亚硝基铁氰化钠处理的弓形虫速殖子的超微结构特征

目的 观察一氧化氮（NO）供体亚硝基铁氰化钠（SNP）处理的弓形虫速殖子的超微结构特征。方法 应用透射电镜观察SNP处理的速殖子的超微结构。结果 发现SNP处理的速殖子大部分具有凋亡的典型形态学特征：核染色质凝集，核固缩，核碎裂，凋亡小体形成（个别速殖子形态表现为胀亡细胞、溶解性坏死细胞和坏死型凋亡细胞特征）。结论 从形态学上证明NO供体SNP可诱导弓形虫速殖子凋亡及坏死。     

一氧化氮经钙信号转导途径诱导弓形虫速殖子凋亡

目的:为探讨胞浆Ca^2 是否为一氧化氮（Nitric Oxide,NO)诱导弓形虫速殖子凋亡的重要信号分子。方法：采用脱氧核苷酸末端转移酶（TdT)介导的缺口末端标记法（TUNEL）、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡以及应用Fura-2荧光负载技术测定胞浆游离钙浓度[Ca^2 ]i。结果：NO供体亚硝基铁氧化钠（Na2Fe(CN)5NO,SNP)诱导弓形虫速殖子凋亡过程中胞浆[Ca^2 ]i明显升高。NO清除剂，N－乙酰半胱氨酸能明显抑制SNP诱导的速殖子凋亡及SNP诱导的速殖子胞浆[Ca^2 ]i升高，而不含NO的SNP为似物，铁氰化钾[K3Fe(CN)6]不能诱导速殖子凋亡及其胞浆[Ca^2 ]i升高。胞外钙螯合剂EGTA，和L型电压依赖性钙通道阻滞剂异搏定，完全或部分抑制SNP引起的速殖子胞浆[Ca^2 ]i升高，胞内钙螯合剂BAP－TA／AM及胞外钙螯合剂EGTA明显抑制SNP诱导的速殖子凋亡。结论：证明NO的供体SNP诱导弓形虫速殖子凋亡主要通过促进胞外钙内流，胞浆[Ca^2 ]i升高所致。     

刚地弓形虫细胞培养上清对人结肠癌细胞sw480增殖与凋亡的影响

目的观察刚地弓形虫RH株速殖子与人结肠癌sw480细胞系共培养上清对人结肠癌sw480细胞增殖的影响和诱导其凋亡与坏死的情况。方法取对数生长期的人结肠癌sw480细胞(1×106),建立弓形虫RH株速殖子数目分别为2×106、4×106、8×106、16×106的共培养模型,观察弓形虫速殖子在sw480细胞中的寄生,提取共同孵育72h后的培养上清,以新鲜培养基稀释为半量,体外作用人结肠癌sw480细胞12h、24h、48h、72h,CKK-8法检测吸光度(A450值)并计算抑制率;Annexin-v-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测细胞凋亡与坏死率;琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡DNA条带;透射电镜和荧光显微镜观察细胞形态学改变。结果弓形虫RH株速殖子可在人结肠癌sw480细胞内寄生和增殖。CKK-8法检测结果显示上述共培养上清对sw480细胞增殖抑制率随上清作用时间延长均明显增大,48h最大抑制率达44.55%。流式细胞仪检测显示实验组sw480细胞早期凋亡率和晚期凋亡与坏死率随上清作用时间延长均明显增加,48h早期凋亡率达最高值(11.54%),48h以后早期凋亡率下降,晚期凋亡和坏死率显著上升,72h总死亡率可达46.11%,细胞杀伤效果明显;琼脂糖凝胶电泳显示典型的DNA云梯状条带;荧光显微镜和透射电镜观察到细胞凋亡和坏死典型形态。结论弓形虫RH株速殖子与人结肠癌sw480细胞共培养上清对体外培养的sw480细胞增殖有明显的抑制作用,并可诱导sw480细胞凋亡与坏死。     

刚地弓形虫培养上清对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的观察体外培养条件下弓形虫培养上清对乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖及其诱导其凋亡的情况。方法取对数生长期的MCF-7细胞(浓度为5×104和5×105)分别接种于不同细胞培养板,加入相同体积不同浓度弓形虫速殖子培养上清(速殖子浓度分别为2×107/mL、4×107/mL、6×107/mL、8×107/mL)与培养液共同作用12h、24h、48h、72h,四甲基氮噻唑蓝(MTT)法检测吸光度(A490值)并计算抑制率;Annexin-v-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测细胞凋亡率;AO/EB染料染色作用后细胞在荧光显微镜下观察细胞形态改变情况并拍照;琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡DNA条带。结果MTT法检测结果显示MCF-7细胞增殖抑制率随着上清浓度和作用时间增加均明显增大,各实验组抑制率与对照组比较以及对照组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测显示MCF-7细胞凋亡率随着上清浓度和作用时间增加明显增大,48h达到凋亡最高值(19.79%),48h后凋亡率开始下降,死亡率增加;荧光显微镜观察实验组培养48h的MCF-7细胞,出现细胞核固缩及凋亡小体,对照组未出现凋亡小体。琼脂糖凝胶电泳见DNA梯形条带。结论弓形虫速殖子对体外培养MCF-7细胞增殖有明显的抑制作用,并可诱导MCF-7细胞凋亡。     

刚地弓形虫RH株速殖子协同VP-16体外杀伤小鼠结肠癌细胞ct26的作用

目的探讨刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌ct26细胞周期的影响及其协同细胞周期特异性抗癌药依托泊甙(VP-16)对ct26细胞的杀伤作用。方法建立弓形虫RH株速殖子与小鼠结肠癌ct26细胞不同比例的共培养模型(虫/细胞比例分别为2:1、4:1、8:1、16:1),流式细胞仪检测24h细胞周期改变;以虫细胞比例2:1预先感染ct26细胞24h,CCK-8比色法观察不同浓度VP-16对细胞增殖抑制的改变;荧光显微镜观察VP-16(40μg/mL)对感染虫体细胞的形态学改变。台盼蓝染色观察不同浓度VP-16分别作用弓形虫RH株速殖子悬液(1×106/mL)2h、4h、12h、24h的虫体存活度改变。琼脂糖凝胶电泳观察VP-16(20μg/mL)对虫体DNA影响。结果流式细胞仪检测发现各浓度弓形虫速殖子均可明显改变ct26细胞24h周期分布,使G0/G1期细胞百分比下降,G2/M期百分比显著升高(P0.01)。2×106个速殖子感染细胞24h可使S期和G2期细胞百分比共同增长14.92%。CCK-8比色法检测结果显示虫细胞比例2:1预先感染ct26细胞24h可有效增强各浓度VP-16对ct26细胞的杀伤作用;Hochest33258染色结合荧光显微镜观察到虫体胞质寄生形态及VP-16诱导感染细胞凋亡典型形态;10μg/mL及更高浓度VP-16作用弓形虫4h以上均可使虫体全部死亡;琼脂糖凝胶电泳发现VP-16(20μg/mL)可使弓形虫速殖子DNA呈现典型的云梯状条带。结论弓形虫RH株速殖子可使小鼠结肠癌ct26细胞发生G2/M期,可有效增强细胞周期特异性抗癌药VP-16的抗癌作用,且弓形虫增殖亦明显受抑并发生凋亡。     

一氧化氮供体对弓形虫速殖子DNA含量的影响

目的　探讨亚硝基铁氰化钠 (SNP)对弓形虫速殖子DNA含量的影响。　方法　采用SNP与影响胞内 /胞外钙离子浓度的试剂作用于RH株刚地弓形虫 (Toxoplasmagondii)速殖子 ,流式细胞仪检测其DNA含量的变化。　结果　①SNP导致弓形虫速殖子DNA的损伤 ,并呈时间和剂量依赖性 ;② 2mmol/L胞外钙离子螯合剂EGTA ,2 5 μmol/L胞内钙离子螯合剂BAPTA/AM及 5 0 μmol/L钙离子拮抗剂verapamil单独处理弓形虫速殖子 ,其DNA含量与对照组相比无显著变化 ;③ 2mmol/LEGTA ,2 5 μmol/LBAPTA/AM及 5 0 μmol/Lverapamil明显减少 2mmol/LSNP所致的速殖子亚二倍体峰的比例。　结论　SNP通过改变弓形虫速殖子胞浆游离钙离子浓度 ,诱导其亚二倍体峰的出现 ,造成虫体的损伤     

弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系的建立

目的建立弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系。方法纯化弓形虫RH株速殖子,接种于NIH3T3细胞单层,进行体外培养。接种4h后,换用pH8.1的碱性培养基进行速殖子向缓殖子的诱导转化培养,RT-PCR检测缓殖子蛋白1(BAG1)基因的表达。将诱导的缓殖子重新用pH7.2的培养基在常规环境下培养,诱导缓殖子向速殖子转化。为探索温度对速殖子向缓殖子转化的影响,将接种RH株速殖子的NIH3T3细胞分别放在37℃、39℃、41℃、43℃中诱导转化培养,RT-RCR检测BAG1基因的表达。结果弓形虫RH株能在NIH3T3细胞单层中生长增殖,更换高pH值碱性培养环境后,能诱导弓形虫速殖子转化为缓殖子,RT-PCR检测出缓殖子期特异蛋白BAG1基因的表达,并且随着诱导时间的延长,BAG1基因mRNA的转录水平逐渐提高,表明有更多的速殖子转化为缓殖子。恢复pH7.2的常规培养条件,碱性诱导的缓殖子能转化为速殖子。在41℃诱导条件下,能诱导RH株速殖子转化为缓殖子。结论成功构建弓形虫体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系,为转化机制的研究奠定基础。     

Egb 761对NO供体SNP诱导的海马神经元凋亡的保护作用

目的　探讨银杏叶提取物 (EGb761 )对 NO供体硝普钠 (SNP)引起的大鼠海马神经元凋亡的影响。方法　采用 MTT比色分析测细胞存活率、 Hoechst 332 58荧光染色及 DNA琼脂糖凝胶电泳分析等方法检测凋亡。结果　不同剂量 EGb 761预处理海马神经元 6 h可剂量依赖地对抗 SNP引起的神经元凋亡 ,提高神经元的存活率 ;减少 SNP引起的核固缩、凝聚和碎裂现象 ;DNA凝胶电泳图谱未见典型的“梯子状”改变。结论　 EGb 761对 NO供体 SNP诱导的海马神经元凋亡具有明显的保护作用     

六磷酸肌醇全外对人肝癌7402细胞凋亡的影响

目的观察IP_6对体外培养的肝癌7402细胞凋亡的影响。方法用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪观察IP_6处理细胞后其生化和形态学指标的改变。结果透射电镜观察7402细胞经IP_6处理6h后,细胞核固缩,形成着边现象,至24h部分细胞脱壁,琼脂糖凝胶电泳呈现梯形条带,流式细胞仪分析显示处理细胞中出现亚二倍体峰,证实处理组细胞发生凋亡。结论 IP_6能诱导肝癌7402细胞凋亡,或许诱导细胞凋亡是IP_6的抗癌机理之一。     

弓形虫缓殖子期特异性抗原1基因的克隆、表达及对重组抗原的免疫反应性分析

目的 克隆与表达弓形虫缓殖子期特异性抗原1(BAG1)的基因,并分析重组抗原的免疫反应性。方法 诱导体外培养的弓形虫RH株速殖子向缓殖子转化,用RT-PCR法从缓殖子期弓形虫扩增BAG1基因片段,进行序列分析;构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达;表达蛋白经次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖亲和层析纯化后,蛋白质印迹(Western blotting)分析与ELISA分析其免疫反应性。 结果 从缓殖子期弓形虫克隆的BAG1基因长690 bp,构建的重组质粒pET32a(+)-BAG1经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组BAG1。Western blotting分析显示纯化的重组BAG1(SAG1)能被弓形虫慢性感染血清识别。ELISA结果表明重组BAG1抗原检测350份人血清弓形虫IgG抗体的阳性率为17.4％,显著高于重组SAG1抗原的阳性率12.6％（P＜0.05）。 结论 原核表达的重组BAG1抗原具有特异的免疫反应性。     

激光照射对弓形虫速殖子作用的流式细胞分析

用流式细胞术 (FCM)检测分析了激光照射对弓形虫 RH株速殖子的作用。结果显示 ,激光照射后弓形虫速殖子群体 DNA含量分布发生改变 ,DNA含量的第 1道数峰值 (平均值 )左移 ,第 1峰值分布范围内速殖子数占总速殖子数百分率增加 ,3.5 W和 4.5 W剂量照射组与对照组相比差异存在显著性 (P<0 .0 5 )。提示激光照射能抑制弓形虫 DNA的合成 ,减少弓形虫群体 DNA的含量     

弓形虫诱导人白血病细胞K562凋亡的实验观察

目的 探讨弓形虫对体外培养的人白血病细胞K562（简称K562细胞）有无抑制作用和诱导细胞凋亡作用。方法 取培养至对数生长期的K562细胞（浓度为5×10^-4/ml和1×10^-6/ml）分别接种于96孔培养板（100 μl/孔）及50 ml培养瓶（1.5 ml/瓶）中，加入不同浓度的弓形虫速殖子（1×10⁴、2×10⁴、4×10⁴、8×10⁴及16×10⁴个/ml），作用48 h, 用四甲基氮噻唑蓝（MTT）法检测其对K562细胞增殖的抑制作用；荧光显微镜、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果 上述不同浓度弓形虫速殖子作用48 h，对K562细胞增殖的抑制率依次为17%、28%、48%、50%及55%。各实验组吸光度（A₄₉₀）与对照组比较差异均有统计学意义（t=3.606及5.918， P<0.05； t=9.171、7.841、7.067， P<0.01）。荧光显微镜观察实验组培养的K562细胞，出现细胞核固缩及凋亡小体。琼脂糖凝胶电泳见DNA梯形条带。流式细胞仪检测到细胞凋亡峰（48 h），上述不同浓度弓形虫速殖子诱导K562细胞凋亡数分别占总数的5.53%、7.12%、10.34%、21.14% 及29.68%。对照组未出现凋亡小体。 结论 弓形虫速殖子对体外培养K562细胞增殖有明显的抑制作用，并可诱导K562细胞凋亡。     

刚地弓形虫感染对孕鼠细胞凋亡的影响

目的 探讨刚地弓形虫对孕鼠胎盘细胞凋亡及其相关基因bax、bcl-2表达的影响。方法 建立刚地弓形虫感染的孕鼠模型，采用胎盘组织压片及病理切片，观察胎盘组织的损伤情况；采用DNA缺口末端标记技术（TUNEL）检测胎盘细胞的凋亡情况；采用免疫组织化学法（SP法）观察细胞凋亡调控基因bax和bcl-2在胎盘细胞中的表达。结果 与对照组相比，随着感染时间的延长，感染组胎盘组织压片中可见弓形虫虫体逐渐增加，HE染色可见有大量的淋巴细胞浸润及凋亡小体；TUNEL证实感染组胎盘滋养层细胞凋亡显著增强（P〈0．05）；免疫组织化学结果显示，感染组胎盘滋养层细胞凋亡相关基因bax表达显著增强、bcl-2表达减弱（P〈0．05）。结论 刚地弓形虫侵入胎盘组织，可通过上调滋养层细胞bax基因表达，下调bcl-2基因表达而诱导胎盘滋养层细胞凋亡增加，从而影响胎盘组织结构和功能，导致不良妊娠。     

5种方法提取弓形虫速殖子DNA的效果比较

目的用5种方法提取弓形虫速殖子基因组DNA,比较其效果。方法分别以试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法和盐析法提取10倍系列稀释的弓形虫速殖子DNA,通过分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR比较其效果。结果酚-氯仿法提取的DNA纯度最高,煮沸法、盐析法、直接裂解法和试剂盒法依次降低;琼脂糖凝胶电泳可检测出由直接裂解法、酚-氯仿法、盐析法提取1×106个速殖子的基因组DNA;试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法、盐析法提取的DNA经PCR扩增可检测最少速殖子的数量依次为1×104,无目的条带,1×102,1×101,1×103个。结论酚-氯仿提取的DNA纯度高,用于PCR扩增具有较高的敏感性,但操作相对繁琐;煮沸法操作简单,与除酚-氯仿法外其他3种方法相比具有较高的敏感性。其它3种方法提取的DNA纯度不高,用于PCR扩增的效果不如前面2种。     

应用环介导等温扩增技术检测弓形虫

目的 用环介导等温扩增（LAMP）技术检测弓形虫。 方法　 用酚-氯仿法提取弓形虫速殖子基因组 DNA,设计两对扩增弓形虫 B1基因的 LAMP 引物。以间日疟原虫、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、日本血吸虫及小鼠白细胞作对照,进行LAMP反应,产物经 SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性。将弓形虫速殖子经倍比稀释为（2～3）×106个/ml至（2～3）×10-1个/ml 等8个浓度,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性。 结果 LAMP反应结果显示,弓形虫速殖子检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色。弓形虫的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP技术可检测到的弓形虫速殖子最低浓度为2～3个/ml。 结论 LAMP技术在弓形虫检测中显示出较好的特异性与敏感性。