抗人黑色素瘤嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的：构建嵌合型抗人黑色素瘤抗体的真核表达载体，并实现真核表达。方法：从3株杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因，插入含有抗人Tac抗原信号肽以及人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA中，转染293T细胞，进行嵌合抗体表达，并用RT-PCR、ELISA、Westem blot免疫印迹等对抗体表达鉴定。结果：成功构建了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体，并实现其真核表达。RT-PCR证实了该抗体在mRNA水平上的表达，ELISA和Westemblot证实了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体的表达。结论：成功表达了抗人黑色素瘤人-鼠嵌合抗体。     

抗rh-bFGF嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的 :构建并在真核细胞中表达抗人重组碱性成纤维生长因子 (rh bFGF)人 鼠嵌合抗体。方法 :从分泌抗rh bFGF鼠单抗(mAb) 1F11的杂交瘤细胞中扩增、克隆VL、VH 基因 ,从质粒pMDHC和pMDLC中扩增、克隆CL、CH 基因 ,测序鉴定后插入真核表达载体 ,并转化二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO dhfr- )细胞进行表达。采用间接ELISA检测表达产物的人源性和其抗原结合活性。结果 :序列测定表明所克隆的抗体基因是功能性抗体的V区基因 ,在转化细胞的培养上清中可检测到抗rh bFGF嵌合抗体的表达。ELISA试验证实 ,该嵌合抗体具有人源C区 ,并具有鼠mAb 1F11的抗原结合活性。结论 :在真核细胞中成功地表达抗rh bFGF的人 鼠嵌合抗体 ,为其临床应用研究奠定了基础     

抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 尝试将１株来源于人源性噬菌体抗体库的抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ,转换成完整的抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ。方法 采用重叠ＰＣＲ方法,在抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ和Ｖκ的ＶＨ基因的５’端接上人工合成的人κ链的前导序列,构建表达完整ＩｇＧ１的真核表达载体,转染ＧＨＯ（ＤＨＦＲ＾－）细胞,用ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ和免疫印迹检测抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ的表达。通过ＤＨＦＲ／ＭＴＸ体系及金属离子诱导提高Ｉｇ表达。结果：获得     

正常人血清中IgG类抗角蛋白自身抗体的免疫印迹分析

抗角蛋白自身抗体是正常人天然自身抗体的一部分。本研究用一组角蛋白对正常人血清中的ＩｇＧ 类抗角蛋白抗体进行了免疫印迹分析。２１ 份正常人血清均可识别至少一种角蛋白成分， 可区分出１４ 种反应性模式。３ 份合并血清的反应性模式高度均一。结果表明， 血清抗角蛋白抗体普遍存在， 但在人群中呈高度异质性； 不同个体血清可互补。角蛋白 抗角蛋白系统可能是天然自身抗体研究的一个理想模式系统。     

组织因子人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建组织因子人-鼠嵌合抗体的真核共表达载体pCN40-V_L-V_H,并转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行稳定表达,以克服鼠源单克隆抗体(mAb)用于临床的局限性.方法:从分泌鼠抗人的组织因子mAb的杂交瘤细胞株(克隆号:mTA)中抽提总RNA,经RT-PCR扩增mAb V_L和V_H的基因序列,构建重组真核表达载体pCN40-V_L-V_H,并进行酶切鉴定和测序.通过磷酸钙沉淀法转染CHO细胞,以终浓度800 μg/L G418筛选阳性细胞,通过间接ELISA、Western blot检测细胞培养上清中嵌合抗体的表达量、活性及特异性.结果:成功构建了抗人组织因子嵌合抗体真核共表达载体pCN40-V_L-V_H并在CHO细胞中表达.ELISA、Western blot证实,表达的抗组织因子嵌合抗体为人鼠嵌合抗体,该抗体能与重组人TF抗原特异性的结合且表达量为51.25 mg/L.结论:成功地构建并在真核细胞中表达了抗人组织因子嵌合抗体,为进一步的研究奠定了基础.     

家兔抗角蛋白自身抗体独特型抗体的产生及临床意义

目的 观察长期注射大剂量同种异体抗角蛋白自身抗体（AKautoAb)后,家兔血清中针对抗角蛋白自身抗体（AKautoAb)独特型抗体的产生,方法 肌肉注射亲和层析纯化的AKautoAb(5mg/kg),隔日1次,连续90d,用ELISA检测血清中的抗独特型抗体,结果 注射AKautoAb的家兔产生了针对AKautoAbF(ab′）2片段的抗独特型抗体,于给药4wk血清抗体滴度达高峰,以后逐渐降低,结论 长期注射大剂量同种异体AKautoAb的家兔可产生免疫耐受性。     

天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的噬菌体呈现的scFv的构建及表达

目的:构建并表达噬菌体呈现的天然抗角蛋白单克隆抗体(mAb)3B4的单链抗体(scFv),并测定其活性。方法:分别以pMD18TmAb3B4VH和pMD18TmAb3B4VL为模板进行PCR,扩增mAb3B4的VH和VL基因,然后将其依次插入噬菌体表达载体pscMH中。经DNA序列测定正确后,转化大肠杆菌,用辅助噬菌体VCSM13超感染诱导表达scFv;用ELISA检测其与亲本mAb3B4的抗原结合活性的改变。结果:对扩增的mAb3B4的VH和VL基因进行测序,结果表明VH基因与原序列完全一致,VL基因在骨架区FR1有1个碱基发生突变。用VCSM13超感染后能检测到scFv的表达,其与亲本一样具有多反应性,但抗原结合模式不完全相同。结论:成功地构建并表达了天然抗角蛋白mAb3B4噬菌体呈现的单链抗体,表达的scFv与mAb3B4的抗原结合活性有一定的差异,为探讨天然自身抗体的抗原结合模式奠定了基础。     

不同种类抗角蛋白抗体的应用比较

抗角蛋白抗体是鉴别上皮性肿瘤的有效标记物之一,由于角蛋白分子量多种多样,故形成之抗体亦不完全相同,其免疫反应亦异。本文应用8种不同种类之抗角蛋白抗体(其中5种系北京生研所提供)对87例各种类型之肿瘤比较了它们在免疫组化反应上的差异。结果显示,多克隆抗体k-D反应谱系较广,且对低分化鳞癌的反应亦较好,但非特异性染色较重易造成判断上的困难。单克隆抗角蛋白抗体的特异性较强,非特异性染色轻。但反应谱较窄。其中HK2对腺癌的敏感性较高,如将HK2、HK5按1∶1比例混合使用则更可提高其对腺癌的反应程度,同时还相应提高了对鳞癌的反应能力。     

人源性抗HFRS病毒抗体基因真核表达载体的构建及鉴定

构建人源性抗ＨＦＲＳ病毒基因工程抗体基因的表达载体,为其进一步在真核细胞中表达奠定基础。方法：经多次克隆将人源性抗ＨＦＲＳ病毒抗体可变区基因与启动子,增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真有达元件及人抗体恒定区基因和抗生素选标记基因相连接。     

抗甲肝病毒人源基因工程全抗体分子在杆状病毒中的表达

目的 探讨人源抗甲型肝炎病毒全抗体分子在杆状病毒中的表达。方法 将获得的人源抗甲肝病毒中和性抗体Fab段基因克隆入含信号肽及Fc的杆状病毒表达载体中并在杆状病毒细胞中表达。结果 获得了中和性人源抗甲肝病毒全抗体分子的表达产物并进行了纯化，轻重链表达产物位置大小正确，HAFc16抗体能与具有中和活性的鼠抗甲肝病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应，并能在体外中和甲肝病毒，另一株HAFc78抗体同样具有体外中和甲肝病毒的活性，但系抗不同位点的抗体。结论 获得的人源抗甲肝病毒全抗体分子表达产物具有很好的体外中和甲肝病毒的活性，且为抗不同位点的抗体，为这些抗体的进一步开发及应用打下了基础，为防止甲型肝炎暴发流行提供应急措施。     

人源抗-HAV Fab真核表达载体的构建及表达

目的 构建人源抗－ＨＡＶＦａｂ真核表达载体并进行表达。方法 采用ＤＮＡ重组技术将抗体重轻链基因与信号肽基因连接,并分别插入真核表达载体ｐＣｄｈｆｒｌ、ｐＣＤＮＡ３．１;以脂质体介导法转染ＣＨＯ细胞,经Ｇ４１８筛选细胞,ＥＬＩＳａｂ基因的表达。结果 成功地构建了Ｆａｂ表达载体。转染细胞后,经ＥＬＩＳＡ检测,细胞增养上清中有抗原结合活性的Ｆａｂ片段。结论Ｆａｂ真核表达载体的构建及其在ＣＨＯ细胞中的表达     

人MAdCAM-1真核表达载体的构建及其表达细胞株的建立

目的:建立表达人MAdCAM-1的细胞模型。方法:从pUC21/hMAdCAM-1质粒酶切下hMAdCAM-1全长cDNA片段,将其克隆于巨细胞病毒载体pCIneo中,构建出由CMV启动子控制的重组真核表达载体pCIneo-hMAd,经脂质体介导转染至CHO细胞,以G418筛选抗性克隆。结果:筛选出的阳性克隆细胞以免疫荧光和免疫酶标染色法检测,表明有人MAdCAM-1分子表达;其细胞裂解物经免疫印迹分析,证实约63 kD的新增蛋白带与抗 hMAdCAM-1抗体有特异性结合反应;淋巴细胞粘附实验结果提示表达产物具有一定的功能活性。结论:成功地获得了表达人MAdCAM-1分子的细胞株,为进一步研究其生物学功能及其作用机制奠定了基础。     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

人-鼠嵌合抗体表达载体的构建和抗人HER2抗体的表达

目的 :构建表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体 ,用于以嵌合抗体的形式表达PCR获取的小鼠抗体可变区基因 ,以便将人 鼠嵌合抗体应用于临床治疗。方法 :用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建人 鼠嵌合抗体的表达载体 ,并转染真核细胞 2 93T进行表达。用RT PCR、FACS和ELISA进行抗体表达的鉴定。结果 :利用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建了用于表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体。用本研究设计的引物 ,扩增小鼠抗人HER2抗体的V区基因片段 ,酶切后先后插入所构建的载体的相应克隆位点 ,转染 2 93T细胞可将PCR获得的小鼠抗体V区基因片段表达为人 鼠嵌合抗体。用RT PCR、FACS和ELISA证实 ,本系统可表达嵌合抗体。结论 :构建了人 鼠嵌合抗体的真核表达载体 ,并证实了其可在 2 93T细胞中表达。     

HSV-1gC糖蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建单纯疱疹病毒1型(HSV-1)囊膜糖蛋白C(gC)哺乳动物表达载体pCI-mCMV-gC-1-IRES-DHFR-L22R,实现其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的稳定表达.方法:利用基因重组技术构建同时克隆有gC-1基因和中国仓鼠二氢叶酸还原(DHFR-L22R)基因的真核表达载体pCI-mCMV-gC-1-IRES-DHFR-L22R,按Lipofectamine(TM)2000说明书转染野生型CHO-K1细胞,在G418和氨甲喋呤(MTX)双筛选压力下筛选稳定表达细胞株,Slot blot方法测定重组蛋白的表达,并用His-Ni琼脂糖填料进行目的蛋白纯化,纯化后West-ern blot检测.结果:成功构建了真核表达载体pCI-mCMV-gC-1-IRES-DHFR-L22R.经过两轮筛选获得稳定表达HSV-1型邪基因的细胞系,Western blot成功检测到目的蛋白.结论:HSV-1 gC在CHO-K1细胞中成功表达,并具有良好的特异性结合活性,为进一步的实验研究和临床应用提供了基础.     

抗CEA嵌合小分子抗体的构建与表达

目的 构建表达抗CEA小分子抗体,以利于放射免疫诊断及导向治疗。方法 构建CEA单链抗体基因,克隆入载体pKpL-3a,在大肠杆蓖中包涵体表达,ELISA检测活性,将轻重链基因克隆入分泌型表达载体pSCMH,在大肠杆菌中表达。ELISA检测活性,钭CEA嵌合抗体的轻链和Fd基因克隆入杆状病毒表达载体pAcUW51中,在sf9细胞中分泌表达,ELISA检测活性及测定产量,竞争抑制ELISA测定其识别的抗原表位。结果 多种方法复性的包涵体及原核分泌表达的单链相同的表位。结论 该CEA抗体基因在大肠杆菌中不能表达出有功能的分子。而在昆虫细胞中表达了具自学成才性抗体分子,某些抗体基因只有在真核细胞中才能表达出有功能的抗体分子。     

人T细胞免疫球蛋白粘蛋白-4基因真核表达载体的构建和生物信息学分析

目的:构建人T细胞免疫球蛋白粘蛋白-4(TIM-4)基因的真核表达载体,用生物信息学分析了解TIM-4蛋白的特性。方法:采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,逆转录合成cDNA,以此为模版,两步法RT-PCR扩增TIM-4,将其克隆至表达载体pcDNA3.1(+)中,构建FTIM-4质粒,通过PCR及测序进行鉴定。同时,我们构建pEGFP-N1-TIM-4真核表达载体,并测序鉴定其准确性;将pEGFP-N1-TIM-4质粒转染CHO细胞,用RT-PCR和荧光显微镜证实其表达。应用生物信息学初步分析TIM-4蛋白的物理化学性质、结构域和功能。结果:从逆转录的cDNA扩增出TIM-4;经PCR、酶切鉴定、测序分析表明扩增产物与GenBank提供的序列完全相同。真核表达载体pEGFP-N1-TIM-4在CHO细胞中稳定表达,表达蛋白主要位于细胞质和细胞膜上。生物信息学分析表明TIM-4蛋白为不稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,含约10.32%的α-螺旋,29.89%的延伸链,59.79%的不规则卷曲,有1段由24个氨基酸组成的信号肽。亚细胞主要定位于细胞质、细胞核、分泌系统的小囊泡、线粒体、内质网、高尔基体上。功能分析预测该蛋白具有受体和信号转导功能。结论:成功构建TIM-4基因真核表达载体,利用生物信息学分析洞察了TIM-4蛋白的性质,为进一步研究该基因的免疫调节机制奠定了基础。     

人PSCA基因真核载体的构建与表达

目的 克隆人PSCA(prosaae stem cell antigen)分子的cDNA,构建PSCA基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 从PSCA阳性细胞系LNCaP中提取总RNA,逆转录为cDNA.根据编码人PSCA的基因序列设计引物,以cDNA为模板,采用PCR技术扩增PSCA基因,将该基因插入到pcDNA3.1(+)真核载体,构建pcDNA3.1(+)-PSCA表达质粒.经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pcDNA3.1(+)-PSCA转染Hela细胞,检测其体外瞬时表达.结果 测序证实得到人PSCA基因序列,序列分析显示没有发生无义突变.RT-PCR和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞有目的 基因和分子的表达.结论成功克隆人PSCA基因,并在真核细胞中获得表达,为进一步构建基于PSCA的肿瘤疫苗奠定了基础.