骨膜蛋白基因敲除鼠正畸牙齿移动模型的建立及验证

目的:建立小鼠以及骨膜蛋白（PN）基因敲除小鼠正畸牙齿移动模型,并分析相关信号通路。方法:根据实验条件把小鼠分为4组:C57小鼠未加力组和加力组、PN基因敲除小鼠组上颌加力组和未加力组,每组5只,其中加力组加力5 d。处死后,显微CT扫描上下颌骨,并采用RT-PCR检测牙周膜中相关基因的表达水平。结果:与C57小鼠相比,PN基因敲除小鼠的牙槽骨出现明显的吸收,牙周膜连续性中断破坏。在C57小鼠中,加力组牙周膜中的PN、粘着斑激酶（FAK）和TGF-β1表达水平显著增强（P<0.05）;在基因敲除鼠中,加力组牙周膜中的FAK（P<0.05）和TGF-β1表达水平显著增强（P<0.01）;在同样加力的条件下,C57小鼠与PN基因敲除小鼠相比,TGF-β1显著降低（P<0.05）,FAK表达水平显著升高（P<0.01）。结论:PN是正畸作用下牙周膜的改建过程一个重要分子环节,发挥着转导调控作用,TGF-β1--PN--FAK信号通路参与调控正畸作用下牙周膜的改建过程。     

Smad3基因敲除小鼠肾Smad2和p-Smad2表达的变化

目的:观察Smad3基因敲除小鼠肾Smad2和p-Smad2表达的变化,探讨Smad3基因敲除小鼠肾是否有Smad2和p-Smad2代偿性增加.方法:4只Smad3基因敲除小鼠,10只野生型小鼠,应用免疫组织化学显色技术,检测Smad2和p-Smad2蛋白的定位和表达情况,并用Motic病理图像分析系统对图像进行半定量分析.结果:野生型小鼠肾Smad2蛋白在肾远端小管和肾集合管细胞胞质中有广泛弱表达,p-Smad2蛋白在肾远端小管和肾集合管细胞胞质、胞核中也有弱表达,而Smad3基因敲除小鼠的Smad2和p-Smad2的表达比野生型小鼠有显著升高.结论:Smad3基因敲除能引起小鼠肾Smad2和p-Smad2表达的代偿性增加.     

逆转录病毒介导的β－珠蛋白基因在小鼠骨髓单核细胞的表达

从小鼠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ股骨分离得到骨髓单核细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ，ＢＭＭＣ），并在体外建立了ＢＭＭＣ细胞培养体系。将携带有人β－珠蛋白基因及其增强子的逆转录病毒载体（Ｎ２ＡβＥ３６）经ＤＮＡ磷酸钙共沉淀转染单向性包装细胞系（ψ－２）收集抗Ｇ４１８阳性ψ－２细胞克隆的病毒上清，感染体外培养的ＢＭＭＣ，同时加入白介素－３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３，ＩＬ－３）、白介素－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）、红细胞生成素（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｐｏ）等造血调节因子以促进造血细胞的增殖及提高基因转移的效率。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析证实在小鼠ＢＭＭＣ中具有β－珠蛋白基因的整合与表达。     

产紫杉醇真菌N8菌株URA-3基因的敲除

目的 为了解决产紫杉醇小孢拟盘多毛孢真菌N8基因操作的筛选标记缺乏的问题,构建N8菌株营养缺陷型菌株.方法 通过基因同源重组的方法定向敲除N8菌株中尿嘧啶合成途径中关键基因URA-3基因,然后利用分子生物学方法和添加一定浓度5-氟乳清酸（5-FOA）、尿嘧啶的基本培养基筛选获得转化子.结果 尿嘧啶营养缺陷型菌株在含有5-FOA和尿嘧啶的培养基上可以正常生长而野生型N8菌株无法生长.结论 成功构建产紫杉醇真菌N8菌株的尿嘧啶营养缺陷型菌株,可为其后续的基因功能研究奠定基础.     

Stat 3信号通路蛋白在基因敲除小鼠方面的研究进展

Stat 3是信号转导和转录激活蛋白家族(Stat)成员.它是家族中唯一一个在小鼠胚胎期进行基因敲除导致死亡的转录因子,暗示了它在个体发育中所处的重要地位.文章阐述了Stat3蛋白的结构和相关的信号通路,以及在小鼠T细胞、巨噬细胞、皮肤、乳腺和神经系统等的组织特异性敲除对Stat3进行的功能研究,揭示了Stat 3在细胞分化、增殖、凋亡等方面重要的生理作用.     

小鼠胚胎干细胞药物代谢酶CYP3a11基因敲除的实验研究

目的研究小鼠胚胎干细胞药物代谢酶CYP3a11基因的敲除。方法根据已知小鼠的CYP3a11基因组DNA序列,从129品系小鼠E14胚胎干细胞基因组DNA中,通过PCR的方法分别获得用于构建基因敲除载体的0.65kb的5'-短臂(short arm,SA)和(3.3+4)kb的3'-长臂(long arm,LA)片段,通过常规分子克隆技术,构建完成针对小鼠药物代谢酶CYP3a11基因的替代型基因敲除载体pCR-CYP3a11_KO,并对载体进行酶切鉴定。将线性化的pCR-CYP3a11_KO载体通过电穿孔技术转入E14胚胎干细胞。G418药物筛选4～6周直至克隆形成,用PCR和Southern blot技术对筛选出的细胞克隆进行鉴定。结果酶切结果表明基因敲除载体pCR-CYP3a11_KO DNA序列正确;转染后的E14胚胎干细胞经过G418筛选后,存活的细胞可形成单克隆集落,经过PCR和Southern blot技术鉴定,其中有5个单克隆被证实CYP3a11基因已被敲除。结论成功构建了小鼠CYP3a11基因敲除载体,并在小鼠E14胚胎干细胞的CYP3a11基因敲除中获得阳性克隆。     

miR-29a基因敲除对C57BL/6小鼠肾小球结构和功能的影响

目的：观察微小RNA-29a(miR-29a)基因敲除对小鼠肾小球功能和结构的影响。方法：应用CRISPR/Cas9技术,选择C57BL/6 miR-29a基因敲除型(miR-29a knockout,miR-29a KO)小鼠作为实验组,未敲除型小鼠作为野生型(wild-type,WT)对照组(n=30)。分别在第3、12和24周收集小鼠24 h尿液。采用考马斯亮蓝染色法进行尿蛋白测定;ELISA测定尿白蛋白和尿肌酐水平,并计算尿白蛋白/肌酐比值(urinary albumin/creatinine ratio,UACR)。选取3、12和24周的小鼠,采用过碘酸雪夫氏(periodic acid-schiff,PAS)染色法观察肾脏组织的病理变化;通过透射电镜以及冷冻蚀刻电镜观察肾小球超微结构。另取2组24周的小鼠,一组小鼠腹腔麻醉后用Dynabeads^TMM-450 Tosylactivated微磁珠经心脏灌流后分离肾小球,用于RNA和蛋白的提取;另一组小鼠肾脏用于免疫荧光染色。采用RT-qPCR、免疫荧光染色以及Western blot检测小鼠肾小球足细胞标...     

β-珠蛋白基因簇表达调控的反式作用因子

β-珠蛋白基因簇是研究真核基因表达调控的良好模型,其基因表达具有红系组织特异性和不同发育阶段特异性。这些特异性的产生依赖于组织特异性表达的和发育阶段特异性表达的反式作用因子与顺式作用元件间的相互作用。     

Bcl3基因敲除对小鼠脾脏免疫细胞组成及抗肿瘤能力的影响

目的观察Bcl3基因敲除对小鼠脾脏免疫细胞的组成及抗肿瘤能力的影响。方法使用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立Bcl3基因敲除小鼠(Bcl3-/-), 血常规检验和流式细胞术检测Bcl3-/-小鼠的免疫细胞组成;建立B16F10黑色素瘤肺转移小鼠模型, 记录肺部肿瘤结节数和小鼠生存时间, 对比野生型(wild type, WT)小鼠和Bcl3-/-小鼠的抗肿瘤能力。结果 Bcl3-/-小鼠成功繁育成品系, 子代基因敲除纯合小鼠无胚胎致死现象, 且生长正常, 与WT小鼠相比外观、生长发育、繁育性能未见明显差异;主要脏器无明显异常, 但脾脏肿大且脾脏免疫细胞总数明显增加(P<0.05);血小板计数和中性粒细胞计数及百分比均显著低于WT小鼠;CD19+B细胞比例无明显改变, CD3+T细胞比例显著增加, 同时T细胞亚群(CD4+、CD8+、Treg)比例均呈明显上升趋势(P<0.05);固有免疫细胞中NK细胞(NK1.1+)和中性粒细胞(Gr1+)比例下降(P<0.05), DC(CD11b+)比例无明显变化;Bcl3-/-荷瘤小鼠的肺部可见大量由黑色素瘤细胞形成的肿瘤...     

人胎儿γ-珠蛋白基因的再活化及在β血红蛋白病治疗中的

在个体发育过程中,人β类珠蛋白基因的表达存在从胎儿(γ)到成人(β)珠蛋白基因的表达转换(或称开关).β-地中海贫血和镰刀型贫血症是两种最为常见的严重危害人类健康的单基因遗传病,通过诱导胎儿期血红蛋白(HbF,α2γ2)在成人期表达对该病的治疗是一种有效的策略.一些活化γ珠蛋白基因表达的转录因子和辅助因子已经被鉴定,一...     

β地中海贫血杂合子基因突变及Gγ珠蛋白基因-158位点SNP与Hb F的关系

目的　探讨 β地中海贫血 (简称 β地贫 )杂合子基因突变类型和 Gγ珠蛋白基因启动子 - 15 8位点 (Gγ- 15 8)单核苷酸多态性与胎儿血红蛋白 (fetal hemoglobin,Hb F)水平的关系。方法　抗碱 -比色法测定 Hb F水平 ;PCR-寡核苷酸斑点杂交法检测β地贫基因型 ;限制性内切酶 Xmn 消化经 PCR扩增的Gγ基因启动子 DNA片段 ,分析Gγ- 15 8位点的单核苷酸多态性。结果　 6 3例受检的轻型β地贫中 15例 Hb F≥ 2 % (2 .0 6 %～ 10 .4 4 % )。共检出 6种β地贫基因突变 ,分别是 :CD4 1/42 (- TTCT)、CD17(A→T)、nt- 2 8(A→ G)、CD71/72 ( A)、IVS- II- 6 5 4 (C→ T)、IVS- I- 1(G→ T)。 CD4 1/42、CD17、CD71/72、IVS- II-6 5 4的杂合子在 15例 Hb F升高组和 4 8例 Hb F正常组各自所占比例相同。 6 3例个体中有 10例为Gγ-15 8(C→T)突变的杂合子 ,总检出率为 15 .9% ;其中 15例高 Hb F个体中检出 8例 (检出率 5 3.33% ) ,HbF正常的 4 8例检出 2例 (检出率 4 .17% ) ,两组检出率差异有显著性 (P<0 .0 0 1)。结论　 β地贫基因突变CD4 1/42、CD17、CD71/72、IVS- II- 6 5 4与 β地贫杂合子的 Hb F水平无关 ;而 Gγ- 15 8(C→ T)突变与广西地区 β地贫杂合子 Hb F升高密切相关。     

β-地贫合并α珠蛋白基因三联体导致中间型地贫的家系分析与产前诊断

目的 探讨分析β-地贫合并α珠蛋白基因三联体导致中间型地贫的家系分析和诊断流程，总结中间型地贫的诊断策略及产前诊断临床实践。方法 通过家系成员血液学表型、常规地贫基因检测和PCR电泳法及珠蛋白基因测序技术分析β-地贫合并α珠蛋白基因三联体的临床表现；利用羊水细胞DNA对该家系1例地贫高风险胎儿进行产前诊断。结果 先证者检出β-地贫CD41-42杂合突变合并αααanti4.2三联体，父亲检出αααanti4.2三联体，母亲检出β-地贫CD41-42杂合突变，胎儿结果未见异常。结论 临床表现为中重度贫血的β-地贫杂合突变且未见罕见型变异，应结合临床表现与基因型是否一致，考虑可能合并α珠蛋白基因三联体导致的中间型地贫。     

GSK3抑制剂氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠的痛觉敏感性的影响

目的探讨氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠(KO鼠)的痛觉敏感性的影响及机制。方法 8周龄KO小鼠第1天测定热刺激缩足反射潜伏期(PWTL)值,作为基础痛阈,第2、3、4、5天连续腹腔注射氯化锂,给药30 min后测定PWTL值,第6天给药30 min后取腰骶膨大段脊髓组织,通过免疫印迹技术检测KO及WT鼠脊髓水平的GSK3β和P-GSK3β的变化。结果8周龄KO鼠的痛阈均比同周龄WT鼠的痛阈高。使用氯化锂后,KO鼠痛阈下降,且与WT鼠相比差异无统计学意义。8周龄KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的P-GSK3β的表达较WT鼠明显减少。使用氯化锂后,KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的P-GSK3β的表达增多,而WT鼠的变化不明显。8周龄KO鼠及WT鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的GSK3β的表达在用药前后均无明显改变。结论 KO鼠热痛觉阈值增高,热痛觉敏感性降低。KO鼠腰骶膨大段脊髓后角的P-GSK3β表达减少可能是KO鼠热痛觉敏感性降低的原因之一;氯化锂可能通过增加脊髓后角中的P-GSK3β的表达而改善KO的鼠热痛觉敏感性。     

14-3-3β基因与胃癌淋巴结转移的相关性研究

目的：探讨敲减及过表达14-3-3β基因对胃癌细胞生物学行为的影响及临床病理改变。方法在 SGC 7901、MGC 803和 HGC 27胃癌细胞系中,利用 RNA 干扰技术抑制14-3-3β基因的表达,分别用 MTT 法、基底膜侵袭实验检测胃癌细胞的增殖和侵袭能力的变化。结果在 HGC27和 MGC803细胞系中,14-3-3β基因的缺失会影响细胞增殖（ P 值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.001、0.000、0.005）,14-3-3β基因表达缺失的MGC803胃癌细胞侵袭能力降低（ P 值分别为0.000、0.000）。结论14-3-3β基因参与了胃癌细胞增殖和侵袭。     

建立载脂蛋白E基因敲除小鼠骨髓髓源性生长因子缺失模型及鉴定

背景:目前关于髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor,MYDGF)与动脉粥样硬化及代谢性疾病的研究较少,因此建立一种载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)敲除骨髓MYDGF缺失的小鼠模型对于研究MYDGF与动脉粥样硬化疾病的关系尤为重要。目的:建立ApoE敲除骨髓MYDGF特异性缺失小鼠模型并进行鉴定。方法:ApoE敲除小鼠和骨髓特异性MYDGF敲除小鼠,均购于上海南方模式生物科技股份有限公司。选取5只ApoE敲除小鼠与10只骨髓特异性MYDGF敲除小鼠进行交配,得到基因型为MYDGF^flox/+ApoE^flox/+F1子代小鼠30只,MYDGF^flox/+ApoE^flox/+互相进行交配,一共得到基因型为MYDG F^flox/floxApoE^flox/flox双敲除小鼠30只和ApoE^flox/flox小鼠子代小鼠34只。采用PCR法进行MYDGF^flox及...     

小鼠NGE基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的：构建小鼠β-NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法：用基因重组技术，将小鼠β-NGF的成熟cDNA序列及其前导序列，克隆到真核表达载体pcDNA3．1 中，用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENET^TM6方法，转染NIH3T3细胞。转染后72h，用G418筛选阳性克隆并培养至20d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Western blot分析并观察该上清中NGF对PCI2细胞突起生长的作用。结果：β-NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论：重组真核表达载体PcDNA3．1 ／NGF构建成功，NGF蛋白在NIH3T3细胞中表达，并具有良好的生物学活性，为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础。     

hCGβ与鼠补体片段C3d的连接及其在真核细胞中的表达

目的:构建含新型分子佐剂C3d的hCGβ真核细胞表达质粒,以提高hCGβ的免疫原性。方法:用pcr方法在hCGβ cDNA3’端引入BamHI位点,然后利用酶切位点的互补性,与C3d3　cDNA连接,构建了pBS-hCGβ-C3d3质粒,最后插入真核细胞表达质粒pcDNA3的CMV启动子下游,以产生pcDNA3-hCGβ-C3d3。将此融合质粒转染瞬时表达系统 COS-7细胞表达相应产物。其无血清培养上清液用免疫亲和层析法纯化重组蛋白。Raji细胞免疫细胞化学技术鉴定表达产物准确性。结果:真核细胞瞬时表达系统 COS-7细胞经转染了pcDNA3-hCGβ-C3d3质粒后,可分泌hCGβ重组蛋白。1.0×105个 COS-7细胞转染了pcDNA3-hCGβ-C3d3质粒,经72h培养后,可产生152ng的hCGβ重组蛋白,且表达量随时间延长而增高。在有血清培养基中的分泌量明显高于无血清培养基。同时,用Raji细胞免疫细胞化学分析表达产物显示,纯化的表达产物既有C3d结合受体活性,亦有hCGβ抗原性。结论:利用新型分子佐剂C3d与hCGβ的连接,构建了pc-DNA3-hCGβ-C3d3真核细胞表达质粒,为提高hCGDNA免疫避孕疫苗的免疫原性及抗生育作用奠定了基础。     

云南傣族儿童中β-地中海贫血HBB基因的变异分布特征

目的 探讨云南傣族人群中β-地中海贫血β珠蛋白基因(hemoglobin beta gene,HBB)变异分布特点.并建立检测相应常见变异位点的快速筛查方法.方法 获取209例云南傣族儿童β-地中海贫血阳性样本,用DNA序列测定的方法对包含有β珠蛋白基因(HBB)在内的1755bp DNA片段进行基因变异分析.建立检测3个常见变异位点的碱基突变特异性扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS),并对引物及扩增条件进行优化.结果 209例样本中共发现9个变异位点,按频率由高到低分别是CD2 T＞C(50.72%)、CD26 G＞A(35.41%)、CD17 A＞T(12.92%)、ⅣS-Ⅱ-17 C＞G(12.44%)、ⅣS-Ⅱ-16 G＞C(11.96%)、ⅣS-Ⅰ-30 A＞G(9.57%)、CD6G＞A(9.09%)、CD41-42(-TCTT)(7.18%)、CD5 T＞A(1.92%),有153人被检测出基因变异位点,占总人数的73.21%.引入错配碱基的ARMS引物,在65℃的退火温度能对CD2、CD26和CD17 3个常见变异位点进行特异筛查.结论 云南傣族β-地中海贫血人群中HBB基因的变异位点有其自身的特点,与其他地区有所不同.ARMS检测云南傣族β-地中海贫血基因变异是一种准确有效并简便经济的方法.

Abstract：

Objective To characterize the distribution of variation in hemoglobin beta gene ( hemoglobin beta gene, HBB )of β-thalassemia in Dai minority group in Yunnan province, and to establish a rapid and economical method for screening β-thalassemia mutation via optimizing ARMS technique.Methods DNA Sequencing was performed to detect variation in 1755 bp DNA fragment containing whole length of hemoglob beta gene ( 1606 bp) from 209 cases of Dai children with β-thalassemia. The primer design and PCR conditions of ARMS (amplification refractory mutation system ) have been optimized for detecting three frequent variations. Results Among 209 samples, there are 9 variations were detected:CD2 T＞ C (50.72%),CD26 G ＞A (35.41%),CD17 A ＞T(12.92%),IVS-Ⅱ-17 C ＞ G (12.44%), IVS-Ⅱ-16 G＞C(11.96%), ⅣS-Ⅰ-30 A＞G(9.57%) , CD6 G ＞A(9.09%) ,CD41-42 (-TCTT) (7. 18%) and CD5 T＞A(1.92%). Three mutations (CD21, CD35 and CD43) were first reported in China. There are 167, out of 209 participants (79.90%), carrying HBB gene variation. Three common mutations (CD2, CD26 and CD17 ) can be efficiently detected by combining condition of both ARMS mismatch primers and 65 ℃ of PCR annealling temperature. Conclusion The distribution of HBB gene variation in the Dai minority group in Yunnan province is different from those of other groups in China. ARMS is an effective, convenient and economical technique for rapid detection of gene mutations of β-thalassemia.     

敲除H2-eb1基因建立的变应性鼻炎模型小鼠

背景：HLA-DRB1与变应性鼻炎发病发病有关,构建HLA-DRB1基因敲除动物模型,不仅为阐明变应性鼻炎发病机制、同时也为相关疾病发病机制的阐明提供了良好的途径,然而未查阅到利用H2-eb1基因敲除小鼠进行相关研究的报道。 目的：构建HLA-DRB1基因敲除动物模型。 方法：经杂合子小鼠近亲繁殖,获得纯合子、野生型和杂合子小鼠。经基因及蛋白鉴定确认,采用随机数字表法选取8周龄雌性野生型(H2-eb1+/+)小鼠12只和H2-eb1-/-小鼠12只,将12只H2-eb1+/+小鼠和12只H2-eb1-/-小鼠以卵清蛋白致敏激发,建立小鼠变应性鼻炎模型。将另12只H2-eb1+/+小鼠以PBS代替卵清蛋白激发作为对照。 结果与结论：与对照小鼠相比,变应性鼻炎模型小鼠血清中卵清蛋白IgE、白细胞介素4水平明显升高,γ-干扰素水平明显降低;而与基因敲除野生型小鼠(H2-eb1+/+)相比,基因敲除H2-eb1-/-变应性鼻炎小鼠IgE、白细胞介素4水平较低,γ-干扰素水平较高。提示H2-eb1基因在变应性鼻炎的发病机制中的Th1/Th2失衡有重要调节作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程     

小鼠NGF基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建小鼠 β NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法 :用基因重组技术 ,将小鼠 β NGF的成熟cDNA序列及其前导序列 ,克隆到真核表达载体 pcDNA3.1+中 ,用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENETM6方法 ,转染NIH 3T3细胞。转染后 72h ,用G4 18筛选阳性克隆并培养至 2 0d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Westernblot分析并观察该上清中NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果 :β NGF基因在NIH 3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论 :重组真核表达载体 pcDNA3.1+/NGF构建成功 ,NGF蛋白在NIH 3T3细胞中表达 ,并具有良好的生物学活性 ,为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础