VEGF靶向性siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的：构建针对VEGF的siRNA表达载体,转染入人骨肉瘤细胞系MG-63观察其对细胞VEGF表达的沉默效应.方法：设计VEGF发卡样siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入T载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染骨肉瘤细胞MG-63,用RT-PCR方法检测细胞VEGF mRNA表达水平.结果：把针对VEGF基因的siRNA的双链寡合苷酸片断克隆到表达载体pSuperneo,经过酶切鉴定与测序,结果正确;稳定转染人骨肉瘤细胞系MG-63后,用RT-PCR方法检测细胞VEGF mRNA表达水平明显降低.结论：成功构建出针对VEGF的siRNA表达载体pSuper-neo-VEGF,转染骨肉瘤细胞后能显著降低细胞VEGF mRNA表达.     

VEGF真核双表达载体构建及对Lewis肺癌体外侵袭能力的影响

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)基因转染后对Lewis肺癌细胞体外侵袭能力的影响.方法利用基因重组技术构建了含全长 VEGF cDNA的真核双表达载体,脂质体法转染Lewis肺癌细胞株.借助Boyden小室膜侵袭培养系统观察转染后Lewis肺癌细胞对基底膜侵袭能力的改变.结果转染后下室浸润的癌细胞数为(48±1.0),显著高于空载体转染对照组(27±0.4)(P<0.05), 表明转染pEGFP-VEGF表达载体的Lewis细胞系侵袭能力增强.结论 VEGF诱导Lewis肺癌转移的机制可能与增强肿瘤细胞的迁移能力有关.     

VEGF165表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用

目的构建血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF165）真核表达载体,研究其对胃癌生成的作用. 方法用DNA重组方法,将编码VEGF165的全长cDNA克隆于pcDNA3载体中,构建VEGF165 mRNA真核表达载体;用阳性脂质体介导的基因转染技术,将重组体转入人胃癌细胞（SGC-7901）省系;观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学指标. 结果斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,正义VEGF基因转染技术可使VEGF的表达得到明显地加强. 与未转染细胞相比,转染细胞的G2/M期细胞增加(0.44)而S期细胞减少(0.17),克隆形成率(9.0%)明显高于未转染细胞(4.0%). 瘤细胞接种裸鼠后33 d,过表达VEGF人胃癌细胞所致的移植瘤体积（2351±638) mm3明显大于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF可以通过加强肿瘤组织血管生成而促进肿瘤的生长,另外,VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：构建人血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF-C的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法克隆人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的VEGF-C cDNA(1．26Kb；回收PCR产物(1．28Kb），并将其连接至克隆载体pMDl8-T中；重组的pMDl8-T在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF-C cDNA全长的酶切片断(1．27Kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT-PCR产物合有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pMDl8-T中含有正确的人VEGF-C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1（-)中含有人VEGF-C cDNA全长序列。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体VEGF-C／pcDNA3．1（-)。     

VEGF165和VEGF165b真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)165和VEGF165b真核表达质粒,为VEGF165和VEGF165b功能研究奠定基础.方法:应用RT-PCR方法从人肺腺癌A549细胞中获得并扩增VEGF165 cDNA,双酶切后与真核表达载体pcDNA3.0连接,构建重组质粒pcDNA3.0-VEGF165,酶切、PCR及...     

反义VEGF165真核载体的构建

以质粒pcDNA3.1为载体，将血管内皮基因（VEGF）165cDNA片段反向插入得到反义VEGF165真核表达载体，经过酶切电泳和基因测序证实获得的载体插入方向正确，可以进一步用于反义基因表达的实验研究。     

VEGF反义寡核苷酸抑制C6胶质瘤细胞VEGF表达的作用和效果

目的:设计了针对VEGF的第Ⅲ外显子(exon,E3)的反义、错义和正义寡核苷酸,观察VEGF反义寡核苷酸抑制C6胶质瘤细胞VEGF表达的作用.方法:免疫细胞化学法观察反义、正义、错义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VE GF表达的影响;观察制备反义、正义、错义寡核苷酸的条件培养液对内皮细胞生长的抑制作用.结果:VEGF反义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VEGF的表达有明显抑制作用.结论:反义VEGF寡核苷酸通过抑制C6胶质瘤细胞VEGF的表达,进而抑制内皮细胞的生长.     

VEGF165/HBD3双基因共表达真核质粒载体的构建及其体外表达

目的 构建人血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor,VEGF165) 和人β防御素3 (human beta defensins,HBD3 )双基因共表达真核质粒载体、观察其在293FT细胞中的表达,并检测其活性.方法 利用RT-PCR方法分别从白血病细胞(HL60...     

VEGF—C和VEGFR-3对结直肠癌淋巴结转移的影响

目的：观察结直肠癌组织中血管内皮生长因子C（VEGF—C）和血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）的表达,探讨其对肿瘤淋巴结转移的影响。方法：采用免疫组化法检测66例结直肠癌组织中VEGF—C及VEGFR-3的表达情况,计算其阳性表达率。结果：VEGF—C、VEGFR-3的表达水平均与结直肠癌淋巴结转移显著相关（P〈0．01）,而VEGF—C的表达与患者的年龄、性别、癌的分化程度等无关（P〉0．05）。结论：VEGF—C可能通过与VEGFR-3的结合刺激了淋巴管的增生、扩张,使癌组织中LMVD增高,并通过提高淋巴管的渗透性,从而对癌的淋巴道转移起促进作用。     

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建

目的：构建过表达VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体,为勃起功能障碍基因治疗的研究提供有效工具。方法：根据GenBank中基因信息,设计合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法扩增目的基因片段,运用基因重组技术将其克隆至慢病毒表达载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,经酶切、测序对重组质粒进行验证。将重组质粒和Helper1.0、pHelper2.0辅助质粒共转染293T细胞,包装双基因过表达慢病毒并测试其滴度。结果：经酶切和测序鉴定表明VEGF和Smad7双基因重组慢病毒载体构建成功,荧光法测定重组慢病毒滴度高（2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重组慢病毒能高效转染293T细胞,Western blot检测显示VEGF和Smad7蛋白在靶细胞中过表达。结论：成功构建了携带VEGF和Smad7基因并能正确表达的高滴度的重组慢病毒载体。     

VEGF基因真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨经腺病毒表达载体转染血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)体内外基因表达的特点。方法构建VEGF基因腺病毒表达载体,将VEGF165基因转染到MSCs中。用RT-PCR法检测转基因MSCs中基因表达情况。结果转基因MSCs及其分化的子代细胞均有VEGF165的表达,并持续2周左右时间。结论经腺病毒表达载体转染VEGF165基因的MSCs在体内外均有良好的基因表达。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的　获得人血管内皮生长因子 (hVEGF165)cDNA ,构建真核表达载体 ,并研究其在大肠杆菌中的表达情况。方法　采用PCR方法 ,从HL6 0细胞中扩增出hVEGF165cDNA ,将其克隆至 pcDNA3 真核表达载体上 ,构建成为 pCD hVEGF165重组质粒。将重组质粒转染感受态的大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 ,用Westernblot检测表达产物。结果　经酶切鉴定及基因测序证实hVEGF165cDNA基因克隆成功 ,并建立了高效表达的 pCD hVEGF165重组质粒。Westernblot检测表明 ,组建了具有高效表达hVEGF165的大肠杆菌菌株。结论　成功地克隆和表达出了hVEGF165基因 ,为进一步建立VEGF转基因动物模型 ,研究其在视网膜新生血管性疾病中的应用奠定了基础     

hVEGF121基因真核表达载体的构建及其在神经干细胞中的表达

目的 构建真核表达载体pEGFP-N1/hVEGF121,并转染神经干细胞(neural stem cells,NSCs),以探究人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,hVEGF121)基因导入NSCs的表达变化.方法 分离培养胎鼠NSCs,并行nestin、GFAP...     

吸烟者血清内皮抑素水平的临床意义

目的 探讨吸烟者血清血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和内皮抑素(endostatin)水平的变化及其临床意义.方法 采用病例对照方法设计,对伴和不伴肺癌的164例吸烟者测定血清VEGF和endostatin水平,将20例不吸烟健康人作为正常对照组.结果 吸烟伴肺癌组(82例)血清VEGF水平明显高于吸烟无肺癌组(82例)及正常对照组(均P＜0.01);吸烟无肺癌组高于正常对照组(P＜0.05).吸烟伴肺癌组血清endostatin水平明显高于正常对照组(P＜0.01),但与吸烟无肺癌组比较差异无统计学意义(P＞0.05);吸烟无肺癌组高于正常对照组(P＜0.05).吸烟伴肺癌组血清endostatin/VEGF比值明显低于吸烟无肺癌组和正常对照组(均P＜0.01),但吸烟无肺癌组与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).吸烟伴肺癌组和吸烟无肺癌组VEGF与endostatin均呈正相关(均P＜0.01).结论 吸烟可能导致endostatin/VEGF失衡而致癌.endostatin/VEGF比值可能是吸烟者早期诊断肺癌的指标之一,吸烟者应定期检测血清VEGF、endostatin水平及endostatin/VEGF比值.     

糖尿病视网膜病变患者血浆血管内皮生长因子检测分析

目的：检测糖尿病患者血浆血管内皮生长因子的含量并探讨它与糖化血红蛋白、微量白蛋白等的关系及在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用。方法：收集７４例Ⅱ型糖尿病患者和１８例正常人的血浆标本,检测血中ＶＥＧＦ,ＧＨｂＡｌｃ、ＦＢＳ和尿中微量白蛋白、肌酐尿微量白蛋白指数等。结果：１．ＶＥＧＦ、ＡＬＢ、Ａ／Ｃ在对照组、无视网膜病变组、背景型ＤＲ组中逐渐升高,ＢＤＲ组的ＶＥＧＦ比对照组显著增高,增生型ＤＲ组的ＡＬ     

非小细胞肺癌中VEGF-C及其受体mRNA的表达与临床意义

目的：研究肺癌组织及癌旁组织中血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)及其受体mRNA的表达,分析其在肿瘤转移中的作用。方法：采用RT-PCR法分析36例新鲜肺癌组织及癌旁组织标本中VEGF-C／KDR／Fit-4mRNA的表达,并统计分析它与临床病理特点之间的关系。结果：癌旁组织(PT)中VEGF-C mRNA表达与Flt-4mRNA的表达呈显著正相关(r=0．523,P=0．0055)。肿瘤组织及癌旁组织中单一的VEGF-C、KDR或Flt-4 mRNA表达与肿瘤转移无明显相关;COMVEGF-C-3与淋巴结转移(r=0．5805,P=0．0008)及临床病理分期(r=0．5057,P=0．0064)呈明显正相关。结论：VEGF-C及其受体在肺癌组织及瘤旁组织中高表达,在肿瘤转移尤其是淋巴转移中起重要作用,COMVEGF-C-3是反映患者淋巴转移和预后的良好指标。     

血管内皮细胞生长因子受体基因变异297 Val→Ile与受体功能及脑卒中易感性

目的 探讨血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR-2)基因的编码区变异对受体功能的影响及与脑卒中患病风险的关系.方法 利用多中心病例-对照研究,在1849例脑卒中患者(血栓形成性脑梗死812例,腔隙性脑梗死530例,脑出血507例)和1798例对照人群中检测VEGFR-2基因编码区变异rs2305948(Val297Ile)与脑卒中易感性的关联,并在另一个独立的病例-对照研究(327例脑卒中和327例对照)中进行验证.放射性受体配体结合实验测定基因变异对VEGFR-2与配基VEGF亲和能力的改变.结果 VEGFR-2基因变异297Ile携带者频率在脑出血组显著高于对照组[脑出血组:Val/Ile,155(30.6%);Ile/Ile,16(3.2%);对照组:Val/Ile,351(19.5%);He/Ile,18(1.0%);P<0.01],与脑出血的高发病风险相关(OR 2.25;95% CI 1.70～2.96;P<0.01),验证研究亦得到相似结果.常见等位基因297Val被替换为297Ile时,VEGFR-2与配基VEGF的平衡解离常数显著增加[分别为(87±9)pmol/L和(195±36)pmol/L,P<0.01].结论 VEGFR-2基因变异297Ile降低该受体与配基的亲和能力,并与脑出血的高发病风险相关.其分子机制可能是由于VEGF/VEGFR-2信号通路下调,引起血管内皮细胞的稳态和完整性受损,在血压升高等情况下导致血管易破裂、出血.     

人源噬菌体抗体库中血管内皮细胞生长因子抗体的筛选及活性 …

目的 从人噬菌体Ｆａｂ抗体库中选抗人血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）抗体克隆,并对其特异性及活性进行分析,为后续工作奠定基础。方法 从不同人群外周血淋巴细胞提取总ＲＮＡ,经逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）分别扩增轻、重链抗体Ｆａｂ段,用噬菌体表面呈递技术构建抗体库,经过４轮固相筛选及单克隆差异筛选,获得能结合ＶＥＧＦ的抗体克隆。在此基础上通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和＾３Ｈ－ＴｄＲ     

内皮细胞特异性表达血管内皮生长因子基因载体的构建及表达特性验证

目的 构建在内皮细胞特异性表达人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的真核表达栽体,验证HRE.ppET-1调控元件的内皮细胞表达特异性.方法 用聚合酶链反应(PCR)方法直接合成缺氧反应元件(hypoxia-responsive element,HRE),人前内皮素原-1基因(human preproendothelin-1,ppET-1)启动子、VEGF元件,通过PCK、酶切、连接等一系列核酸分子操作,将各元件亚克隆至pcD-NA3.1载体上,最终组合而成真核表达栽体pcDNA3.1-VEGF+Pa,pcDNA3.1(-CMV)-ppET-1+VEGF+Pa,pcDNA3.1(-CMV)-HRE+ppET-1+VEGF+Pa;脂质体转染离体培养的脐静脉内皮细胞(HUVEC)和肝细胞,荧光显微镜下观察GFP表达,验证HRE.ppET-1调控元件在内皮细胞中的特异性.结果 各载体经酶切鉴定和测序证实.GFP的表达显示HRE.ppET-1调控元件在内皮细胞中可有效转录外源基因,在非内皮细胞中表达极弱.结论 成功构建能在内皮细胞特异性表达人VEGF基因的真核表达栽体;HRE.ppET-1调控元件具有内皮细胞表达特异性,为进一步利用VEGF进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定良好基础.