人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

人BTLA分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:表达并纯化重组人BTLA(hBTLA)分子胞外区,制备和鉴定兔抗hBTLA多克隆抗体,为进一步实验研究奠定基础。方法:采用特异性引物扩增hBTLA胞外功能区DNA,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a-hBTLA。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)菌株,采用IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对抗体进行纯化、效价测定及特异性鉴定。结果:序列测定证实构建的pET28a-hBTLA重组表达载体含有hBTLA编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为15720的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Western blot分析显示抗体能特异性结合重组hBTLA蛋白。结论:成功构建了hBTLA蛋白的原核表达载体,获得高纯度的融合蛋白,制备高效价、高特异性的多克隆抗体。     

人Fkbp19的多克隆抗体的制备

目的:制备针对人Fkbp19的多克隆抗体,为进一步研究Fkbp19基因的功能奠定基础。方法:利用鉴定正确的重组原核表达载体pET21a-Fkbp19,在大肠杆菌BL21-DE3中诱导表达,应用Ni-NTA亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白,并免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot及免疫荧光的方法检测抗体对乳腺癌细胞中内源性Fkbp19蛋白的识别能力。结果:成功地在大肠杆菌中实现了His-Fkbp19融合蛋白的表达,经纯化后免疫家兔得到了高滴度的多克隆抗体,该抗体可以用Western blot的方法检测内源性Fkbp19蛋白。结论:所制备的多克隆抗体可以用于Fkbp19的Western blot检测。     

Syncytin蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的克隆人syncytin基因并在大肠杆菌中表达,并用表达后的融合蛋白制备syncytin蛋白多克隆抗体。方法 PCR扩增人syncytin基因编码区的DNA片段,将其克隆入原核表达质粒pET30a(+),转化大肠杆菌BL21,诱导产生syncytin-His融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA、Western-Blot和免疫组织化学等方法来检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功表达并纯化了syncytin-His融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白主要以包涵体形式存在;ELISA法测定抗体效价为1:10 000;Western-Blot和免疫组织化学结果显示所制备的抗体能特异性识别syncytin蛋白。结论成功制备和鉴定了人syncytin多克隆抗体,多克隆抗体特异性强和效价高,为下一步研究Syncytin的生物学功能奠定了基础。     

QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:获得原核表达的RNA结合蛋白QKI-7蛋白,并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法:将成功插入QKI-7编码区cDNA的PET32b( )原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3)感受态细菌,以IPTG诱导6×His-QKI-7融合蛋白的表达,分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,应用纯化的融合蛋白,分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并以Western blot进行检测。结果:经表达并纯化的QKI-7蛋白纯度达到95%以上,应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度,特异性的抗QKI的多克隆抗体。结论:成功地表达并纯化了QKI-7蛋白,并制备了高滴度、高特异性的抗QKI多克隆抗体。采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜。     

Autotaxin多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Autotaxin(58-157位氨基酸)融合蛋白,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法:构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗Autotax-in的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性,并用于免疫组化实验。结果:在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58-157)-His6融合蛋白,经亲和纯化后免疫家兔,获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论:成功构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)表达质粒,原核表达获得高纯度的目的蛋白,制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。     

人NYD-SP28基因原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建人NYD-SP28基因原核表达载体,表达其原核蛋白,制备其多克隆抗体,以探讨其在精子发生中的作用。方法:以原始质粒为模板,用PCR法扩增人的NYD-SP28基因开放阅读框全长,将其克隆到原核表达质粒pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-NYD-SP28。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导原核蛋白的表达,纯化蛋白以免疫小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA法测定抗体的滴度。结果:成功构建了用于原核蛋白表达的重组质粒,并在BL21菌中表达NYD-SP28原核蛋白,用亲和层析Ni柱进行纯化得到NYD-SP28原核蛋白。用纯化的NYD-SP28蛋白免疫小鼠2个月后,得到相应的多克隆血清抗体,经ELISA检测,滴度达到1/10万。结论:成功构建人NYD-SP28原核表达载体,并获得了高纯度的NYD-SP28蛋白及鼠抗NYD-SP28多克隆抗体,为进一步研究NYD-SP28的功能奠定了基础。     

人白细胞介素18的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人白细胞介素18（hIL-18)，制备兔抗人白细胞介素18多克隆抗体，方法：用RT－PCR扩增出hIL-18的cDNA克隆到原核表达载体pJW2中，转化大肠杆菌JM101中诱导表达并纯化。用纯化的人白细胞介素18免疫新西兰兔制备多克隆抗体，结果：克隆得到序列正确的IL-18 cDNA，与载体连接后转化入大肠杆菌JM101中诱导表达并成功纯化，并用纯化的人白细胞介素18成功制备了兔抗人白细胞介素18多克隆抗体。结论：制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

人高迁移率族B1蛋白原核表达、纯化及抗体制备和初步应用

目的:原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋白(HMGB1)免疫日本大耳白兔制备其抗体.方法:构建原核表达质粒pRsetA2-HMGB1, 转化大肠杆菌BL21(DE3), HMGB1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.融合蛋白通过Ni2 -NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清.以间接ELISA法检测抗体效价, Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性.结果:成功构建原核表达质粒, 表达并纯化HMGB1蛋白.ELISA检测抗体效价为1∶ 16 000以上, Western blot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性.结论:HMGB1蛋白和抗体的成功制备, 为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础.     

Rig-I蛋白C端Helicase结构域的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

目的:为Rig-I蛋白结构与模式识别功能的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测试剂。方法:PCR法克隆小鼠Rig-I基因Helicase区编码序列(726～2240bp,编码241～746位氨基酸),构建带组氨酸标签的原核表达载体pET15b-mRig-I-H,阳性克隆经酶切、测序鉴定后转化E.coliBL21进行诱导表达。目的蛋白电泳分离并割胶纯化后免疫家兔制备抗血清。抗血清用ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法进行鉴定。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,制备的抗Rig-I抗体效价达到1∶100000,Western blot、细胞免疫荧光结果显示该抗体能够有效地对细胞内Rig-I蛋白的表达水平进行检测。结论:成功地对mRig-I-H进行了原核表达、纯化,抗mRig-I-H的多克隆抗体具有较高的特异性,为进一步研究Rig-I尤其是Helicase区的结构与功能奠定了坚实的基础。     

截短ALT1蛋白的获得及其多克隆抗体的制备

 目的 原核表达、纯化截短ALT1蛋白,制备ALT1多克隆抗体。方法 利用pCold TF载体原核表达系统,IPTG诱导,表达经生物信息学分析含有两个编码ALT1抗原表位的ALT1 N端1~115个氨基酸序列的基因片段,依次经镍(Ni)离子亲和柱纯化、HRV 3C蛋白酶酶切、二次镍离子亲和柱纯化和分子筛柱层析得到不带标签的截短ALT1纯蛋白,用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果 经测序证实,成功构建了截短pCold TF-ALT1表达载体。获得纯度达90%的不带标签的截短ALT1重组蛋白,制备了效价达4.0×106的ALT1多克隆抗体,经western blot鉴定,能特异性地识别ALT1抗原和肝细胞裂解液。结论 成功获得高质量的截短ALT1无标签蛋白及其特异的多克隆抗体,为ALT1的免疫学检测试剂的研发提供了依据。     

人脂联素球状结构域基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建人脂联素球状结构域(gAd)基因的原核表达载体PET-28a(+)-gAd,诱导表达并纯化重组gAd蛋白,制备多克隆抗体。方法:以人基因组为模板,用PCR方法扩增人脂联素球状结构域(gAd)基因,构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经SDS-PAGE,免疫印迹法检测并鉴定表达产物,表达的目的蛋白用镍亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果:原核表达载体PET-28a(+)-gAd转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,获得gAd重组蛋白,免疫印迹证实能与抗his标签检测抗体结合,制备的多克隆抗体经间接ELISA法测得效价为1∶32 000。免疫印迹证实,抗血清不仅能特异性地识别gAd蛋白,还能识别脂联素蛋白,而不与非特异性蛋白结合。结论:成功构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,并表达、纯化重组蛋白gAd,制备的多克隆抗体特异性好,效价较高,为进一步的研究奠定了基础。     

annexinA2基因片段的克隆、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:构建人源annexinA2基因片段的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法:从GenBank(BC093056.1) 中获得人源annexinA2基因的cDNA序列并根据不含信号肽的编码序列设计引物,用PCR的方法扩增编码annexinA2基因部分序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达annexinA2的蛋白.表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化,用His抗体进行Western blot 鉴定.用纯化的目的蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得annexinA2的抗血清,通过ELISA测定兔多克隆抗体的滴度.在CaSki细胞内采用细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术(FCM)检测内源annexinA2蛋白的表达,用于鉴定制备的多克隆抗体特异性.结果:通过双酶切及测序证实原核表达质粒pET28a(+)-annexinA2构建成功,可在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导高表达,得到相对分子质量约28 000的annexinA2蛋白.纯化的蛋白免疫日本大白兔后,产生特异的高滴度的抗体(ELISA 滴度达 1:640 000).CIF和 FCM 结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活性.结论:构建了annexinA2的原核表达质粒并获得高纯度的蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的多克隆抗体,为人源annexinA2蛋白的生物学功能及肿瘤治疗的研究提供了实验基础.     

HIV-1蛋白酶基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的为了研究HIV-1蛋白酶的生物学活性,制备HIV-1 PR蛋白及其特异性抗体。方法用PCR方法扩增编码PR的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并表达HIV-1 PR蛋白,用His抗体为一抗做Western blot鉴定目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达载体pET28 a(+)-PR成功构建,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到的PR蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论得到纯化的HIV-1PR蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白PR,为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

RPA32蛋白原核表达、多克隆抗体制备及初步鉴定

目的原核表达人RPA32蛋白并制备其多克隆抗体,为后续RPA32的功能研究奠定基础。方法以人cDNA文库为模板,构建原核表达质粒PET41a-RPA32,转化受体菌E.coli BL21,经IPTG诱导表达,采用GST亲和纯化方法获得GST-RPA32融合蛋白,将该融合蛋白免疫家兔制备RPA32多抗血清,最后采用Western blot检测其在多种肝细胞株中的特异性。结果在受体菌E.coli BL21中成功诱导表达GST-RPA32融合蛋白,免疫家兔后获得高效价RPA32抗血清,Western blot检测证实该血清能够识别多种肝细胞株中的RPA32及CPT作用后出现的RPA32磷酸化条带。结论成功制备兔抗人RPA32多克隆抗体,为RPA32在DNA损伤中的功能研究奠定了基础。     

Balb/c小鼠MBL-C糖识别域的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的 原核表达Balb／c小鼠肝型甘露聚糖结合凝集素（mMBL-C）糖识别域（CRD）并制备其多克隆抗体。方法应用PCR从含Baib／c小鼠MBL-C全长编码区基因的质粒pmMBL-C中扩增目的基因片段,构建重组表达载体,在大肠杆菌中表达。分离纯化表达产物并免疫动物,制备mMBL-C CRD的抗血清,采用ELISA和Western blot鉴定其效价和特异性。结果从pmMBL-C中扩增到约450bp的DNA片段,构建重组载体pET-CKS-mMBL-C-CRD和pET32a-mMBL-C-CRD,经酶切和测序鉴定,证实重组表达载体构建成功。将其导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达,表达产物主要以包涵体的形式存在,相对分子质量（Mr）分别为44000和34000。利用pET-CKS载体表达产物免疫家兔,分离免疫血清后,使用pET32a（＋）载体表达产物进行ELISA及Westem blotting,显示多克隆抗体能够与mMBL-C CRD蛋白特异结合。结论获得了重组mMBL-CCRD蛋白及其多克隆抗体,为mMBL-C分子以及CRD的研究奠定了一定的基础。     

PBDC1蛋白的表达及其多克隆抗体的制备简

 目的 原核表达、纯化PBDC1蛋白,制备PBDC1多克隆抗体。方法 将PBDC1基因克隆到pET-28a(+)质粒中,构建成重组质粒pET-28a(+)-PBDC1。将此重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导其在宿主菌中大量表达,并进行SDS-PAGE检测。经镍离子亲和柱纯化得到PBDC1融合蛋白,并以此免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果 经质谱鉴定,获得了高纯度的PBDC1蛋白。经Western blot验证,获得了抗PBDC1蛋白的多克隆抗体。结论 成功获得抗PBDC1蛋白的多克隆抗体,为研究PBDC1在红系分化中的功能提供了有利工具。     

人HMGB1 B box蛋白的表达、鉴定及其单克隆抗体的制备

目的:表达人HMGB1 B box蛋白,制备其单克隆抗体(mAb),为进一步研究HMGB1 B box在免疫调节和抗感染免疫中的作用奠定基础。方法:将pET28-HMGB1 B box转化DH5α摇菌表达,使用His标记的蛋白纯化柱纯化、鉴定后免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0细胞进行常规融合,经间接ELISA筛选阳性克隆,获得分泌人HMGB1 B box蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法鉴定其特性(mAb的效价、Ig类别及特异性)。结果:成功地建立了2株稳定分泌抗人HMGB1 B box的mAb细胞株,分别命名为1D2F4E3和2D4E3A2。2株mAb的免疫球蛋白类型均为IgG,Western blot显示,2株mAb均能与HMGB1 B box发生特异性反应,其滴度为1×106,mAb1 D2F4E3和2D4E3A2的A450值分别为0.324±0.093和0.296±0.085。结论:获得了2株分泌HMGB1 B box mAb的细胞株,为HMGB1 B box蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

人类组氨酰tRNA合成酶类似物的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人类组氨酰tRNA合成酶类似物蛋白，制备多克隆抗体。 方法： 设计引物扩增其开放阅读框，重组入原核表达载体pQE30,并在大肠杆菌M15中诱导表达; 应用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔。 结果： ①成功构建人类组氨酰tRNA合成酶类似物的原核表达载体；②经Ni亲和层析获得纯度较高的重组蛋白；③制备了高滴度的兔抗人类组氨酰tRNA合成酶类似物蛋白的多克隆抗体。 结论： 原核表达载体的构建、重组蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备为今后研究该蛋白的功能提供了良好的基础。