乙型脑炎病毒(JEV)ELISA检测方法的建立

目的建立猪乙型脑炎病毒（JEV）抗体ELISA检测方法。方法培养BHK21细胞,接种JEV病毒,制备BHK21正常抗原和JEV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0.2μg/mL、10μg/mL和1∶20000;正常、特异抗原批内变异系数分别为8.3%和6.4%,批间平均变异系数分别为9.7%和11.5%;检测灵敏度为1∶1280;与猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于猪JEV抗体的检测。     

实时荧光聚合酶链反应技术在病原体检测方面的应用

聚合酶链反应（PcR）已经成为分子生物学实验室的重要工具，实时荧光聚合酶链反应技术以其定量准确、敏感性高、重复性好、速度快和污染少使PCR技术又向前迈进了一大步。本文对其目前在临床常见细菌或病毒检测中的主要应用进行综述。     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

Allglo探针与TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测猴免疫缺陷病毒的比较

目的比较Allglo 探针和TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测SIV 的灵敏度下限和重复性。方法把SIV 标准品进行梯 度稀释成6 个浓度,每个浓度同时提取12 个标本进行批内差异分析,每个标本提取12 次进行批间差异分析之后进行逆转录 并用TaqMan探针和Allglo 探针进行定量PCR检测。批内差异分析者每个标本同时进行逆转录和上机检测,批间差异分析 者分12 次进行逆转录和检测,对这两种探针的PCR结果利用ABI7300 定量PCR仪所携带的软件和相关的统计学方法进行 分析。结果TaqMan 探针和Allglo 探针法检测SIV 标准品的灵敏度下限均为50 copies/mL。重复性结果显示：批内结果差 异分析显示Allglo 探针法最大变异系数为0.63%,最小变异系数为0.33%,TaqMan 探针法最大变异系数为1.33%,最小变异 系数为0.2%;批间结果差异分析显示Allglo 探针法最大变异系数为1.77%,最小变异系数为0.95%,TaqMan探针法最大变异 系数为1.86%,最小变异系数为1.03%。结论在荧光定量RT-PCR 法检测猴免疫缺陷病毒中,Allglo 探针法可能优于 TaqMan探针法。     

TaqMan RT—PCR检测HAV方法的建立

目的建立以TaqMan为特点的RT—PCR检测。方法本研究利用反转录酶将病毒RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板用Taqman探针法进行RTPCR扩增反应，进行病毒核酸定性检测。结果本研究分别选用0．14、0．16．0．18、0．2（μmol／L）的浓度。当退火温度为56℃时荧光强度最强，反应的灵敏度最好。CV值的最大为1．66％，〈5％。结论本研究建立的TaqMan RT-PCR方法高特异性，简单．重复性好，避免假阴性，宜应用于甲肝的病原型监测。     

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。     

扎伊尔型、苏丹型埃博拉病毒TaqMan探针实时定量PCR核酸检测方法的建立

目的建立针对扎伊尔型(ZEBOV)及苏丹型埃博拉病毒(SEBOV)特异、灵敏和快速的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法。方法选用世界卫生组织(WHO)参比实验室所使用的引物和探针序列,建立针对扎伊尔型及苏丹型埃博拉病毒的NP基因序列保守区的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,验证检测方法的灵敏性、特异性和稳定性,并与常规PCR检测方法进行比较。结果所建立的实时定量PCR方法可用于ZEBOV及SEBOV的特异性检测,较传统PCR方法反应快捷、灵敏,分别可达:ZEBOV 34拷贝/反应、SEBOV 24拷贝/反应;具有良好的特异性、稳定性和可重复性。结论建立了ZEBOV及SEBOV Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,该方法可有望用于埃博拉病毒(EBOV)的实验室、临床及现场核酸检测。     

逆转录—多聚酶链反应检测丙型肝炎病毒RNA方法的建立及实…

对逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＲＮＡ）的方法学进行了探讨，逆转录与多聚酶反应是否在同一反应管内进行，对ＨＣＶＲＮＡ检测结果没有明显影响，但在操作难易程度，ＴａｑＤＮＡ聚合酶的选择等方面有差别，在防止污染的前提下，套式ＰＣＲ可提高ＨＣＶＲＮＡ检出率（７．８３％）这对于极低水平ＨＣＶ感染的诊断十分重要，本文对受检标本的贮存方法也进行了初步探讨。     

风疹病毒RNA Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法及参考标准的建立

目的建立风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。方法设计引物与探针,优化PCR条件,建立风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法,并制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。结果制备的风疹病毒特异性扩增子参考标准品为503 bp的片断,原液浓度为2.75×109copies/μl,纯度为92%;采用该特异性扩增子参考标准品建立的标准曲线相关系数r为-0.9993（r2=0.9986）,P〈0.001。结论本研究建立的风疹病毒特异性扩增子参考标准品稳定性好,纯度高;特异性扩增子参考标准品浓度的对数值与Ct值之间具有良好的线性关系,证实了本研究建立的风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法定量的准确性。因而,建立的风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法简便快捷、定量准确,可用于临床标本中风疹病毒RNA的定量检测。     

Development of Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction for the Detection of Vibrio vulnificus Based on Hemolysin （vvhA） Coding System

Objective To establish a TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR to detect Vibrio vulnificus based on the hemolysin gene （vvhA） coding cytolysin. Methods Primers and probes in the conserved region of the vvhA gene sequence were designed for the TaqMan real-time PCR to detect 100 bp amplicon from V. vulnificus DNA. Recombinant plasmid pMD19-vvhA100 was constructed and used as a positive control during the detection. Minimal amplification cycles （Ct value） and fluorescence intensity enhancement （ARn value） were used as observing indexes to optimize the reaction conditions of TaqMan real-time PCR. The TaqMan assay for the detection of Vbirio vulnificus was evaluated in pure culture, mice tissue which artificially contaminated Vibrio vulnificus and clinical samples. Results The established TaqMan real-time PCR showed positive results only for Vibrio vulnificus DNA and pMD19-vvhA100. The standard curve was plotted and the minimum level of the vvhA target from the recombinant plasmid DNA was 103 copies with a Ct value of 37.94±0.19, as the equivalent of 0.01 ng purified genomic DNA of Vibrio vulnificus. The results detected by TaqMan PCR were positive for the 16 clinical samples and all the specimens of peripheral blood and subcutaneous tissue of mice which were infected with Vibrio vulnificus. Conclusion TaqMan real-time PCR is a rapid, effective, and quantitative tool to detect Vibro vulnificus, and can be used in clinical laboratory diagnosis of septicemia and wound infection caused by Vibrio vulnificus.     

实时荧光定量TaqMan-PCR检测小鼠多瘤病毒方法的建立

目的 建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)荧光定量 TaqMan PCR检测方法, 用于MPyV核酸的检测。 方法 根据GenBank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性引物及TaqMan探针, 扩增长度为69 bp的片段, 通过优化反应体系和反应条件, 对构建的重组质粒标准品进行检测, 并绘制标准曲线, 进行特异性、敏感性和重复性试验。最后用建立的方法对人工感染MPyV的肺脏、脾脏和粪便, 及86 份小鼠临床样本进行检测, 验证在临床应用中的效果。 结果 所建立的检测方法特异性强, 只能在小鼠多瘤病毒DNA中检出荧光信号, 检测灵敏度达到100拷贝, 批内和批间重复性好, 检测结果变异系数(CV)均小于1.13%, 人工感染MPyV小鼠的肺脏、脾脏和粪便均为阳性, 对86份临床样本进行检测, 有3份样本呈阳性(阳性率为3.5%)。 结论 建立的MPyV荧光定量TaqMan-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好, 适合用于MPyV临床诊断、日常监测和流行病学调查。     

大鼠疑似泰勒氏病毒荧光定量检测方法的建立

目的 建立一种能在临床上快速、准确地检测大鼠疑似泰勒氏病毒（Theiler''s-like virus of rats,TLV）的方法,采用TaqMan探针荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）技术,特异性针对TLV病毒核酸进行检测。方法 通过基因合成序列作为质粒标准品的模板,同时选择特异性的序列在3622~3729 nt处,设计一对引物和TaqMan性探针,优化反应体系及条件,进行qPCR扩增,从而建立TLV TaqMan探针qPCR方法,并对其灵敏度、稳定性和特异性进行评价。结果 建立的TLV qPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R²值可达到0.99,灵敏性最低能够检测到10个拷贝数/μL,对比普通PCR方法,高出其100倍;对其他常见大鼠病毒均无非特异反应;重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%。结论 利用TaqMan探针建立快速检测TLV的荧光定量PCR方法,该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性好等特点。     

荧光定量RT—PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A、B型流感病毒的方法。方法根据A型流感M基因和B型流感HA基因的相对保守序列,分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化单一和双重反应体系后,利用10倍稀释法对已知滴度的流感病毒进行梯度稀释,检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线。结果A、B型流感病毒双重反应的灵敏度为分别为2·56×10-5和5·0×10-5TCID50,标准曲线相关系数分别为0·997和0·998,扩增效率分别为114·1%和107·8%,说明双重反应中A、B型的引物、探针、模板之间无相互干扰,具有很好的稳定性和重现性。结论研究建立的荧光定量RT-PCR技术可以准确同时检测A、B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。