pAd-easy-1的大肠杆菌BJ5183,获得同源重组的质粒prAd-tat,Pac Ⅰ酶切纯化后转染293细胞,包装成具有感染力的复制缺陷型重组腺病毒vAd-tat.结果 经PCR、酶切及DNA序列测定,插入片段大小、方向正确,获得具有感染力的含有HIV-1 tat基因的重组腺病毒;通过Western blot方法 检测,重组腺病毒在293细胞中表达出Mr,为15 000的蛋白.结论 成功构建了含有HIV-1 tat基因的腺病毒,并观察到该基冈在细胞中的表达.     

重组腺病毒HIV-1 vpr基因的构建和表达

目的 构建携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒,使CD4 T淋巴细胞C8166内源性的高表达Vpr蛋白.方法 利用AdEasy-1系统, 通过将含有目的 基因片段的穿梭载体pAdTrack-CMV-vpr和骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒Ad-vpr, 用脂质体法将重组质粒转染至HEK293A细胞包装, 获得重组腺病毒Ad-vpr, 荧光显微镜观察Ad-vpr感染C8166细胞GFP的表达 , Western blotting鉴定Vpr在C8166细胞内的特异性表达,流式细胞术检测Ad-vpr感染 C8166细胞的效率.结果 成功构建携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒 ,Western blotting结果表明重组腺病毒Ad-vpr感染的C8166细胞内源性的高表达Vpr 蛋白,流式细胞术检测结果表明Ad-vpr感染C8166细胞效率高(44.07±3.62)%.结论 成功构建出携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒,使C8166细胞内源性的高表达Vpr蛋白.     

小鼠CCR7基因重组腺病毒的构建及其在DC2.4的表达

目的构建含有小鼠趋化因子受体-7(CCR7)基因的重组腺病毒(AdCCR7),观察其体外感染DC2.4细胞效率。方法将小鼠CCR7基因克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,在BJ5l83菌内和骨架质粒pAdeasy-1同源重组,筛选阳性克隆;经线性化后转染HEK293细胞,获得含小鼠CCR7基因的重组腺病毒AdCCR7;TCID50方法检测病毒滴度,PCR法鉴定病毒DNA。带绿色荧光蛋白腺病毒(AdGFP)和AdCCR7分别感染DC2.4(GFP-DC2.4和CCR7-DC2.4),同时设未处理DC2.4为空白对照。流式细胞术(FCM)检测各组细胞表面分子CD11c,MHCⅡ,CD86及CCR7表达,趋化实验检测CCR7的功能。结果获得滴度约为l.4×1010pfu/ml重组腺病毒AdCCR7。AdCCR7感染DC2.4后,CCR7-DC2.4组与另外两组细胞比较CD11c、MHCⅡ及CD86的表达均无明显差异,但CCR7表达升高;其对趋化因子CCL19的趋化率可达44.7%~60.0%,明显高于其它两组。结论成功构建含小鼠CCR7基因的重组腺病毒AdCCR7,该病毒可感染细胞株DC2.4,增加细胞表面CCR7表达以及细胞对CCL19的趋化性,为进一步体内实验研究携带CCR7基因的未成熟DCs功能提供了工作基础。