线粒体功能障碍、α-突触核蛋白与帕金森病

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是以中脑黑质多巴胺能神经元缺失,黑质残存神经元内出现路易小体为主要病理改变的神经退行性疾病。越来越多的证据显示线粒体复合体Ⅰ功能障碍是散发性PD的核心发病机制,α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)异常聚集是PD病理学级联反应的关键事件。近年来,α-Syn与线粒体功能障碍的关系尤其引人注意,但至今对它们在PD中的作用机制并不完全清楚,二者间的相互作用尚不明确。本文综述了α-Syn与线粒体在PD发病中的关键作用以及二者在PD发病中的相互作用。对α-Syn及线粒体在PD发病中发挥作用的机制深入了解将对研发新的PD治疗方法具有重要意义。     

α-突触核蛋白基因多态性与帕金森病的关联分析

目的:探讨α-突触核蛋白基因(α-synuclein gene,SNCA)rs1372525、rs3822086等位点基因多态性与新疆地区帕金森病的关联性.方法:采用病例-对照研究,收集来自新疆医科大学各个附属医院门诊及病区225例帕金森病患者及231例年龄、性别、生源地等条件与其相匹配的健康体检者,分别作为病例组及对照组;采集2组参与者外周血液,通过提取脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对2组参与者的SNCA rs1372525、rs3822086等位点进行多态分析.结果:病例组与对照组SNCA rs1372525位点分别测得AA型161、164例,AG型54、61例,GG型10、6例,等位基因A的频率分别为83.6％和84.2％,等位基因G在2组间的频率分别为16.4％和15.8％,rs1372525位点3种基因型及等位基因分布频率在帕金森病组与对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05).病例组与对照组rs3822086位点分别测得CC型47、73例,CT型115、113例,TT型63、45例,等位基因C的频率为46.4％、56.1％,等位基因T的频率为53.6％、43.9％,可见该位点rs3822086 CC基因型和等位基因C在2组间的差异无统计学意义(P＞0.05);而CT、TT2种基因型及等位基因T的分布频率在2组之间的差异有统计学意义(P＜0.05).结论:SNCArs1372525位点多态性与帕金森病的发病无关.rs3822086考虑是帕金森病发生发展中的易感位点之一.     

促进α-突触核蛋白异常聚集而致帕金森病的因素

帕金森病(PD)为多发于老年人的神经系统退行性病变,其发病率仅次于阿尔茨海默病,高发病率及致残率使其备受社会关注。PD的发病是由遗传因素及环境因素共同决定的,路易小体的出现是PD的特征性改变,而异常聚集的α突触核蛋白(α-syn)是路易小体的主要构成成分,所以α-syn的异常聚集是PD发病的核心机制。α-syn由单体形式转变为聚集状态受诸多因素影响。通过了解这些影响因素,可以使学者们更好地了解PD的发病,从而为临床治疗提供新思路。     

帕金森病患者血浆增强α-突触核蛋白寡聚体形成

目的 研究帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）患者血浆对α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成的影响.方法 将重组人α-Syn加入PD和对照血浆中,37 ℃振荡孵育144 h,免疫印迹方法鉴定α-Syn寡聚体形成情况,ELISA方法分析α-Syn寡聚体形成的相对质量浓度.结果 α-Syn在 PD患者血浆中形成寡聚体含量明显高于对照组.结论 PD患者血浆可促进α-Syn寡聚体形成.     

帕金森病患者血清对α-突触核蛋白寡聚体形成的促进作用

目的研究帕金森病(PD)患者血清对外源性α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)寡聚体形成的影响,初步分析血清促进α-Syn寡聚体形成的机制。方法将重组人α-Syn加入PD患者和对照组血清中,37℃振荡孵育,用免疫印迹方法鉴定α-Syn寡聚体的形成情况,用ELISA分析α-Syn寡聚体的形成量。结果α-Syn在血清中振荡孵育后主要形成二聚体和十四聚体。与对照组血清相比较,PD患者血清具有促进α-Syn寡聚体形成的作用。在血清中加入还原性谷胱甘肽可明显减弱PD患者血清促进α-Syn寡聚体形成的作用。结论PD患者血清促进α-Syn寡聚体的形成,其机制可能与α-Syn的氧化修饰有关。     

帕金森病患者血浆增强α-突触核蛋白细胞毒性及其机制研究

目的 研究帕金森病（Parkinson's disease,PD）患者血浆对α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）细胞毒性的影响及其机制。方法 将重组人α-Syn加入PD和对照血浆中,采用免疫印迹法及酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法鉴定α-Syn寡聚体和磷酸化形成情况。在原代神经培养基中加入终浓度为5 μmol/L的α-Syn单体及寡聚体,同时添加30%（体积分数）PD血浆、正常人血浆和胎牛血浆,孵育14 d后,MTT及流式细胞技术观察细胞死亡情况。酶活力试剂盒检测各组原代神经元中蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A,PP2A）酶活力。结果 PD患者血浆较正常受试者（normal subject,NS）血浆可促使更多的α-Syn磷酸化和寡聚化。与NS血浆相比,添加到原代神经元培养物中的PD血浆导致更多细胞在细胞外α-Syn存在下死亡,同时伴有PP2A活力降低。结论 PD患者血浆中可能通过降低PP2A酶活力使α-Syn发生磷酸化,导致其聚集并进一步使得原代培养神经元死亡。     

帕金森病重要的发病机制:α-突触核蛋白异常聚集

帕金森病（PD）是一种常见于中老年人的慢性进展的神经系统变性疾病，其病因及发病机制尚不完全清楚，目前认为是遗传因素与环境因素共同作用的结果。研究表明α-突触核蛋白异常聚集与PD的发病密切相关。目前已知某些基因变异导致PD发生，其中α-突触核蛋白基因突变（如A53T、A30P或基因染色体座位的3倍扩增）及2个与α-突触核蛋白降解机制——泛素蛋白酶体系统有关的基因（泛素C末端水解酶、Parkin）突变可引起α-突触核蛋白在细胞内异常蓄积聚合，已经被确定为家族性PD的主要原因。     

α-突触核蛋白促进MES23.5细胞突起生长

目的研究人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)对MES23.5多巴胺能神经细胞突起生长的作用。方法 MES23.5细胞外添加α-syn蛋白,测定不同时间细胞突起的长度;免疫荧光双重标记法观察α-syn与β-微管蛋白之间的相互关系;ELISA方法检测细胞内β-微管蛋白含量。结果α-Syn处理组神经元突起的平均长度及β-微管蛋白的含量在培养1、4和24 h时均明显大于对照组;α-Syn的这一作用可被微管蛋白抑制剂秋水仙碱阻断;α-Syn与β-微管蛋白在细胞内共存。结论α-Syn具有促进MES23.5多巴胺能神经细胞突起生长的作用,该作用很可能通过影响微管蛋白的合成及微管的组装来完成。     

过氧化氢和帕金森病患者血清促进α-突触核蛋白向线粒体与细胞核转运

目的研究氧化应激和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者血清对α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)向线粒体以及细胞核转运的影响。方法将MES23.5多巴胺能神经细胞在含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养,然后分别用过氧化氢(H2O2)以及PD和正常人血清处理,免疫荧光标记法观察不同处理对α-Syn向线粒体以及细胞核的转运以及对线粒体及细胞核的影响。比色法测定血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、脂质氧化(malondialdehyde,MDA)和总抗氧化能力(totalanti-oxidation competence,T-AOC),观察血清的氧化应激水平。结果 H2O2和PD血清促进α-Syn向线粒体转运与细胞核转运,并造成线粒体皱缩、崩解,PD血清处理同时引起类似凋亡的核碎裂现象。PD血清的SOD、MDA和T-AOC高于对照血清。结论氧化应激和PD血清均可促进α-Syn向线粒体与细胞核转运,PD血清促进α-Syn向线粒体与细胞核转运可能与其氧化应激水平增高有关。     

早发型帕金森病患者红细胞α-突触核蛋白水平及临床意义研究

目的 探讨早发型帕金森病患者外周红细胞α-突触核蛋白水平是否存在特异性改变。方法 纳入47例早发型帕金森病患者,52例健康受试者。采集受试者外周静脉血标本并分离红细胞,用电化学发光免疫法检测红细胞中α-突触核蛋白水平。对其中25例早发型帕金森病患者进行随访,2年后再次采集静脉血标本和临床评估。结果 早发型帕金森病患者红细胞总体和聚集体形式的α-突触核蛋白水平均显著高于健康对照组[总体1.28(0.94, 2.13)vs 0.57(0.41, 0.70),P<0.001;聚集体202.18(152.16, 244.22)vs 128.40(107.61, 157.02),P<0.001]。2年随访后帕金森病患者运动功能和认知功能较基线无显著进展,而红细胞聚集体形式的α-突触核蛋白水平较基线时特异性升高[211.66(159.71, 263.73)vs 170.12(139.31, 233.42),P=0.046]。结论 外周红细胞α-突触核蛋白检测对于早发型帕金森病同样具有较好诊断价值,进一步证实上述指标是诊断帕金森病潜在的生物标志物。     

蛋白磷酸酶2A活力增高减轻α-突触核蛋白引起的SK-N-SH细胞凋亡

目的 观察蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A,PP2A）活力在α-突触核蛋白（α-Syn）引起的细胞凋亡中的作用.方法 在SK-N-SH细胞中瞬时转染空载（myc）和α-Syn质粒,免疫荧光化学方法鉴定基因表达情况.Western blotting法和PP2A酶活力检测试剂盒检测PP2A磷酸化水平及酶活力.TUNEL染色和MTT法检测各组细胞死亡情况.结果 过表达α-Syn可致磷酸化PP2A（pPP2Ac）水平显著增高及活力降低,同时导致细胞凋亡增多和细胞活力降低.PP2A激动剂C2-ceramide可显著逆转α-Syn所致细胞凋亡.结论 PP2A活力增高可减轻α-Syn过表达引起的细胞凋亡.     

多巴胺对鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集的促进作用

目的:探讨多巴胺能细胞内多巴胺在鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集过程中的作用。方法:采用鱼藤酮(1μmol/L)处理PC12细胞,流式细胞术检测双氢罗丹明123荧光强度;Western印迹法检测胞质内α-突触核蛋白表达;免疫荧光法观察α-突触核蛋白聚集体。并采用多巴胺耗竭剂——利血平预处理3h,观察上述指标。结果:鱼藤酮处理24h后,PC12细胞内过氧化物水平显著升高,而利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后,细胞内过氧化物水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05)。鱼藤酮处理后,α-突触核蛋白表达水平显著升高,胞质内可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集体形成;采用利血平预处理后,α-突触核蛋白表达水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05),α-突触核蛋白聚集体面积减小。结论:在鱼藤酮作用过程中,多巴胺可促进α-突触核蛋白表达上调及其聚集体的形成。     

Tau蛋白与α-突触核蛋白在常见神经系统退行性疾病中的致病机制

随着经济社会的不断发展,社会老龄化趋势日益加剧,与年龄相关的神经系统退行性疾病的发病也随之增加。而在这其中,阿尔茨海默症(AD)与帕金森病(PD)是最经典的两种神经系统退行性疾病,AD主要表现为进行性记忆功能减退和认知功能障碍;而PD主要表现为运动功能障碍,这两种疾病影响着全世界范围内约5000万的人口,而这其中大部分病例的分布特点表现为散发。研究表明AD及PD发病分别与Tau蛋白及α-突触核蛋白的关系密切,本文就Tau蛋白与α-突触核蛋白在这两种神经系统退行性疾病中的发病机制及两种蛋白的相关性加以综述。     

α突触核蛋白与神经系统疾病的关系研究进展

α突触核蛋白(α-Syn)是一种小分子酸性可溶性蛋白,是帕金森病(PD)发病的病理基础,在PD的发生中起重要作用。该文对α-Syn的结构、功能及其导致PD的发病机制等方面进行了综述,结合近年来对遗传性脊髓小脑型共济失调2型(SCA2)与α-Syn关系的研究来阐述带有PD症状的SCA2的发病是否与PD有共同的发病基础,是否也是α-Syn异常聚集所致,尚待进一步考证。     

α-突触核蛋白的突变体A53T对小胶质细胞激活的影响

目的：探究重组人的野生型α-突触核蛋白(wild type alpha-Synuclein, WT α-Syn)和重组人的α-突触核蛋白突变体A53T(α-Synuclein mutant A53T, α-Syn A53T) 对原代小胶质细胞的影响。方法：无菌培养原代小胶质细胞,细胞静息状态下加药处理,通过免疫荧光染色观察小胶质细胞的形态和Western Blot半定量分析CD11b的变化。结果：高浓度的WT α-Syn可以激活小胶质细胞;CD11b蛋白表达量明显升高;而2 μmol/L和5 μmol/L的α-Syn A53T均能激活小胶质细胞,CD11b蛋白表达量均升高。结论：相同浓度的WT α-Syn和α-Syn A53T,α-Syn A53T更容易激活小胶质细胞。     

α-突触核蛋白对内质网应激及细胞凋亡影响

目的:构建α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA)和SNCA突变基因(SNCAmu)过表达转染293T细胞,观察内质网应激及细胞凋亡.方法:应用PCR技术扩增目的基因并插入慢病毒载体质粒,重组质粒的构建及包装293T细胞,转染24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluorescent prot...     

α-突触核蛋白N 端结构域和电压依赖阴离子通道1 相互作用的分子机制

【立论依据】 帕金森病是主要发生在中老年人群的神经系统退行性变。目前认为与基因、环境和老化相关,三者主要作用于神经细胞线粒体导致其功能障碍。α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)是第一个发现的帕金森病致病基因编码的蛋白,是帕金森病病理标志路易体的主要成分。但到目前为止,α-Syn对细胞线粒体的致病机制尚不十分清楚。我们课题组前期工作首次发现,α-Syn可定位于线粒体内外膜,过表α-Syn可以引起线粒体膜电势下降及细胞色素C 释放到胞浆诱导凋亡;进一步发现线粒体膜渗透性转换孔(mPTP)开放,而α-Syn N端结构域(α-Syn/N)在这个过程中起重要作用。文献报道,α-Syn N端的62、63、65 位氨基酸可能是其定位于膜的关键位点。线粒体mPTP的外膜孔主要由电压依赖阴离子通道1(VDAC1)构成,我们预实验发现VDAC1和α-Syn存在相互作用。那么,α-Syn/N是否和VDAC1发生相互作用,导致mPTP开放而引起线粒体介导的凋亡呢?α-Syn/N的62、63、65 位氨基酸在这个过程中是否起重要作用呢? 【设计思路】 首先证明α-Syn/N和VDAC1之间存在相互作用,并过表达α-Syn/N,剪除α-Syn/N(α-Syn/delN),检测mPTP是否开放以及是否发生线粒体介导的凋亡。而后,构建α-Syn的62、63、65 位氨基酸突变体,检测过表达这些突变体对mPTP和线粒体介导的凋亡的影响,以及检测它们是否和VDAC1发生相互作用。 【实验内容】 (1)在HEK293T细胞中,过表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN,用免疫共沉淀和免疫细胞化学的方法检测相互作用。(2)构建带VDAC1 基因的质粒,在HEK293T细胞中分别共表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN 和VDAC1,用荧光共振能量转移(FRET)的方法检测是否存在直接相互作用,并再通过GST-pulldown方法验证。(3)在HEK293T细胞中,检测过表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN对mPTP开放和线粒体介导的凋亡的影响。(4)构建α-Syn突变体(Q62A、V63A、N65A),检测过表达这些突变体对mPTP开放和线粒体介导的凋亡的影响。(5)检测这些突变体和VDAC1之间是否存在相互作用,方法同前。 【材料】 HEK293T 细胞,表达α-Syn,α-Syn/N,α-Syn/delN,Q62A,V63A,N65A 的质粒,线粒体提取试剂盒,JC-1 荧光探针(检测线粒体膜电势),mPTP 检测试剂盒。 【可行性】 我们的前期工作提示:α-Syn/N导致mPTP开放;α-Syn和mPTP外膜的孔的组成蛋白VDAC1之间存在相互作用;并且我们已经成功构建了过表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN的细胞模型;以及α-Syn突变体(Q62A、V63A、N65A);并掌握了后续实验的全部方法。 【创新性】 目前关于α-Syn/N与mPTP 相关蛋白VDAC1的研究未见报道,本研究尝试揭示α-Syn与线粒体膜孔蛋白之间的确切关系,对进一步明确α-Syn引起线粒体介导凋亡的分子机制、明确帕金森病的致病机制具有重要意义,进而为帕金森病治疗的新靶点探讨提供线索。