阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

脂质体介导外源基因体外转染精子的研究

为探索精子作为外源基因的载体建立转基因小鼠的可行性。方法我们从性成熟小鼠的输精管及部分附睾管中取出精子，与阳离子脂质体包裹的ＤＮＡ混合孵育之后将其注入超排卵小鼠的阴道内，４８ｈ后收集Ⅱ细胞胚胎细胞。结果（１）精子可转染上外源ＤＮＡ，转染率达５３％；（２）转染有外源ＤＮＡ的精子可使Ⅱ细胞期胚胎携带上外源基因，携带率为１１．５％。结论小鼠输精管及附睾管内的精子可被脂质体包裹的外源ＤＮＡ转染并可作为载体     

基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较

将外源基因导入真核细胞的方法很多。我们通过对绿色荧光蛋白(GFP)报告基因在真核细胞中表达的研究,比较了较常用的两种方法一脂质体转染法和磷酸钙转染法。研究结果表明：脂质体转染法的转染效率较磷酸钙转染法高,且简单易行,是外源基因导人体外培养细胞内较理想的方法。     

阳离子脂质体介导的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

【目的】探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。【方法】用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lacZ报告基因的质粒 pCAGGS lacZ按 3种方法转染小鼠脾细胞 ,①常规方法直接转染 ;②脾细胞经刀豆球蛋白A(ConA)活化后再按常规方法转染 ;③用黏附辅助脂质体法 (adhesion assistedlipofection ,AAL)转染脾细胞。转染效率用X gal染色法测定。【结果】上述 3种方法的转染效率依次为 <0 0 10 ,0 0 5 7及 0 199,经方差分析 ,3种方法转染效率的差异有显著性 (P <0 0 1,n =3)。【结论】AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

非病毒载体介导神经干细胞基因转染的效果观察

目的 寻找较佳的神经干细胞非病毒载体基因转染方法。方法 采用磷酸钙、不同种类脂质体、Fugene 6和Nucleofector法将绿色荧光蛋白基因转染于神经十细胞，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染结果。结果 荧光显微镜观察和流式细胞仪检测结果表明，转染效率从高到低依次为Nucleofector法、DMRIE-C介导、FuGene6介导、Lipofectamine和磷酸钙转染，组间均存在显著差异。结论 Nucleofector法和DMRIE-C脂质体介导是神经干细胞基因转染的较佳方法。     

不同阳离子脂质体介导基因转染效率的比较研究

目的评估不同脂质体介导基因转染条件及效率。方法以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，比较三种阳离子脂质体（lipen、lipotecfamine和Dosper）在不同的脂质体：DNA比例、不同细胞汇合度、不同转染时间及血清存在条件下转染情况。通过x-gal染色法观察不同脂质体的转染效率。结果三种阳离子脂质作的最优条件不同。Dosper转染效率最高，蓝染细胞达18％。结论通过条件优化可使脂质体转染效率提高。有望成为一种有效的非病毒基因转移方法应用于基因治疗。     

三种方法转染绿色荧光蛋白质粒的效果评价

目的比较常见的真核细胞转染技术,评价采用绿色荧光蛋白为报告基因来观察细胞转染效率高低的方法。方法 分别采用磷酸钙法、电穿孔法和脂质体法将pEGFP-C1质粒转染COS-7细胞,对每种方法的转染效率及对细胞的毒性进行评价。结果脂质体法的转染率为67%,电穿孔的转染率为43%,磷酸钙法的转染率为28%。脂质体法转染对细胞的毒性最小。结论采用绿色荧光蛋白为报告基因的真核细胞转染技术中,脂质体法是效率高、安全性大的方法。     

阳离子脂质体转染效率影响因素的研究进展

目前用于基因转染的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体的转染效率最高,但由于其容易造成感染和致癌性等安全性问题限制了它在临床中的应用。阳离子脂质体(cationic liposomes)是一种非常具有发展前景的非病毒基因载体。其生物膜特性,能使其转运的基因保持生物活性,保护基因免受溶酶体的降解,且具有无免疫原性、操作简单、对转移基因大小没有限制、重复性好、可自然降解等优点,而成为世界性的研究热点。     

不同转染方式对腺病毒介导的基因转染效率的影响

目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法:将纯化的GFP重组腺病毒分别用单次转染和多次转染两种不同方法转染MSC,观察其感染效率和GFP表达水平。结果:培养的MSC呈CD90和CD105强阳性,且具有成骨、成脂肪等多向分化能力;携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒单次转染和多次转染P3代MSC都呈现出浓度依赖性;单次转染在80MOI时转染效率最高,而多次转染在20MOI时转染效率即已达90%。结论:建立稳定、高效表达Ad-GFP的骨髓间充质干细胞实验体系,为MSC的标记及示踪奠定基础。     

阳离子脂质体介导pEGFP-N1转染HepG2.2.15细胞效率初探

目的探讨阳离子脂质体介导绿色荧光蛋白质粒转染HepG2.2.15细胞的转染效率。方法以阳离子脂质体包裹绿色荧光蛋白质粒转染HepG2.2.15细胞,观察不同配比的脂质体与绿色荧光蛋白的转染率。结果对照组未见绿色荧光蛋白表达,各实验组HepG2.2.15细胞均可见绿色荧光蛋白表达,表达量随脂质体浓度增加而增加(P<0.05),最高转染率为23.22%。结论阳离子脂质体能有效地介导绿色荧光蛋白质粒转染HepG2.2.15细胞。     

阳离子脂质体介导细胞因子基因对小鼠肝癌抑制的作用

目的观察阳离子脂质体介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因对小鼠肝癌的抑制作用。方法构建含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒载体,用阳离子脂质体ＬｉｐｏｆeｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导的含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒ＤＮＡ分别体外转染小鼠肝癌细胞株ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,并在荷瘤小鼠体内分别直接注射上述阳离子脂质体－ＤＮＡ复合物,观察瘤体大小及小鼠生存期。结果两种阳离子脂质体介导的细胞因子转染后都具有生物学活性,转染效率为１０％左右,瘤内注射后均能延长荷瘤小鼠的生存期。ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子的治疗效果较佳。结论ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因均具有抑制小鼠肝癌生长、延长荷瘤小鼠生存期的作用,ＤＯＳＰＥＲ的效果较好。     

GFP质粒DNA/阳离子脂质体复合物的制备及其体外表达

目的 为基因免疫和基因治疗寻找一种简单、经济、有效的DNA投递系统。方法 采用逆向蒸发法,用卵磷脂、胆固醇、十八胺制备成阳离子脂质体包封含绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒pEGFPC1,对三种不同DNA加入量所形成的DNA／脂质体复合物的微球形、包封率、电荷性、转染真核细胞的效果以及对细胞的毒性作用进行初步检测研究。结果 所获得的DNA／脂质体复合物呈球形、平均粒径为562nm;包封率达55％～65％,为阳离子脂质体;都能有效转染真核细胞,但转染效率有差异,DNA／脂质体混悬液中DNA含量、混悬液的加入量以及细胞的作用时间,都对细胞毒性有不同程度的影响。结论 该方法可作为提高基因免疫效果的简单、经济、有效的手段之一。     

Cationic Liposome-mediated bcl-xl Gene Transfection into Human Keratocytes

The efficiency and safe range of Lipofectamine^TM 2000 (LF2000)/bel-xl applied in human keratocytes, the optimal ratio of LF2000/bcl-xl and the bcl-xl gene expression in human keratocytes were investiaged. By using trypan-blue staining, the effects of LF2000 and bcl-xl on the survival rate of the cultured human keratocytes were measured respectively. By using semi-quantitative RTPCR, the efficiency and the expression of LF2000-mediated bcl-xl transfection into keratocytes were examined. The results showed that the survival rate of human keratocytes had no signficant change in the presence of LF2000 (20μg/ml) or bcl-xl (10μg/ml) for 24 h. I.F2000 could effectively mediate the transfection of exogenous gene bcl-xl into human keratocytes. The best transfection efficiency could be obtained when the ratio of bcl-xl/LF2000 was 1:8. One day after transfection, the positive cells for bcl-xl could be detectable, and the positive rate reached the peak-on the posttransfection day 3 (48.3%), then gradually decreased. Fifteen days after transfection, there were few positive cells. It was suggested that LF2000 could effectively transfer the exogenous gene bcl-xl into human keratocytes without obvious toxicity during a concentration range. LF2000/bcl-xl may be likely to play an important role in gene therapy of human keratocytes.     

超声/微气泡SonoVue介导体内和体外基因转导的研究

目的初步探讨超声联合微气泡超声造影剂SonoVue介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导的可行性,并研究不同超声波参数和基因用量与转基因效率之间的关系。方法利用不同强度和不同剂量超声波和声学造影剂SonoVue,介导人肝癌细胞株HepG2和BALB／c小鼠右侧胫前肌内增强型绿色荧光蛋白报告质粒的转导,分别直接或组织冰冻切片后在荧光显微镜下观察,并计算转导效率。结果超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养的HepG2细胞和小鼠胫前肌内pEGFP-C1基因转导,HepG2细胞以1MHz 1．5W／cm^2超声波基因转导效果最好;小鼠胫前肌以1MHz3W／cm^2的超声波转基因效果最好。结论超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导,1MHz超声波是转基因的理想频率。     

阳离子脂质体介导的Ａ20基因转染人外周血单核细胞的可行性

目的探讨阳离子脂质体介导的A20基因转染人外周血单核细胞的可行性及最佳转染条件。方法采用脂质体LipofectamineTM2000包裹pCAGGS-GFP／A20质粒转染人外周血单核细胞,通过荧光显微镜检测GFP报告基因,RT-PCR检测A20基因表达。结果应用LipofectamineTM2000介导的A20基因转染人外周血单核细胞,在2×10 6／L细胞接种浓度,脂质体与质粒的量之比为4μl：3μg时,转染效果最佳,RT-PCR证实成功获得A20目的基因的表达。结论脂质体转染法可介导A20基因在人外周血单核细胞获得表达,该研究为A20基因转染的相关实验研究提供参考依据。     

mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增生的影响

目的 探讨mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增生的影响.方法 运用电穿孔法将pcDNA3-mTOR质粒转染NIH3T3成纤维细胞,经G418筛选抗性克隆,RT-PCR和Western印迹分析检测转染组和对照组细胞mTOR mRNA与蛋白的表达,MTT方法检测细胞增生.结果 转染组细胞mTOR mRNA和蛋白质的表达显著增强(P＜0.01);MTT法检测转染组光吸收值显著大于对照组(P＜0.01);结论 mTOR基因转染成纤维细胞可获稳定表达,并明显促进成纤维细胞增生.     

可视化人鼻咽癌细胞模型6-10B-EGFP的建立

目的利用pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,建立稳定表达绿色荧光蛋白的鼻咽癌细胞株6-10B-EGFP,为整体鼻咽癌可视化研究提供良好的实验材料。方法利用脂质体转染法,将pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,通过G418抗性筛选、亚克隆扩增获得GFP稳定表达的人鼻咽癌细胞株6-10B-EGFP。结果成功获得多个稳定表达GFP的人鼻咽癌6-10B-EGFP细胞株,比较6-10B和6-10B-EGFP发现,两者生长曲线、细胞周期分布、裸鼠成瘤能力等差异都没有显著性。结论成功建立了非G418依赖、稳定表达GFP且保持母株细胞特性的人鼻咽癌细胞株6-10B-EGFP,为鼻咽癌整体可视化研究打下了坚实基础。     

不同转染方法及GFP表达载体对小鼠胚胎干细胞转染效率的比较

目的对比不同的转染方法及绿色荧光蛋白(GFP)表达载体对小鼠胚胎干细胞(ESC)的转染效率,为进一步研究ESC及衍生细胞移植示踪提供工具。方法用阳离子脂质体转染小鼠胚胎干细胞系ES-D3,对比贴壁细胞转染法、悬浮细胞转染法及不同载体pCX-EGFP、p-EGFP-C1和pIRES-hrGFP的转染效率。结果悬浮法和贴壁法转染效率分别为(90.0±4.1)%,(70.0±2.3)%,两组比较差异有显著性意义(P<0.05)。3种载体转染效率分别为pCX-EG-FP(90.0±4.1)%,pIRES-hrGFP(32.0±6.0)%,p-EGFP-C1(4.0±0.4)%。3组间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05)。结论悬浮转染法转染pCX-EGFP可获得较高的转染效率。     

人精子顶体膜相关蛋白32真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:研究人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)mRNA在体外细胞NIH3T3中的表达。方法:利用RTPCR及亚克隆技术构建pcDNA3.1( )hSAMP32质粒,实验组以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )hSAMP32真核表达载体导入NIH3T3细胞中,同时设置空白和阴性对照组(转染空载体pcDNA3.1( ))。原位杂交检测hSAMP32mRNA在3组细胞中的表达。结果:①RTPCR扩增产物与预期的目的基因hSAMP32长度一致。亚克隆酶切鉴定可见目的片段。②实验组阳性细胞胞浆中可见hSAMP32mRNA的表达,镜下可见蓝紫色阳性颗粒,空白和阴性对照组未见蓝紫色阳性颗粒。结论:脂质体介导基因转染法能够将pcDNA3.1hSAMP32真核表达载体高效导入NIH3T3细胞中,实现了hSAMP32基因的体外表达。