抗端粒酶核酶质粒的构建筛选及其对CNE-2Z细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的:已证实端粒酶(telomerase,TLMA)对肿瘤的进展和肿瘤细胞的无限增殖起着重要的决定作用。核酶是具有特殊核酸内切酶活性的反义RNA,可序列特异性地与靶RNA分子配对并切割靶基因RNA。有报道人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞端粒酶阳性,本实验目的是构建抗端粒酶RNA模板区特异性核酶的真核表达载体并用电穿孔法将其导入人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞,研究该核酶对CNE-2Z细胞增殖、凋亡的影响。方法:设计合成针对端粒酶RNA模板区的锤头状核酶基因teloRZ作为端粒酶抑制剂,构建3种带有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)报道基因和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因的teloRZ真核表达质粒pGFPuro-teloRZ2.1、pGFPuro-teloRZ7.1、pGFPuro-teloRZ7.7,这3种质粒的不同点在于teloRZ基因和puromycin抗性基因按3种不同方向设计,然后将上述3种质粒及载体质粒pPAT-GFP电转染CNE-2Z细胞,用荧光显微镜检测GFP表达情况;用流式细胞仪、荧光染色法检测细胞增殖指数及凋亡等指标。结果:CNE-2ZGTR7.1细胞(转染目的基因质粒pGFPuro-teloRZ7.1的CNE-2Z细胞)增殖指数(25.100±0.141)%明显低于CNE-2Z细胞(未转染质粒的细胞)的(53.663±16.981)%、CNE-2ZG细胞(转染空载质粒pPAT-GFP的CNE-2Z细胞)的(61.575±5.166)%、CNE-2ZGTR2.1     

质粒表达的短发夹状RNA特异性抑制鼻咽癌细胞的增殖

目的观察pmU6-sibclD重组体在细胞内表达的bcl-xL短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)能否特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖.方法将自行构建的表达短发夹状RNA的重组质粒转染到人鼻咽癌CNE-2Z细胞株、卵巢癌HO-8910细胞株和正常人类肝脏L-O2细胞株中,流式细胞仪检测转染率,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果bcl-xLshRNA能特异地抑制CNE-2Z细胞株的生长增殖,而对正常人类肝脏细胞株的生长增殖和HO-8910细胞中的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的表达无抑制作用.结论pmU6-sibclD重组体在细胞内表达的短发夹状RNA能特异性抑制鼻咽癌细胞的生长增殖,为质粒介导的RNAi技术运用于肿瘤的基因治疗提供一定的理论依据.     

反义寡核苷酸对K562细胞增殖和端粒酶活性的影响

 目的　研究靶向封闭端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的反义硫代寡核苷酸（ASPSODN）对K562细胞目的基因的抑制及其对端粒酶活性及细胞增殖周期和凋亡的影响 。方法　ASPSODN转染到人类红白血病细胞株K562,采用MTT法、酶联免疫吸附（ELISA）法和流式细胞术（FCM）检测K562细胞的增殖、端粒酶活性、细胞凋亡和细胞周期的改变,RT-PCR检测hTERT mRNA的表达。结果　0.6 μmol／L的ASPSODN（0.42±0.16）能明显下调hTERT表达（P＜0.05）,端粒酶相对活性降至52 %;MTT法检测显示明显抑制K562细胞增殖活性;FCM显示细胞凋亡率为10.31 %,PI染色显示细胞被阻止在G1／G0期,S期及G2／M期的细胞减少,但无特征性的凋亡峰。结论　ASPSODN靶向 hTERT 能特异性抑制K562细胞hTERT mRNA的表达,明显下调端粒酶活性,抑制K562细胞增殖,并通过降低细胞的端粒酶活性而诱发细胞凋亡。     

重组TFAR19蛋白对鼻咽癌CNE 1细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响

目的：研究重组TFAR19（TF-1 cell apoptsis-related gene 19）蛋白对鼻咽癌细胞株CNE-1端粒酶活性及端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA表达的影响，探讨重组TFAR19蛋白促CNE．1细胞凋亡的作用机制。方法：将不同浓度的高纯度重组TFAR19蛋白分别和人类鼻咽癌细胞株CNE-1共同培养后，通过7-AAD及Annexin V-PE标记进行流式细胞术分析，检测TFAR19蛋白对细胞的促凋亡效应；PT-PCR法比较试验组和对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERTmRNA的表达水平；TRAP-银染法检测重组TFAR19蛋白作用下CNE．1细胞株端粒酶活性的改变。结果：（1）一定浓度的TFAR19蛋白在未加载体的情况下，可促进细胞凋亡，加入5、10、15、20、30mg／L的TFAR19蛋白后，CNE-1细胞的凋亡率分别是：15．26％，29．48％，37．11％，54．20％，72．36％。阳性对照组（凋亡诱导剂stuanrosporin处理）与阴性对照组（PBS处理）的细胞凋亡率分别是98．37％、13．40％。（2）试验组与对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERTmRNA表达无显著差异。（3）与20mg／L以上浓度的重组TFAR19蛋白共同培养后，CNE-1细胞株端粒酶活性明显降低。结论：重组TFAR19蛋白在较高浓度下可降低鼻咽癌细胞株CNE-1的端粒酶活性，明显促进肿瘤细胞凋亡。     

RNA干扰抑制Skp2表达对人喉癌细胞系Hep-2的影响

[目的]研究RNA干扰抑制Skp2表达对喉癌鳞状细胞p27表达、细胞增殖和凋亡的作用.[方法]利用脂质体将重组质粒转染Hep-2细胞,用慢病毒系统建立干扰Skp2基团的稳定细胞株;荧光实时定量PCR和Western blot法检测转染细胞株中Skp2和p27mRNA及其蛋白表达;采用MTr法和流式细胞仪检测转染细胞的增殖和凋亡情况.[结果]通过慢病毒siRNA技术,Skp2可持续稳定抑制Hep2喉癌细胞,siRNA可诱导抑制Skp2,增加p27表达,降低细胞增殖,增加喉癌细胞的凋亡.[结论]靶向Skp2基因的siRNA对Hep-2细胞的抑制作用可能是通过上调p27基因水平来实现的,Skp2是基因疗法治疗喉癌的有利靶点.     

hTERT 短发夹状RNA 抑制前列腺癌细胞生长的研究

 目的 研究靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹状RNA（shRNA）基因转染对前列腺癌细胞体外生长的抑制效应及其促细胞凋亡作用。方法 在脂质体介导下将针对hTERT基因的shRNA表达载体psilencer-TRT转染前列腺癌细胞PC-3m，得到稳定细胞株PC-3m／shRNA-TRT。采用RT-PCR检测hTERT基因表迭情况，western blot分析各组细胞hTERT及c-myc蛋白表达变化，细胞计数并绘制细胞生长曲线，Hoechst33258染色、透射电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果 重组质粒psilencer-TRT转录生成的shRNA使实验组细胞的hTERT基因表达显著下调，抑制率约为89．02％；同时实验组细胞hTERT及c-myc蛋白水平较对照组有明显下降，细胞的生长增殖能力也显著降低（P〈0．05），生长速率明显变慢，部分细胞呈现凋亡形态学改变，凋亡率为（19．69±4．75）％。结论 hTERT短发夹状RNA能有效抑制前列腺癌细胞中hTERT表达及癌细胞生长，诱导PC-3m细胞凋亡，可望为前列腺癌的基因治疗提供新方法。     

RNA干扰靶向抑制胃癌细胞株SGC7901 hTERT基因表达

背景与目的：胃癌是全人类常见恶性肿瘤之一。在我国，胃癌居各种癌症死亡之首，其总体五年生存率仅15％～20％。在目前尚无有效一级预防措施的情况下，积极探讨有效防治胃癌的方法成为必然趋势。本研究利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术，抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达，探讨靶向hTERT基因RNAi对胃癌细胞增殖的抑制效应。方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA，构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入人胃癌细胞系SGC7901细胞株，经G418筛选，建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株。采用real time RT—PCR、MTT和PCR—TRAP法同时检测pGenesil-shRNA—hTERT稳定抑制组和未处理SGC7901细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化。结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SGC7901细胞株中，RNAi效力持续、稳定存在，hTERT mRNA表达、端粒酶活性明显降低，瘤细胞增殖被抑制。结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖，是潜在的肿瘤基因治疗新方法。     

RNA干扰hTERT基因治疗喉鳞状细胞癌的实验研究

目的:探讨RNA干扰hTERT(人端粒酶逆转录酶)基因对人喉鳞状细胞癌的治疗作用.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2.将shRNA质粒分别转染人喉癌Hep-2细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在Hep-2细胞及瘤体内的表达;以MTT法观察质粒对Hep-2细胞增殖的抑制作用;以蛋白印迹法(Western blot法)检测Hep-2细胞中hTERT蛋白的表达;以免疫组化SP法检测裸鼠瘤体内hTERT蛋白的表达.结果:pshRNA1、pshRNA2转染Hep-2细胞及pshRNA1转染瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光,hTERT蛋白表达明显下降.细胞受pshRNA1、pshRNA2转染后,其生长活性受到明显抑制.体内抑瘤实验表明,与空质粒载体组(pshRNA4)和生理盐水组相比,pshRNA1组移植瘤生长明显受到抑制.结论:表达shRNA的、hTERT基因特异的真核表达质粒能有效转染体内、外喉鳞癌细胞,并可有效抑制人喉鳞癌细胞的生长,为今后应用RNA干扰基因治疗喉癌提供重要的实验参考.     

通过小干扰RNA沉默mdr-1基因逆转卵巢癌耐药细胞株SKOV3／TAXOL多药耐药的研究

 目的　构建靶向于卵巢癌耐药细胞株中高表达的多药耐药-1（mdr-1）基因的短发夹状RNA重组质粒,探讨RNAi沉默技术逆转卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞多药耐药的可行性。方法　运用基因克隆技术构建靶向于mdr-1基因的重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1并转染至卵巢癌耐药细胞株SKOV3／TAXOL,反转录聚合酶链反应检测到mdr-1基因表达。CCK-8检测对SKOV3／TAXOL细胞增殖的抑制作用。结果　构建的重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1能明显抑制mdr-1基因的表达。蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1的SKOV3／TAXOL靶细胞的抑制率显著提高。RT-PCR检测mdr-1基因mRNA转录水平下降;pPGPU6／GFP／Neo-mdr-1明显抑制SKOV3／TAXOL细胞的增殖。结论　重组质粒PGPU6／GFP／Neo-mdr-1可有效地抑制SKOV3／TAXOL细胞内源mdr-1基因的表达和mRNA的转录,并抑制细胞的增殖和促进凋亡的发生,应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的多药耐药。为化疗耐受的肿瘤细胞提供了新的基因治疗手段。     

Effects of RNA interference targeting four different genes on the growth and proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells

To explore the effects of RNA interference targeting four different genes (VEGF, C-myc, Survivin, hTERT) on the growth and proliferation of nasopharyngeal carcinoma (NPC) CNE-2Z cells. Fluorescein-labeled short-hairpin (sh)RNA plasmids together and separately targeting VEGF, C-myc, Survivin and hTERT were built and respectively called plasmid-shVEGF-shC-myc-shSurvivin-shhTERT, plasmid-shVEGF, plasmid-shC-myc, plasmid-shSurvivin, plasmid-shhTERT. These plasmids were respectively transfected into human NPC CNE-2Z cells and xenograft tumors in nude mice. The expression of plasmids in NPC CNE-2Z cells and xenograft tumors was observed. Cell proliferation was detected with MTT assay. The mRNA and protein expression were determined by real-time PCR and western blot, respectively. The effects of plasmids on the biological behavior of CNE-2Z cells were observed with transwell invision chamber models. Apoptosis was determined with flow cytometer. The inhibitory effect of plasmids on xenograft tumors was observed in nude mice. The plasmid containing four different shRNAs could significantly inhibit CNE-2Z cell proliferation and decrease invasion ability in vitro compared with plasmids with each single shRNA (P<0.05). The plasmid containing four different shRNAs could simultaneously downregulate VEGF, C-myc, surviving, hTERT mRNA and protein expression in the CNE-2Z cells. The multiple gene shRNA could more significantly induce cell apoptosis than each single shRNA, respectively (P<0.05). The combinative silencing of these four genes had a better inhibitory effect on xenograft tumors than the silencing of each single shRNA (P<0.05). RNA interference targeting multiple genes can effectively inhibit NPC proliferation and induce apoptosis, which provides an experiment basis for NPC gene therapy.     

siRNA抑制VEGF基因表达对鼻咽癌细胞生物学行为的影响

目的:应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人鼻咽低分化鳞状上皮细胞癌细胞株CNE-2中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,研究VEGF对鼻咽癌细胞生物学行为的影响.方法:构建针对VEGF的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA,将其表达载体经脂质体LipofectamineTM2000转染至CNE-2细胞,荧光显微镜下观察转染效率,采用RT-PCR、Western blot方法检测转染后CNE-2细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达.通过流式细胞仪分析细胞周期的分布,并应用平板克隆形成实验、Transwell侵袭小室模型观察转染后CNE-2细胞恶性生物学行为的变化.结果:pU-VEGF-siRNA转染后CNE-2细胞株中VEGF mRNA和蛋白表达较pU-siCONT组、空白对照组显著下降(P＜0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降.结论:通过RNAi技术阻断VEGF的表达,可抑制CNE-2细胞的生长、增殖、迁徙,提示VEGF在鼻咽癌的发生、发展过程中起重要作用.     

RNA干扰Dub3表达对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制去泛素化酶3（Dub3）基因表达对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法 优化siRNA转染条件,将2条靶向抑制Dub3基因的siRNA载体片段（siRNA-1、siRNA-2）分别高效转染人鼻咽癌CNE-2细胞,同时设转染无义序列的空转染组及无任何处理的对照组。分别于转染24、48、72、96 h后采用实时定量PCR（qPCR）检测Dub3表达水平以筛选抑制率高的感染载体用于后续试验。噻唑蓝法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染48、96 h后的细胞凋亡和细胞周期情况,采用Western blotting检测各组转染96 h后细胞分裂周期蛋白25A（Cdc25A）的表达情况。结果 转染组的Dub3 mRNA水平均低于空转染组和对照组（P＜0.05）,且选择干扰效率高的siRNA-1载体进行功能学研究;与其余两组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及caspase-3活化率均升高,且G0/G1期细胞比例升高,但S期和G2/M期细胞比例均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）;抑制组转染后的Cdc25A 水平降低,与空载体组和对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）。空载体组和对照组以上指标的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 通过siRNA抑制Dub3基因表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞,对鼻咽癌的防治有一定价值。     

miR-429在鼻咽癌细胞中的表达及其对细胞增殖、迁移的影响

目的:探讨微小RNA-429（miR-429）在鼻咽癌细胞中的表达及其对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法:选取本院收治的78例鼻咽癌患者为鼻咽癌组,另选取同期因其他疾病需进行鼻内镜手术患者33例为对照组。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测两组组织中miR-429的表达。体外培养人鼻咽上皮细胞NP69与鼻咽癌细胞株CNE-2,将miR-429阴性对照质粒、miR-429 mimics质粒分别转染至CNE-2细胞,分别命名为阴性转染组、miR-429过表达组,未经处理的细胞命名为空白组,采用qRT-PCR技术检测各转染组细胞中miR-429表达。MTT法检测各转染组细胞增殖情况;平板克隆细胞形成实验检测细胞菌落形成情况;Transwell检测细胞迁移及侵袭能力;蛋白免疫印迹（Western blot）检测E盒结合锌指蛋白（ZEB1）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、钙黏附蛋白E（E-cadherin）蛋白表达量。结果:鼻咽癌组织中miR-429表达水平显著低于对照组（P＜0.05）,且CNE-2细胞中miR-429表达水平显著低于NP69细胞（P＜0.05）;miR-429过表达组miR-429表达水平显著高于空白组、阴性转染组（P＜0.05）;miR-429过表达组细胞增殖能力显著低于空白组、阴性转染组（P＜0.05）;miR-429过表达组细胞菌落形成、迁移细胞及侵袭细胞数量均显著低于空白组、阴性转染组（P＜0.05）;miR-429过表达组细胞中ZEB1、MMP-2蛋白表达水平显著低于空白组、阴性转染组,而E-cadherin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。结论:鼻咽癌细胞中miR-429呈低表达,miR-429过表达后可显著抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭。     

lncRNA LAMA5-AS1通过上调TFPI2表达抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移

目的:检测鼻咽癌组织和细胞株中长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LAMA5-AS1的表达，观察lncRNA LAMA5-AS1对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响并探讨其作用机制。方法:荧光实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分别检测lncRNA LAMA5-AS1在68例鼻咽癌组织及62例慢性鼻咽炎组织、鼻咽癌细胞株及永生化鼻咽上皮细胞中的相对表达。选择lncRNA LAMA5-AS1表达最少的细胞株，分别转染阴性对照质粒（对照组）或载有lncRNA LAMA5-AS1序列质粒（实验组）。MTS法和细胞划痕实验分别检测高表达lncRNA LAMA5-AS1对细胞增殖和迁移能力的影响。qPCR检测高表达lncRNA LAMA5-AS1对组织因子途径抑制物2（tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）基因mRNA表达的影响，Western blotting检测TFPI2蛋白和ERK信号通路蛋白表达。结果:与慢性鼻咽炎组织比较，lncRNA LAMA5-AS1在鼻咽癌组织中表达明显降低（P＜0.01）。与人永生化鼻咽上皮细胞比较，lncRNA LAMA5-AS1在鼻咽癌细胞株中表达明显降低（P＜0.01），在CNE-2Z细胞中的表达最少（P＜0.01）。与对照组比较，实验组CNE-2Z细胞的增殖能力从第3天开始明显降低（P＜0.05），实验组CNE-2Z细胞迁移能力明显下降（P＜0.01）。与对照组比较，实验组CNE-2Z细胞中TFPI2在mRNA和蛋白水平的表达明显增加（P＜0.01），ERK信号通路蛋白p-ERK、MSK1、MNK和STAT3表达明显降低。结论:lncRNA LAMA5-AS1在鼻咽癌组织和细胞株中表达明显降低，高表达lncRNA LAMA5-AS1可通过上调TFPI2基因表达、下调ERK信号通路活性，抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖和迁移能力。     

EBSS饥饿人鼻咽癌CNE-2细胞株诱导自噬的机制研究

目的:观察饥饿状态下永生化正常鼻咽上皮NP69细胞、鼻咽癌CNE-2细胞的自噬变化及自噬与凋亡的相互作用,为Baf-A1在鼻咽癌中的应用前景提供证据。方法:EBSS溶液替代DMEM溶液在NP69和CNE-2细胞中制造体外饥饿环境,Baf-A1抑制细胞自噬。应用Western blot及透射电镜检测细胞自噬,MTT检测细胞存活率,qRT-PCR检测mRNA表达。结果:与NP69细胞相比,EBSS制造的饥饿环境显著促进CNE-2细胞发生自噬,处理24时后出现大量细胞凋亡,100 nmol/L Baf-A1抑制细胞自噬可延缓饥饿诱导的细胞凋亡。qRT-PCR检测结果:EBSS作用下,LKB1、AMPK、ULK1、Beclin1、ATG5 mRNA水平均显著上升(P<0.05)。结论:EBSS通过LKB1/AMPK/mTOR通路显著诱导CNE-2细胞自噬的发生。     

姜黄素对人鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖及 凋亡的影响

 目的探讨姜黄素对人鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖及凋亡的影响及其相关的分子机制。方法体外培养的 CNE-2Z细胞经不同剂量姜黄素处理后,用MTT法观察对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡 率的改变,Western blot检测姜黄素处理后相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平的变化。结果姜黄素对CNE-2Z细 胞的生长和增殖都具有一定程度的抑制作用,阻断细胞于S期和G2/M期。姜黄素处理后CNE-2Z细胞凋亡抑 制基因Bcl-2蛋白表达减少,同时促凋亡基因Bax蛋白表达增加。 结论姜黄素可抑制CNE-2Z细胞增殖并促进 其凋亡。