变性高效液相色谱检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇的耐药性

乙胺丁醇(EMB)的初始耐药率与获得性耐药率均超过1%[1].研究发现,在耐受EMB的菌株中,约60%发生embB基因306位点突变[2].因此,该点突变的检测对结核分枝杆菌(MTB)耐受EMB的临床诊断具有重要意义.     

变性高压液相色谱技术在检测结核分枝杆菌对链霉素耐药性中的应用

目的利用变性高压液相色谱（DHPLC）技术快速检测结核分枝杆菌rpsL基因的突变，从而对结核分枝杆菌是否耐受链霉素类药物做出初步判断。方法体外药物敏感性试验，确定122株结核分枝杆菌临床分离株对链霉素的敏感程度。提取试验菌株基因组DNA。扩增rpsL基因片段；分别与H37Rv标准株的相应PCR产物混合、杂交后，利用WAVE核苷酸片段分析系统对各杂交产物进行DHPLC检测；序列测定结果与相应的DHPLC检测结果进行比较以验证DHPLC检测的准确性。通过比较药物敏感性和DHPLC检测结果。建立两者之间的对应关系。此外我们还检测了32株对链酶素敏感的临床分离株进行了DHPLC法检测。以明确该检测方法的特异性。结果结核分枝杆菌临床分离株对链霉素耐药性经体外实验证明，rpsL基因43位氨基酸突变通常会引起较高程度的链霉素耐药性。88位氨基酸突变菌株对链霉素的耐药性较低。链霉素耐药菌中发生rpsL基因突变的菌株约占78．69％（96／122）。其中以43位氨基酸突变为主（75．41％）。利用DHPLC技术检测rpsL基因突变，虽然不能检出缺失突变形式，但与直接测序法相比检出率为98．95％（95／96）。对所有耐受链霉素的结核分枝杆菌临床分离株而言。利用DHPLC技术可以达到77．87％（95／122）的耐药菌检出率，与序列测定法的检出率相近（96／122）。并且根据DHPLC检测图谱能够很好地判断rpsL基因的碱基突变形式。32株链酶素株的DHPLC检测图谱都与H37Rv标准株相同。结论DHPLC法是快速检测出结核分枝杆菌rpsL基因碱基突变的好方法．具有很高的特异性和敏感性。对链霉素耐药菌而言，碱基突变与结核分枝杆菌耐受链霉素类抗生素存在高度的相关关系，因此DHPLC技术用于临床早期检测结核病人对链霉素的耐药性具有良好的应用前景。     

应用部分变性高效液相色谱法检测结核分枝杆菌的耐药基因突变

目前耐药问题给结核病的控制造成很大威胁。KatG、rpoB、embB、gyrA、pncA和rpsL基因在异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氟喹诺酮类、吡嗪酰胺和链霉素的耐药中起关键作用。我们采用温度介导的异源双链高效液相色谱分析法（DHPLC）检测了结核分枝杆菌耐药基因的突变。     

变性高效液相色谱法检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变的初步探索

目的 探讨变性高效液相色谱(DHPLC)技术在MTB的利福平耐药菌株rpoB基因突变检测中的应用价值.方法 PCR扩增MTB的rpoB基因利福平耐药决定区,扩增产物与野生型DNA链形成异源双链,在65.4℃柱温下进行DHPLC分析.对DHPLC不同峰型菌株的rpoB基因片段进行测序,评价DHPLC技术的敏感度和特异度.结果 共分析46株MTB菌株,其中42株对利福平耐药,4株对利福平敏感.经DHPLC分析,产生15种不同图谱.测序结果表明,各图谱菌株突变特征不同.除D108和D24菌株的DHPLC峰形相同而突变特征不同外,其他菌株均为DHPLC峰型与基因多态性相一致,即DHPLC峰型相同则基因多态性相同,DHPLC峰型不同则基因多态性不同.结论 DHPLC具有简便快捷、高通量和自动化的特点,敏感度和特异度高,可用于快速检测耐药MTB的基因突变.     

用变性高压液相色谱技术检测耐氧氟沙星的结核分枝杆菌临床株

目的利用变性高压液相色谱（DHPLC）技术快速检测结核分枝杆菌gyrA基因的突变，从而对结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药物做出初步判断。方法提取试验菌株基因组DNA，扩增gyrA基因的氟喹诺酮药物耐受决定区（QRDR）核酸片段；分别与H37Rv标准株（或者含有单纯Ser284突变的临床分离株作为标准）的相应PCR产物混合、杂交后，利用WAVE核苷酸片段分析系统对各杂交产物进行DHPLC检测；序列测定结果与相应的DHPLC检测结果进行比较以验证DHPLC检测的准确性。采用2mg/L的药物浓度进行氧氟沙星（OFLX）药物敏感性试验，确定101株结核分枝杆菌临床分离株对OFLX的敏感性，通过比较药物敏感性和DHPLC检测结果，建立两者之间的对应关系。结果利用DHPLC检测QRDR突变与序列测定具有同样的检出率（100％），两者都能够很好地检测QRDR突变。采用单纯含有Ser284突变的临床分离株代替H37Rv作为标准进行DHPLC检测，可以检测出除Ser284突变点外所有的点突变形式。在101株结核分枝杆菌临床分离株中，有49株对2mg／L OFLX敏感；52株耐受。52株耐药菌株中，有27株能够通过序列测定和DHPLC法得到准确判定。采用含有单纯Ser284突变的临床分离株作为标准进行DHPLC检测菌株的耐药性，检测结果更准确。结论DHPLC法是快速检测出结核分枝杆菌gyrA基因碱基突变的好方法，但是碱基突变与结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药物存复杂的关系，因此该方法应用于临床检测尚需进一步验证。     

结核分枝杆菌耐药性检测新进展

结核分枝杆菌(MTB)的耐药形势日趋严重,耐药结核病的及时诊断对患者的治疗结局及结核病的控制十分重要.MTB传统的培养及药敏结果回报需时2～3个月,MTB耐药性的快速准确诊断是一个急需解决的问题.本文总结了MTB耐药性检测的传统技术包括罗氏培养及快速培养,并对比分析了其优缺点.综合国内外文献阐述了显微镜观察药物敏感性测定法的研究进展及分子生物学快速诊断技术包括线性探针杂交技术、Xpert MTB/RIF检测技术、基因芯片诊断技术及滚环扩增技术对于MTB及其耐药性检测的最新动态、各种检测方法的适用范围,并对比分析了各种检测方法的优缺点,为临床医师选择快速准确的诊断工具提供最佳的选择.     

变性高效液相色谱检测法在基因突变分析中的应用

基因存在于染色体上,是遗传的基本结构和功能单位.基因突变在生物进化及遗传某些疾病的发病中起着重要作用.     

变性高效液相色谱检测空肠弯曲菌

目的应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌的快速检测方法。方法以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因为靶基因,选择2对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌的多重PCR体系,扩增产物分别为287bp、159 bp。采用22株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到10 pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24 h可被检出。结果在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性。结论本研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌的快速检测。     

结核分枝杆菌耐药性检测技术进展

耐药MTB的流行与传播是导致结核病高发病率和高病死率的重要因素,MTB耐药性检测研究也是结核病研究的热点和难点问题.目前普遍应用的罗氏培养药敏试验的需时较长、准确性差,分枝杆菌快速培养系统虽能缩短检测时间[1],但仍需4～6周,远不能满足临床诊治需求.因此,迫切需要快速、灵敏、简便和价廉的耐药性检测新技术.近年来出现的耐药表型检测和耐药分子检测技术使MTB耐药性检测技术有了较大发展,并具有临床应用前景,现介绍如下.     

结核分枝杆菌耐药性检测专家共识

耐药结核病尤其是耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)是目前临床亟待解决的难题之一,而对抗结核药物进行药物敏感性试验(DST)可为耐药结核病的诊断提供实验室依据。本专家共识简要地介绍了我国临床常用的结核分枝杆菌(MTB)DST方法(包括表型DST和分子DST);提出了MTB耐药性检测策略和正确判读检测结果的建议;指出目前DST检测技术和临床应用存在的问题,并对未来DST的发展前景进行了展望。     

应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌链霉素耐药性的研究

目的研制一种新型DNA芯片,用于快速检测结核分枝杆菌耐链霉素rpsl和rrs基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpsl和rrs基因序列设计探针并制作DNA芯片,用TAMRA(四甲基罗丹明)标记的引物扩增结核分枝杆菌rpsl和rrs基因突变热点的片段,与DNA芯片杂交,同时以聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)和DNA测序法为对照。结果144株结核分枝杆菌临床分离株中,42株链霉素敏感株的PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同;102株链霉素耐药株中有79株检测到rpsl基因突变77.5%(79/102),其中74株为43位密码子AAG→AGG突变,5株为88位密码子AAG→AGG突变;rrs基因突变5%(5/102),4株为513位密码子A→C突变,1株为516位密码子C→T突变,均与PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果一致,余18株未检测到突变。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐链霉素分离株的rpsl和rrs基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。     

高效液相色谱在老年医学研究中的应用

色谱技术是俄国植物学家于1903～1906年首次发现的,它是利用被分离的混合物各组分在两相中分配系数不同,从而使各组分分离。 50年代以前的色谱技术主要是液相色谱,它的分离测定均在液态下进行,因而适用性广。但由于它分析速度慢,分离效率低,并且缺乏相应的检测技术,应用受到限制。 近30年发展起来的气相色谱灵敏度很高。但只能分析沸点500℃以下、分子量450以下的物质,这仅占有机物的15％～20％,也难于分析大多数无机物。并且,气相色谱是用气相作流动相;因载气种类少,性质也较接近,改变载气对柱效和分离能力影响小,应用也受到限制。     

结核分枝杆菌耐药性检测方法的研究进展

结核分枝杆菌耐药基因的检测是结核病诊断和治疗中的难题之一,近年来已有多种方法用来检测耐药基因,笔者从在我国获得注册证书的试剂盒,在国际上获得注册证书尚未进入我国的试剂盒和临床前研究的新方法3个方面概述了结核分枝杆菌耐药性检测方法的研究进展。     

荧光染色法在结核分枝杆菌检测中的应用

目的 观察荧光染色法在肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌的阳性率检测中的临床应用价值.方法 250例肺结核患者,收集深咯痰标本,每份痰标本涂抹2张玻片,分别采用荧光染色法（荧光染色组）和抗酸染色法（抗酸染色组）检测结核分枝杆菌,比较两组阳性率.结果 荧光染色组检出结核分枝杆菌阳性109例,阳性率为43.60％,其中（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）、（＋＋＋＋）阳性率分别占13.20％、11.60％、8.40％、10.40％;抗酸染色组阳性86例,阳性率为34.40％,其中（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）、（＋＋＋＋）分别占6.80％、8.80％、8.00％、10.80％.两组总阳性率及（＋）阳性率比较P均＜0.01.与抗酸染色组比较,荧光染色组检测痰中结核杆菌的灵敏度、特异性均较高（P均＜0.05）.结论 荧光染色法检测肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌的阳性率高于抗酸染色法,且差异主要体现在含菌量少的痰标本上,这对于那些病变活动性轻,排菌量较少的肺结核的诊断具有重要意义.     

基因芯片检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性研究

目的　研究基因芯片在检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性中的应用。方法根据与利福平和异烟肼耐药相关的 4条基因上的 11个位点的 30种单核苷酸多态性设计制作芯片 ,用芯片检测结核分枝杆菌的基因突变 ,从而判断其耐药性。结果　用基因芯片在 110株异烟肼耐药株中检测出 85株 (73 3% ) ,在 30株异烟肼敏感株中检测出 2 2株 (73 3% ) ,在 94株利福平耐药株中检测出 77株 (81 9% ) ,在 4 6株利福平敏感株中检测出 4 0株 (87 0 % )。芯片检测结果与部分样本的测序结果完全相符。结论　用DNA芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性具有较高的特异性和敏感性 ,该法快速、精确 ,可以应用于结核分枝杆菌耐药性的检测。     

变色培养法检测结核分枝杆菌耐药性的研究

目的 建立一种快速、廉价、方便的结核分枝杆菌药敏方法，缩短结核分枝杆菌药敏试验时间。方法 采用变色培养法与绝对浓度法对照实验，验证新方法的灵敏度和特异性。结果 两试验可比性好，特异性为100％，新方法比传统绝对浓度法平均缩短时间2～3周。结论 变色培养法优于传统绝对浓度法，适用于在基层推广。     

结核分枝杆菌早期分泌抗原ESAT-6的高效表达及其在结核分枝杆菌特异细胞免疫检测中的应用

目的 获得纯化的MTB早期分泌抗原ESAT-6,并对其抗原性及在MTB特异性细胞免疫检测中的应用价值进行评价.方法 采用基因工程技术表达MTB ESAT-6蛋白,通过Western blot法分析ESAT-6与特异性抗体的反应性.以纯化ESAT-6为抗原,用酶联免疫斑点技术(Elispot)检测肺结核患者、健康医务工作者、自然村居民外周血γ-干扰素的应答水平,同时与用于隐性结核感染及结核病诊断的QFT-G检测法进行平行比较,对其在MTB感染细胞免疫检测中的应用价值进行评价.结果 成功表达和纯化了 ESAT-6重组蛋白,所表达的蛋白能被特异性抗ESAT-6抗体识别,同时与肺结核外周血单核细胞反应,刺激后者产生γ-干扰素.Elispot技术检测肺结核患者、健康医务工作者、自然村居民的阳性率分别为36/49(73.5%)、11/62(17.7%)、17/194(8.8%),同时用QFT-G法对肺结核患者和健康医务工作者进行检测阳性率分别为38/49(77.6%)、14/58(24.1%),两种检测方法比较敏感度(73.5%,77.6%;χ2=0.381,P>0.05)和特异度(82.3%,75.9%;χ2=0.406,P>0.05),差异无统计学意义.结论 利用pET原核表达系统可成功地表达和纯化MTB ESAT-6重组蛋白,以ESAT-6为抗原建立的Elispot外周血IFN-γ检测技术与QFT-G的特异性和敏感性相当,可用于结核病的辅助诊断.     

RPA-LFD技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性的应用

目的 基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧向流动试纸条(LFD),建立可快速检测结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药的方法,并初步评价其临床应用价值.方法 采用比例法对182株结核分枝杆菌临床分离株进行利福平耐药性检测.建立RPA-LFD技术,检测182株菌株中利福平耐药决定区(RRDR)常见突变位点rpoB 531、...     

应用变性高效液相色谱法检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性

目的建立DHPLC快速检测Hp对克拉霉素耐药性的新方法。方法抽提56份经纸片琼脂扩散法鉴定为克拉霉素耐药的Hp菌株DNA及其对应的胃粘膜组织标本DNA,通过PCR技术扩增23S rRNA区187 bp基因,运用DHPLC技术对PCR产物进行突变分析,并进行DNA测序。结果56份克拉霉素耐药的Hp菌株DNA经DHPLC分析,有51份存在异源双链峰,测序证实均存在点突变,5份无异源双链峰,测序证实无点突变,故DHPLC对基因突变耐药菌株的敏感性和特异性为100%,而且56份组织标本DNA检测结果与菌株DNA检测结果一致。结论DHPLC可应用于Hp对克拉霉素耐药性的快速检测,具有广阔的临床应用前景。