1,25-二羟基维生素D3诱导HL-60细胞向成熟单核细胞的分化

目的:观察1,25-二羟基维生素D3对白血病细胞株HL-60的分化诱导作用及其分子机制。方法:实验于2005-08/11在中南大学湘雅二医院中心实验室进行。将细胞浓度为2×108L-1HL-60细胞,分别以0,10-9,10-8,10-7,10-6mol/L的1,25-二羟基维生素D3孵育72h,对照组加入等量的无水乙醇。Western印迹技术鉴定维生素D受体在各组HL-60细胞的表达;Wright-Giemsa染色观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞表面标志物CD14抗原的表达;反转录-聚合酶链反应法分析c-myc基因的表达。结果:①10-8mol/L1,25-二羟基维生素D3作用前后HL-60细胞均表达维生素D受体,且药物作用后维生素D受体的表达上调。②10-8mol/L1,25-二羟基维生素D3可明显诱导HL-60细胞向成熟单核细胞系分化,54.02%的细胞CD14表达阳性,对照组为5.23%(P<0.01)。③1,25(OH)2D3作用72h后,HL-60细胞的c-myc/β-actin比值为0.27,对照组为0.89,两者比较差异显著(P<0.01)。结论:①1,25-二羟基维生素D3可诱导HL-60细胞向成熟单核细胞分化,其受体维生素D受体参与了HL-60细胞代谢的调节。②1,25-二羟基维生素D3诱导细胞分化的同时伴随c-myc基因表达下调,表明c-myc基因表达下调是其诱导HL-60细胞分化的分子机制之一。     

1,25-二羟基维生素D_3诱导HL-60细胞分化并下调nm23基因的表达

目的　观察 1,2 5 二羟基维生素D3 [1,2 5 (OH) 2 D3 ]对白血病细胞株HL 6 0的诱导分化作用并探讨其机制。方法　通过MTT试验、细胞形态观察、表面标志分析和硝基四氮唑蓝 (NBT)还原反应 ,观察 1,2 5 (OH) 2 D3 作用后HL 6 0细胞增殖的改变和分化情况 ;通过流式细胞仪和RT PCR检测细胞周期和nm2 3基因表达的变化。结果　HL 6 0细胞经 1,2 5 (OH) 2 D3 作用后增殖受抑制、向成熟单核细胞系分化、细胞被阻滞在G1 期、nm2 3基因的表达下调。结论　 1,2 5 (OH) 2 D3 对HL 6 0细胞株具有诱导分化作用 ,其作用机制可能与下调nm2 3基因的表达有关。     

Wnt/β-catenin信号通路在1,25-二羟基维生素D3诱导人急性早幼粒细胞HL-60单核系分化中的作用

目的探讨Wnt/β-catenin信号通路在1,25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)2-hydroxyvitamin D3,1,25-(OH)2 D3]诱导人急性早幼粒细胞HL-60向单核系分化中的作用。方法分别采用不同浓度的1,25-(OH)2 D3在不同时间诱导HL-60细胞向单核系分化,确定最佳药物浓度和诱导时间;使用最佳药物浓度0.1μmol/L 1,25-(OH)2 D3诱导HL-60细胞72 h,采用流式细胞技术、细胞化学染色技术检测并观察HL-60细胞的分化方向、分化程度及细胞增殖受抑情况;western blot检测ICAT、TCF1、c-Myc、cyclin D1、β-catenin蛋白的表达水平及pRB蛋白的磷酸化水平;采用免疫荧光法检测β-catenin在细胞内的分布情况。结果0.1μmol/L 1,25-(OH)2 D3于72 h时可有效诱导HL-60细胞向单核系分化;G 0/G 1期细胞增殖明显受抑(t=4.769,P<0.001),且细胞增殖抑制率升高(t=4.84,P<0.001);瑞氏染色结果发现,与对照组比较,成熟单核细胞比例显著升高[(61.2±13.6)%vs(0.8±0.2)%,t=7.49,P=0.001];western blot结果表明,ICAT蛋白表达上调(t=9.917,P<0.01),TCF1、c-Myc和cyclin D1蛋白表达下调(t分别为54.54,54.64和29.24,P均<0.001);此外,pRB蛋白的磷酸化水平亦下调(t=150.6,P<0.001);细胞β-catenin蛋白表达水平无显著性变化(P>0.99),但其在核内的表达水平下降(t=9.77,P=0.01);免疫荧光检测结果显示,β-catenin蛋白呈胞浆聚集状态。结论1,25-(OH)2 D3通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,抑制HL-60细胞增殖并促进其单核系分化。     

1,25-二羟基维生素D3诱导HL-60细胞向成熟单核细胞的分化

目的：观察1，25-二羟基维生素D3对白血病细胞株HL-60的分化诱导作用及其分子机制。 方法：实验于2005-08／11在中南大学湘雅二医院中心实验室进行。将细胞浓度为2&;#215;10^8L^-1-HL-60细胞，分别以0，10^-9，10^-8，10^-7，lO^-6mol／L的l，25-二羟基维生素D3孵育72h，对照组加入等量的无水乙醇。Western印迹技术鉴定维生素D受体在各组HL-60细胞的表达；Wright-Giemsa染色观察细胞形态学变化；流式细胞术检测细胞表面标志物CDl4抗原的表达；反转录-聚合酶链反应法分析c-myc基因的表达。 结果：①10^-8mol／Ll，25-二羟基维生素D3作用前后HL-60细胞均表达维生素D受体，且药物作用后维生素D受体的表达上调。②10^-5mol/L，25-二羟基维生素D3可明显诱导HL-60细胞向成熟单核细胞系分化，54．02％的细胞CDl4表达阳性，对照组为5、23％（P〈0．01）。⑨l，25（0H）：D3作用72h后，HL-60细胞的c-myc／f3一actin比值为0、27，对照组为0．89，两者比较差异显著（P〈0．01）。 结论：①l，25-二羟基维生素D3可诱导HL-60细胞向成熟单核细胞分化，其受体维生素D受体参与了HL-60细胞代谢的调节。②1，25-二羟基维生素D，诱导细胞分化的同时伴随c-myc基因表达下调．表明c-myc基因表达下调是其诱导HL-60细胞分化的分子机制之一。     

HL-60细胞体外分化过程中表面抗原的改变

人早幼粒白血病细胞株(HL-60)在体外分别与1,25二羟维生素D3(1,25(OH)_2D_3)、维甲酸、二甲基亚砜(DMSO)和TPA共同培养5天后,在上述各分化诱导剂的作用下可向单核-巨噬细胞或粒细胞分化。在其分化前后,用抗单核-巨噬细胞或粒细胞的各种单克隆抗体进行间接免疫荧光检查,以比较诱导分化的白血病细胞与处于相应分化阶段的正常细胞抗原性是否相同。结果表明,TPA和1,25(OH)_2D_3(10~(-8)M)可诱导单核-巨噬细胞分化。组化分析证明,ANAE中度或强阳性的细胞经诱导培养后由原来的8％升至73％。但是,经1.25(OH)_2D_3诱导的细胞形态类似单核细胞,可与单克隆抗体FMC17及FMC32有较强的结合     

鼠尾草酸联合三氧化二砷对HL-60细胞的影响

鼠尾草酸（Carnosic acid，CA）是迷迭香的天然药效成分。近年研究发现，2．5—10．0μmol／LCA显著提高1，25（OH）2D3和全反式维甲酸（ATRA）对白血病细胞HL-60和U937诱导分化能力，而CA本身诱导分化能力有限。CA增强1，25（OH）2D3诱导白血病细胞向单核系成熟分化的能力与促进1，25（OH）2D3受体的表达有关。     

丙戊酸诱导白血病HL-60细胞凋亡及其对h-tert基因表达的影响

为了探讨丙戊酸（valproic acid,VPA）对白血病HL-60细胞诱导凋亡的作用及其可能的机制,采用细胞毒性试验（CCK-8法）观察不同浓度VPA在不同作用时间对HL-60细胞增殖的影响,采用荧光显微镜检及流式细胞术检测细胞凋亡,并观察VPA作用后HL-60细胞端粒酶亚单位h-tert基因、凋亡相关蛋白表达和caspase-3活性的变化。结果表明：VPA呈剂量依赖性抑制HL-60细胞增殖（r=-0.87）.,诱导细胞凋亡;同时,抗凋亡蛋白BCL-2表达明显下降,促凋亡蛋白BAX表达上调,caspase-3活性增强,h-tert mRNA表达逐渐下降,HL-60细胞的凋亡率与h-tert mRNA表达呈负相关。结论：VPA可抑制白血病HL-60细胞增殖,诱导细胞凋亡;VPA可能通过下调h-tert mRNA、BCL-2蛋白表达,上调BAX表达及增强caspase-3活性而发挥抗白血病作用。     

JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达及意义

为了研究JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达规律,探讨其在白血病细胞分化和凋亡中的意义及可能的作用机制,应用FCM检测HL-60细胞经ATRA（10^-6 mol/L）、Ara-C（10 ng/ml）、TPA（10^-8 mol/L）作用后2、4、6、8天CD13、CD14、CD15、CD11b改变及细胞周期变化;应用半定量RT-PCR及蛋白印迹技术检测JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达趋势以及相关凋亡因子Bcl-2、HSP27和HSP70的表达.结果表明：经上述药物分别处理HL-60细胞后,不同时段FCM相关指标检测结果证明其分别向粒、单核、巨噬细胞样分化.JWA基因表达呈时间依赖性升高;Bcl-2则呈时间依赖性下降;HSP70在ATRA及TPA组与JWA表达呈正相关,与Bcl-2呈负相关,而各组HSP27并无表达.ATRA处理HL-60细胞后JWA基因表达趋势与原代细胞相反,且不需要ATRA诱导分化作为前提.分别以Ara-C 10 ng/ml和Ara-C 20 ng/ml处理HL-60细胞后,JWA基因的表达呈反向变化,即前者呈时间依赖性增加,而后者则下降.结论：JWA基因在实现ATRA及TPA诱导白血病细胞分化和凋亡中可能具有双重调节作用;JWA基因表达的高低与Ara-C诱导分化作用及细胞毒作用有关;HL-60细胞与原代白血病细胞在诱导分化机制方面可能不尽相同.     

三氧化二砷对人胃癌细胞株nm23、P53基因表达的影响

目的 观察三氧化二砷（As2O3）对人胃癌细胞株nm23、P53基因表达的影响。方法 以As2O3作用于体外培养的人胃癌细胞株，通过免疫组化技术对nm23和P53基因编码蛋白的表达进行检测。结果 经As2O3作用的人胃癌细胞株nm23、P53基因编码蛋白表达减少（P〈0．05）。结论 As2O3具有下调nm23、P53基因编码蛋白表达作用。     

1,25(OH)2D3对6T-CEM细胞株维生素D受体表达的作用研究

除了经典的调节钙磷代谢外,1,25二羟基维生素D(1,25(OH)2D3)及其类似物还具有抗增殖、促分化、促进肿瘤凋亡等作用。本研究以人急性T淋巴细胞白血病细胞株6T-CEM为研究对象,观察1,25(OH)2D3作用前后维生素D受体(vitamin Dreceptor,VDR)mRNA和蛋白表达的变化,探讨其抗白血病的分子机制及用于白血病治疗的可行性。     

Effect of retinoids and 1,25(OH)2 vitamin D3 bound to their plasma transport proteins on growth and differentiation of HL-60 cells

We have compared the effect of physiological and pharmacological concentrations of retinoids and 1,25(OH)2 vitamin D3 bound to their plasma transport proteins upon the proliferation and differentiation of HL-60 cells. Concentrations of chylomicron remnant retinyl ester similar to that obtained in plasma after a vitamin A-rich meal reduced the proliferation in more than 50% of HL-60 cells. Pharmacological concentrations of chylomicron remnant retinyl ester completely blocked the proliferation of the cells, and induced differentiation in 60% of the cells after 5 days. Physiological and pharmacological concentrations of retinoic acid bound to albumin had comparable effects. In contrast to earlier published data, which have been obtained with retinoids dissolved in ethanol, our results suggest that physiological and pharmacological concentrations of retinol (i.e. retinyl esters in chylomicron remnants) are as active as retinoic acid in reduction of proliferation and induction of differentiation of HL-60 cells. Physiological concentrations of 1,25(OH)2 vitamin D3 bound to vitamin D-binding protein (DBP) and retinol bound to retinol-binding protein had only a small effect on differentiation and proliferation of HL-60 cells.     

The role of exogenous hRAR beta gene on the growth inhibition and differentiation induction of HL-60R Cells]

OBJECTIVE: To investigate the role of hRAR beta gene in HL-60R cells and in their response to retinoids. METHODS: By electroporation, the recombinant pcDNA3-hRAR beta plasmid was transfected into the hRNA beta gene not expressed human myleocytic leukemic cell line HL-60R. In the presence of RAR-selected agonist Ch55, the effect of RAR beta gene on HL-60R was studied by the efficiency of colony formation in soft agar, cell morphology NBT reduction assay and flow cytometry. RESULTS: The HL60R-hRAR beta cells with stable hRAR beta gene expression were obtained. The growth and colony formation in soft agar of HL60R-hRAR beta cells were remarkably reduced as compared with that of their parent cells, and the cells were induced into granulocytic differentiation by Ch55 treatment at 10(-7). CONCLUSION: The expression of exogenous hRAR beta gene in HL-60R cells could resume their sensitivity to retionoids in inhibiting cell proliferation and inducing granulocytic differentiation.     

原花青素诱导HL-60细胞分化及其机制的研究

本研究旨在探讨原花青素(proanthocyanidin,PAC)诱导人急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞分化的可能机制。用PAC 20 mg/L处理HL-60细胞24 h,CCK-8法检测细胞生长状况,分析PAC对HL-60细胞的增殖影响;应用光学显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术分析细胞周期变化和测定细胞分化抗原CD14、CD11b表达;Western blot检测P21、Cyclin D1和CDK4表达变化。结果表明,PAC 20 mg/L作用HL-60细胞24 h,细胞抑制率明显增高(73.2±1.5)%(P<0.01),髓系细胞分化抗原CD14表达明显增高(P<0.01),CD11b表达稍增高,细胞周期中G0/G1期细胞百分率明显增高(P<0.05),S期细胞明显减少(P<0.01);PAC 20 mg/L与HL-60细胞共培养4 h,部分细胞向成熟阶段细胞分化;PAC 20 mg/L处理HL-60细胞12、24和48 h,P21蛋白表达增加,Cyclin D1和CDK4蛋白表达降低。结论:PAC能抑制HL-60细胞增殖并诱导其分化,细胞周期阻滞于G0/G1,其机制可能与P21蛋白表达上调和Cyclin D1及CDK4蛋白表达下调有关。     

The influence of calciotrophic hormones on lymphocyte transformation and interleukin-2 production in human mononuclear cells

Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) display receptors for parathyroid hormone (PTH) and calcitonin (CT) and, when activated, express receptors for 1,25 dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3). The role of these receptors in unclear. It is well established that 1,25 dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) has a significant effect on lymphocyte transformation and interleukin-2 (IL-2) activity in PBMC's. We have proceeded to compare the effects of the calciotrophic hormones, 1,25(OH)2D3, 24,25 dihydroxyvitamin D3 (24,25(OH)2D3), 25 dihydroxyvitamin D3 (25(OH)D3), bovine (1-35)PTH (b(1-35)PTH) and salmon CT on both lymphocyte transformation and IL-2 activity in PBMC's from normal human volunteers. We have also sought an indication as to which subset of cells is responsible for the 1,25(OH)2D3 effect. Unlike the other calciotrophic hormones 1,25(OH)2D3 inhibited the proliferation of phytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (ConA) and pokeweed mitogen (PWM) stimulated cells. 1,25(OH)2D3 had a significantly greater effect on PHA induced cell proliferation and only inhibited cells with the T-helper/inducer (TH, CD4 + ve) phenotype, this suggested that 1,25(OH)2D3 may act selectively on the cells with CD4 + ve phenotype. In addition, of the calciotrophic hormones, 1,25(OH)2D3 had a greater effect on IL-2 activity. These findings indicate that 1,25(OH)2D3 and not the other calciotrophic hormones has a significant immunomodulatory effect.     

Studies of the effect of 1,25-dihydroxycholecalciferol on the proliferation and differentiation of the human promyelocytic leukaemia cell line HL-60

Treatment of the human promyelocytic leukaemia cell line HL-60 with 1,25(OH)2D3, the active metabolite of vitamin D3, led to a dose- and time-dependent inhibition of growth and 3H-TdR incorporation at the population level. A similar effect was noted at the single cell level in clonogenic assays and autoradiographic experiments. Flow cytometry indicated that there was an arrest of cells in the G0/G1 phase of the cell cycle. Parallel to the loss of proliferative capacity 1,25(OH)2D3 induced differentiation of HL-60 into monocyte/macrophages as measured by the enzyme NSE and the macrophage membrane antigen recognised by the monoclonal antibody EB11 as well as by morphological changes. These findings reinforce the concept of concordant induction of differentiation and loss of proliferative capacity and demonstrate that the latter occurs not only at the population level but also at the single cell level in this system. In limiting dilution assays in liquid culture there was evidence for positive interactions between HL-60 cells as untreated cells gave less colonies at low dilutions than would have been expected by Poisson statistical analysis. In the presence of 10(-8) M 1,25(OH)2D3 more complex growth parameters were noted indicating the involvement of both positive and negative cellular interactions.     

全反式维甲酸诱导白血病细胞分化对brd7基因表达的影响

为了探讨brd7基因与白血病细胞分化的关系及其在白血病细胞分化中的作用,本研究采用全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60和K562细胞系分化,通过Wright-Giema染色在显微镜下观察细胞形态学变化,应用流式细胞术分析细胞分化抗原CD11b的表达,以鉴定细胞分化程度,并在此基础上通过Western blot检测brd7基因在诱导分化前和细胞分化过程中蛋白表达水平的变化。结果发现,ATRA具有抑制HL-60细胞生长的作用,并可诱导HL-60细胞向粒系分化,在ATRA诱导细胞分化过程中HL-60细胞表面CD11b的表达水平逐渐上调,BRD7蛋白表达随着HL-60细胞的分化而增加;ATRA对K562细胞无诱导分化作用,brd7的表达也无明显变化。结论:随着HL-60细胞的分化,brd7基因表达上调,其机制有待进一步阐明。     

右旋柠烯对HL-60、K562白血病细胞体外作用的研究

本研究观察右旋柠烯（d-limonene，D-L）对HL-60和K562白血病细胞增殖凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。首先采用碘化丙锭染色法观察右旋柠烯对HL-60、K562细胞增殖的影响，再通过细胞形态学观察、流式细胞术分析、免疫细胞化学半定量测定突变型p53、bcl-2、bax基因的表达水平，系统观察D-L对HL-60、K562细胞体外诱导凋亡的情况。结果表明：D-L抑制HL-60和K562细胞的增殖，IC50均为0．75mmol／L，呈剂量时间依赖关系；D-L诱导HL-60、K562细胞凋亡；D-L在诱导HL-60细胞凋亡过程中随作用浓度增加，bcl-2的表达下降；D-L在诱导K562细胞凋亡过程中随作用浓度增加，突变型p53及bcl-2的表达下调，而bax的表达上调。结论：D-L抑制HL-60和K562细胞增值并诱导其凋亡；突变型p53，bcl-2，bax参与了D-L诱导凋亡的基因调控，     

米哚妥林对急性白血病细胞株HL-60细胞抑制效应的研究

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂米哚妥林(PKC412)对HL-60细胞株增殖和凋亡的影响及作用机制.方法:采用CCK-8法检测不同浓度PKC412对HL-60细胞增殖的影响;瑞士吉姆萨染色法鉴定PKC412对HL-60细胞凋亡的影响;qRT-PCR检测BCL-2、P53基因的mRNA表达,Western blot...     

慢病毒载体Venus在HL-60细胞应用的可行性研究

随着对急性髓系白血病(AML)发生、发展的基因机制深入研究,构建转染效率高且对细胞无毒性作用的载体变得十分重要。为了研究补体C3a的受体蛋白C3aR1(complement component 3a receptor 1)在AML中的作用,构建了携带C3aR1的第三代慢病毒载体Venus。本研究主要观察Venus慢病毒载体在急性髓系白血病中应用的可行性。采用磷酸钙沉淀法将重组载体Venus-C3aR1转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒,感染HL-60细胞,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)观察感染效率,用RT-PCR和流式细胞术鉴定感染后HL-60细胞C3aR1的表达情况。用CCK8法绘制细胞生长曲线、观察细胞诱导分化能力来判断慢病毒载体的细胞毒性作用。结果显示,流式细胞仪(FCM)检测慢病毒感染率>95%,感染后HL-60细胞上C3aR1表达明显增加,病毒包装成功。慢病毒感染前后细胞生长曲线及诱导分化能力无明显变化,说明慢病毒载体不影响HL-60细胞的一般生物学特性,无明显的细胞毒性作用。结论:Venus慢病毒载体对AML细胞株HL-60的感染效率高,能够整合到细胞基因组中实现目的基因的稳定表达。慢病毒感染对细胞无明显的细胞毒性作用,不会干扰靶基因在细胞株中功能,因此慢病毒载体可以为白血病细胞的研究提供可靠的技术支持。