10—羧基喜树碱对人膀胱癌细胞染色质DNA的断裂作用的研究

目：探讨10－羟基喜树碱（10－Hydroxyl camptothecine,10-HCPT)对T24人膀胱癌细胞染色质DNA的断裂作用。方法：采用快速，灵敏的检测细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳（Singe cell gel electrophoresis,SCGE)技术，观察不同浓度10－HCPT（0.01-0.1mg/ml)分别作用于T24人膀胱癌细胞不同时间（24h和48h)后细胞DNA的损伤情况，以“彗星样”淋巴细胞出现率（计数一定量细胞其中彗星样细胞所占的比例），总彗星长度（“彗星”电泳方向上的最大长度，即尾长）和尾距（尾部DNA占总DNA的百分比与头尾部中心间距的乘积）来评价淋巴细胞DNA的损伤程度。结果：10－HCPT能剂量依赖性地导致T24人膀胱癌细胞DNA的明显断裂损伤，能使“彗星样”膀胱癌细胞出现率，总彗星长度和尾距显著增加（P＜0．05，P＜0．01），并随着时间的延长损伤加重。结论：HCPT对膀胱癌细胞具有很强的细胞毒作用，10－HCPT作用下T24人膀胱癌细胞DNA断裂损伤的增加，可能就是10－HCPT抗肿瘤效应的重要作用机理之一。     

脐血造血细胞体外扩增过程中DNA损伤的研究

本研究检测脐血(CB)单个核细胞(MNC)体外培养DNA损伤情况,以探讨体外培养的最佳收获时机。脐血MNC分别接种于含细胞因子无血清培养体系并进行集落接种,分别在0、7、14及21天收集细胞,用流式细胞仪检测CD34+及CD133+细胞数,采用单细胞凝胶电泳试验检测培养后不同时间点脐血造血细胞及集落细胞的DNA链断裂损伤情况。结果表明,体外短期培养(14天内)时,脐血CD34+及CD133+细胞数最多,脐血细胞DNA损伤率均低于5.0%,21天时CD34+及CD133+细胞数降到低于0天的比例,细胞DNA损伤率为28.2%,DNA损伤率比0天时高(p=0.000),损伤细胞彗星尾长度明显大于0天(p=0.000);而其余各培养时间点(7天和14天)损伤细胞彗星尾长度与培养0天组损伤细胞的彗星尾长度比较,差异无统计学意义(p=0.863及p=0.253);集落培养细胞DNA损伤率均低于5.0%。结论:利用本方法进行脐血造血细胞短期(14天)培养DNA损伤率均低于5.0%,但超过14天时DNA损伤明显增加,体外培养的最佳收获时机应在14天内。     

骨关节炎Ⅰ号方对抗过氧化氢致软骨细胞DNA的损伤作用

目的:选用过氧化氢作为实验软骨细胞DNA的损伤因子,探讨骨关节炎Ⅰ号方预防过氧化氢对软骨细胞DNA的损伤作用。方法:实验于2004-01/12在福建省中医学院动物中心完成。骨关节炎Ⅰ号方由仙灵脾、巴戟天、川芎、三七、祖师麻组成。取三四周龄兔关节软骨,经胶原酶Ⅱ消化,建立软骨细胞体外培养体系。随机分成4组,①骨关节炎Ⅰ号方组加入100g/L骨关节炎Ⅰ号方药液,②中药加过氧化氢组加入100g/L骨关节炎Ⅰ号方与1mmol/L过氧化氢组混合液,③过氧化氢对照组加入1mmol/L过氧化氢液,④正常对照组加入磷酸盐缓冲液。均加入软骨细胞培养体系中培养2h,用单细胞凝胶电泳法检测培养体系中软骨细胞的DNA损伤的程度以彗星细胞出现率和慧星尾长的变化做评估指标。结果:①彗尾样细胞出现率:过氧化氢组彗尾样细胞出现率显著高于中药加过氧化氢组(41%,24%,P<0.05)、显著高于中药组(41%,8%,P<0.01)、显著高于正常对照组(41%,9%,P<0.01);中药组与正常对照组彗尾样细胞出现率相似(8%,9%)。②彗星尾长:正常对照组、中药组DNA荧光图像呈圆形;过氧化氢对照组软骨细胞出现慧星状DNA荧光图像;中药加过氧化氢组软骨细胞也出现“拖尾”现象,但较过氧化氢对照组短(20.2950±12.8414,39.3983±12.5368,P<0.05)。结论:过氧化氢组彗星样细胞出现率,彗星尾长都显著高于正常对照组,说明过氧化氢对软骨细胞DNA具有损伤作用。加入骨关节炎Ⅰ号方进行干预后,彗星样软骨细胞百分率、彗星尾长都明显下降,说明骨关节炎Ⅰ号方具有预防过氧化氢对软骨细胞DNA的损伤作用。     

骨关节炎Ⅰ号方对抗过氧化氢致软骨细胞DNA的损伤作用

目的：选用过氧化氢作为实验软骨细胞DNA的损伤因子，探讨骨关节炎Ⅰ号方预防过氧化氢对软骨细胞DNA的损伤作用。方法：实验于2004—01／12在福建省中医学院动物中心完成。骨关节炎Ⅰ号方由仙灵脾、巴戟天、川芎、三七、祖师麻组成。取三四周龄兔关节软骨，经胶原酶Ⅱ消化，建立软骨细胞体外培养体系。随机分成4组，①骨关节炎Ⅰ号方组加入100g／L骨关节炎Ⅰ号方药液，②中药加过氧化氢组加入100g／L骨关节炎I号方与lmmol／L过氧化氢组混合液，③过氧化氢对照组加入1mmol／L过氧化氢液，④正常对照组加入磷酸盐缓冲液。均加入软骨细胞培养体系中培养2h，用单细胞凝胶电泳法检测培养体系中软骨细胞的DNA损伤的程度以彗星细胞出现率和慧星尾长的变化做评估指标。结果：①彗尾样细胞出现率：过氧化氢组彗尾样细胞出现率显著高于中药加过氧化氢组(41％，24％，P&;lt;0．05)、显著高于中药组(41％，8％．P&;lt;0．01）、显著高于正常对照组(41％，9％，P&;lt;0．01)；中药组与正常对照组彗尾样细胞出现率相似(8％，9％)。②彗星尾长：正常对照组、中药组DNA荧光图像呈圆形；过氧化氢对照组软骨细胞出现慧星状DNA荧光图像；中药加过氧化氢组软骨细胞也出现“拖尾”现象，但较过氧化氢对照组短(20．2950&;#177;12．8414，39．3983&;#177;12．5368．P&;lt;0．05)。结论：过氧化氢组彗星样细胞出现率，彗星尾长都显著高于正常对照组，说明过氧化氢对软骨细胞DNA具有损伤作用。加入骨关节炎Ⅰ号方进行干预后，彗星样软骨细胞百分率、彗星尾长都明显下降，说明骨关节炎Ⅰ号方具有预防过氧化氢对软骨细胞DNA的损伤作用。     

黄芩素通过抗氧化及调节细胞内钙离子浓度抑制大鼠缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡

背景:黄芩素对缺氧复氧损伤的心血管有保护作,但机制至今不清。目的:探讨中药黄芩素对心肌细胞缺氧/复氧损伤导致心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法:体外培养大鼠乳鼠心肌细胞培养。实验分3组:正常对照组为正常培养的心肌细胞未做处理;缺氧/复氧组为应用缺氧/复氧方法诱导心肌细胞凋亡损伤;黄芩素预处理组为经黄芩素预处理30min后经缺氧/复氧诱导的心肌细胞。通过检测培养基上清液中乳酸脱氢酶活力检测细胞损伤程度及黄芩苷保护作用;应用原位末端标记细胞法标记细胞后,流式细胞检测心肌细胞凋亡率;应用免疫印迹方法检测心肌细胞凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平;应用Fura-2-AM负载心肌细胞,实时检测心肌细胞内Ca2+浓度变化。结果与结论:与正常对照组相比,缺氧/复氧组上清液乳酸脱氢酶活性、心肌细胞凋亡率、Bax蛋白含量、心肌细胞Ca2+浓度均增加(P<0.05),Bcl-2蛋白含量降低(P<0.05)。与缺氧/复氧组相比,黄芩素预处理组乳酸脱氢酶含量、心肌细胞凋亡率、Bax蛋白含量及心肌细胞Ca2+浓度均降低(P<0.05),Bcl-2蛋白含量增加(P<0.05)。证实黄芩素能抑制缺氧/复氧导致的心肌细胞凋亡,其作用机制可能与抗氧化与调节心肌细胞内钙离子浓度有关     

放疗对肿瘤患者外周血淋巴细胞DNA损伤的研究

目的　检测放疗对肿瘤患者外周血淋巴细胞DNA损伤情况 ,为监测放射剂量对机体正常组织的损伤提供可靠的量化指标。方法　采用单细胞凝胶电泳技术 ,测定 31例放疗患者不同阶段外周血淋巴细胞DNA损伤情况 ,同时测定血清中丙二醛 (MDA)浓度和过氧化氢酶 (CAT)的活性。结果　 31例肿瘤患者中有 9例出现细胞损伤 ,其中有 3例患者拖尾长度随着照射剂量的增大而增加。本次实验最早出现慧星现象是在体外放疗剂量达 2 0Gy(体外放疗 10次 )。MDA的含量在放疗前与放疗 2 0次后 (约 4 0Gy)比较差异有显著性 ;血清中CAT活性在放疗前与放疗 10次后比较有差异 (P <0 .0 5 )。结论　一定剂量放射线对肿瘤患者外周血淋巴细胞DNA有损伤作用 ,把握好放射剂量是临床治疗的关键。     

贫铀对人支气管上皮细胞DNA损伤及DMSO的保护作用

目的观察贫铀（DU）引起的细胞DNA损伤及二甲基亚砜（DMSO）的保护作用。方法以人支气管上皮细胞（BEAS-2B）为靶细胞，贫铀设置0、1．5,2．0mg/mL3个剂量，以0．5％的DMSO为保护剂，过氧化氢为阳性对照，采用单细胞凝胶电泳研究细胞产生的DNA损伤作用。结果BEAS-2B细胞经贫铀染毒后，可引起DNA链断裂，彗星尾部面积、尾长、尾部DNA含量、尾距随贫铀浓度增加而增加；0．5％的DMSO对贫铀诱发BEAS-2B细胞产生的DNA链断裂有明显的抑制作用。结论贫铀染毒能造成细胞的DNA损伤．DMSO对贫铀所致细胞的DNA损伤具有保护作用。     

心肌细胞缺氧损伤形式及牛磺酸的保护作用

目的 :探讨心肌缺氧损伤形式及 Tau保护作用。方法 :将培养乳鼠心肌细胞分正常对照、Tau对照、缺氧 +Tau和缺氧 4组。用流式细胞术和 DNA电泳判断细胞凋亡和坏死 ,测定培养液中 CPK和 L DH。结果 :缺氧 +Tau组CPK、L DH和坏死细胞均比缺氧组明显降低 (P<0 .0 5 ) ,但早期凋亡细胞无差别 (P>0 .0 5 )。两组各指标均比对照组明显升高 (P<0 .0 1)。 DNA电泳缺氧 15 h两组均见梯形带 ,缺氧 4 8h均呈瀑布状。结论 :缺氧引起心肌细胞凋亡和坏死。Tau可减轻细胞坏死 ,但对凋亡无抑制作用。     

单细胞电泳法检测肿瘤患者化疗后淋巴细胞DNA损伤

应用单细胞电泳 (SCGE)检测肿瘤患者环磷酰胺化疗后外周血T淋巴细胞DNA损伤。在标准SCGE条件下应用彗星图象分析系统定量分析人T淋巴细胞DNA的损伤程度。彗星图象分析研究结果显示 ,肿瘤患者外周血T淋巴细胞DNA损伤明显强于正常对照组 ,肿瘤患者外周血T淋巴细胞拖尾动量为 10 42± 1 98,正常人群为 1 2 6± 0 77;两者差异极显著 (P <0 .0 1)。肿瘤患者化疗后T淋巴细胞的拖尾长度为 3 3 69± 7 56μm ,DNA损伤的百分比为 3 1 5± 5 46% ;正常人群T淋巴细胞的拖尾长度和DNA损伤的百分比分别为 16 2± 1 5μm和7 46± 1 15% ;两组数据相比差异极显著 (P <0 .0 1)。结论 :单细胞电泳可快速灵敏地检测细胞DNA损伤 ,能用于肿瘤化疗患者的流行病学观察。对于指导临床用药和预后也有指导意义     

缺氧诱导离体心肌细胞凋亡的动物实验研究

目的：建立一种新的SD乳鼠心肌细胞的缺氧模型,以探讨心肌细胞缺氧损伤后的细胞凋亡及其时序分布特点。方法：SD乳鼠的培养心肌细胞随机分为5组：对照组,缺氧12h组(112h)、缺氧24h组(14h),缺氧48h组(148h)以及缺氧72h组(172h)。应用流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳、透射电镜等多种手段检测心肌细胞凋亡的改变。结果：在本实验的心肌细胞缺氧模型中,流式细胞仪检测发现,心肌细胞缺氧后的细胞凋亡百分率迅速增高。琼脂糖凝胶电泳分析。心肌细胞在缺氧48h、72h时均出现了凋亡特异性的“梯状”电泳带。结论：本实验培养乳鼠心肌细胞缺氧模型可导致心肌细胞凋亡,凋亡程度和心肌细胞缺氧时间有关,并可导致和在体心肌缺血相似的心肌损伤。细胞凋亡在心肌缺氧心肌细胞死亡中起重要作用。     

新生儿缺氧缺血性脑病血谷胱甘肽过氧化物酶水平与DNA损伤的关系探讨

目的探讨新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)血液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)水平与外周血单个核细胞DNA损伤程度的关系。方法HIE患儿20例,分别在急性期、恢复期采血,用动力学检测全血中GSHPx水平,用碱性单细胞凝胶电泳(SCGE)检测外周血中单个核细胞的彗星率及尾矩。12例新生儿作为正常对照组。结果急性期HIE患儿血中,GSHPx水平明显减低,与对照组比较有统计学意义(P<0.01),恢复期GSHPx水平上升,与对照组比较无统计学意义(P>0.05);急性期HIE患儿外周血单个核细胞彗星率及尾矩显著增高,与对照组比较有统计学意义(P<0.01),恢复期两者水平下降,但与对照组比较仍有统计学意义(P<0.01)。结论自由基及DNA损伤参与了新生儿HIE的病理发展过程,GSHPx可作为HIE患儿体内自由基水平检测指标之一。     

脑血栓前期血管内皮细胞损伤研究

目的观察脑栓塞前期血液血管性血友病因子(v WF)、脱氢血栓烷(DH-TXB2)、P-选择素(P-selectin)含量和白细胞DNA的损伤情况,探讨脑血栓前期血管内皮细胞损伤的原因,为预防脑栓塞寻找理论依据。方法采用ELISA法测定血浆v WF、P-选择素及DH-TXB2的含量;碱性单细胞凝胶电泳法检测白细胞DNA损伤,用彗星图像分析系统分析白细胞的彗星率和彗尾DNA百分(%)含量。结果(1)v WF、DH-TXB2和P-选择素在血栓前期显著高于对照组(P<0.001),与血栓形成后的水平相近(P<0.05);(2)未发生脑栓塞、脑栓塞前后患者血液中单个核细胞的彗星率、彗尾DNA%含量均显著高于对照组(P<0.01),脑栓塞组患者血液中单个核细胞的彗星率、彗尾DNA%含量与未发生脑栓塞组有显著差异(P<0.01),脑栓塞前后患者血液中单个核细胞的彗星率、彗尾DNA%含量无显著差异(P>0.01)。结论脑栓塞前期血液中白细胞DNA明显损伤,表明微环境存在严重缺氧。由此推测,脑血栓前期血管内皮细胞严重损伤,导致血小板聚集活化释放,缺氧可能是其主要原因之一。     

新生牛肝再生刺激素对HL-60细胞DNA的损伤作用

本研究旨在观察分子量小于10kD的肝再生刺激素(hepatocyte growth-promoting substance，HGS)在体外液体培养中对HL-60细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。实验分为3组：22．5μg/ml组、40μg/ml组和对照组，用胎盘蓝染色法计数HL-60细胞生长曲线，观察HGS对HL-60细胞增殖的影响；应用单细胞凝胶电泳法比较不同剂量HGS引起HL-60细胞的DNA损伤情况；采用基因组DNA体外电泳技术，观察HL-60细胞在HGS作用后凋亡的DNA片段断裂情况。结果表明，22．5μg/ml和40μg/ml 2个组在2天培养后均观察到HL-60细胞的增殖受到抑制；基因组DNA体外电泳结果证明，在上述2个剂量的组内，出现了明显的DNA梯形条带，并于培养第2天有HL-60细胞凋亡；单细胞凝胶电泳(SEGE)显示，HL-60细胞在加入HGS后出现有慧尾的细胞数量增多。结论：HGS能够抑制白血病细胞系HL-60细胞的增殖，并通过诱导凋亡导致DNA损伤来杀伤对HL-60细胞。     

Lack of an Association Between Sperm Head Abnormality and DNA Damage by Alkaline Comet Assay

Sperm DNA damage affects sperm function, compromising reproductive outcome in both natural and assisted reproduction. The present study addresses the existing ambiguity between sperm morphology and DNA damage, by use of comet assay/single cell gel electrophoresis. Using comet assay as an end point, sperm DNA fragmentation in a total of 17 control and infertile subjects presenting to the infertility clinic of Kasturba Medical College has been investigated. Percent tail DNA, tail length and olive tail moment were selected as a measure to compare the extent of DNA damage between the groups. No significant difference was observed between the control group with morphologically normal sperm and experimental group with abnormal sperm morphology with respect to head DNA, tail DNA, Olive tail moment or tail length by alkaline comet assay. The comet assay failed to demonstrate any positive association between sperm morphology and DNA damage. In view of accumulating evidence on the importance of sperm DNA integrity in fertilization and embryogenesis, refined techniques allowing sperm selection with intact sperm DNA or with minimal DNA damage for clinical use should be sought.     

Application of the comet assay method in clinical studies

The comet assay or single-cell gel electrophoresis (SCGE) assay is now widely accepted as a standard method for assessing DNA damage in individual cells. It finds use in a broad variety of applications including human biomonitoring, genotoxicology, ecological monitoring and as a tool for investigation of DNA damage and repair in different cell types in response to a range of DNA-damaging agents. The comet assay should be eminently suitable for use in clinical practice since it is a relatively simple and inexpensive technique which requires only a few cells, and results can be obtained within a matter of hours. This method can be used in the study of cancer as well as in lifestyle and dietary studies. In cancer it is useful for measuring DNA damage before, throughout and after therapy (either radiotherapy or chemotherapy). Another use of this method is in lifestyle study, such as investigation of the effect on DNA of common human activities (e.g. smoking, or working with a potentially genotoxic agent). The final use of comet assay in this paper is dietary study. In this type of study we observe the effects of consumption of specific foods or supplements which may be protective for DNA against damage.     

双尾彗星实验检测精子DNA完整性的方法学建立

目的建立双尾彗星实验检测精子DNA完整性的方法学,并分析精子DNA损伤的类型。方法利用中性和碱性双相单细胞凝胶电泳技术检测精子DNA损伤的情况。结果双尾彗星实验共得到9种彗星形态,分别代表9种精子DNA损伤类型。利用H2O2和限制性内切酶AluI分别诱导单链DNA和双链DNA的产生。随着H2O2浓度逐渐增加,单链DNA的断裂逐渐增多,显微镜下可见含Y轴彗星尾的精子数逐渐增多,差异有统计学意义(P<0.05)。同样,随着AluI消化时间的延长,双链DNA的断裂增多,显微镜下可见含X轴彗星尾的精子数增多,差异有统计学意义(P<0.05)。另外,我们还发现男性不育组和有正常生育能力组的DNA单链损伤碎片指数(SSB-DFI)差异无统计学意义,而男性不育组的DNA双链损伤碎片指数(DSB-DFI)却显著高于正常生育能力组(P<0.05)。结论双尾彗星实验能够区分精子DNA损伤是单链损伤还是双链损伤,为评估男性的生育能力提供更加深入、有力的实验室依据。     

A Mechanistic Approach for Modulation of Arsenic Toxicity in Human Lymphocytes by Curcumin, an Active Constituent of Medicinal Herb Curcuma longa Linn

Chronic exposure of humans to high concentrations of arsenic in drinking water is associated with skin lesions, peripheral vascular disease, hypertension, blackfoot disease and a high risk of cancer. Arsenic induces single strand breaks, DNA-protein crosslinks and apurinic sites in DNA, which are prerequisites for induction of cancer. Amelioration of such damages with natural compounds could be an effective strategy to combat arsenic toxicity. Curcumin is the active ingredient of turmeric, a common household spice, which is a rich source of polyphenols and this compound has been extensively studied as a chemopreventive agent against many types of cancer. The present study investigates whether curcumin could counteract the DNA damage caused by arsenic as assessed by single cell gel electrophoresis (SCGE) using peripheral blood lymphocytes, from healthy donors. It was observed that DNA damage induced by arsenic could be efficiently reduced by curcumin and the effect was more pronounced when lymphocytes were pre-incubated with curcumin prior to arsenic insult. Arsenic caused DNA damage by generation of reactive oxygen species (ROS) and enhancement of lipid peroxidation levels. Curcumin counteracted the damage by quenching ROS, decreasing the level of lipid peroxidation and increasing the level of phase II detoxification enzymes like catalase, superoxide dismutase and glutathione peroxidase. Curcumin also enhanced the DNA repair activity against arsenic induced damage. The expression of polymerase, a repair enzyme, was found to be highly elevated when arsenite induced damaged cells were allowed to repair in presence of curcumin. Results indicate that curcumin has significant role in confronting the deleterious effect caused by arsenic, which could be an economic mode of arsenic mitigation among rural population in West Bengal, India.