可移植性人髓系白血病BALB/c小鼠模型建立

造血干/祖细胞移植已成为迄今为止治疗恶性血液病等最有效措施,而建立骨髓型可移植性白血病小鼠模型将为造血干细胞移植治疗白血病提供实验用动物模型。本实验用K562细胞接种BALB/c裸鼠产生红白血病的小鼠模型。将4-5周龄雌性BALB/c裸鼠,腹腔连续两天注射环磷酰胺(CTX)2mg,第3天腹腔或尾静脉直接接种K562白血病细胞2×105-2×106/只。定时取小鼠尾静脉外周血、骨髓细胞用流式细胞术和RT-PCR分别检测CD45,CD13,CD33抗原及bcr/abl融合基因。结果显示,4-5周龄BALB/c裸鼠无论通过腹部或尾静脉接种,无论有无CTX预处理,当接种K562细胞数大于2×105/只时,均可在BALB/c裸鼠身上产生可移植性人髓系白血病,荷瘤小鼠可存活30-60天。结论:腹腔或尾静脉接种大于2×105细胞/只均可产生人髓系白血病荷瘤小鼠模型,有无CTX2毫克/只的预处理不影响4-5周龄BALB/c裸鼠产生人白血病模型。     

益气养阴解毒方含药血清对白血病K562细胞的影响

目的探讨益气养阴解毒含药血清对白血病K562细胞抑制作用的影响。方法采用血清药理学方法制备益气养阴解毒方含药血清,以不同浓度的含药血清处理体外培养的K562白血病细胞,采用MTT(四氮唑蓝)比色法观察益气养阴解毒方含药血清对K562细胞增殖的影响;镜下观察经益气养阴解毒含药血清处理后K562细胞形态学的变化。结果不同浓度益气养阴解毒方含药血清对K562细胞增殖具有抑制作用,并呈剂量依赖关系。经益气养阴解毒含药血清处理后K562细胞镜下观察发现有凋亡小体的产生。结论益气养阴解毒方含药血清具有一定的抑制白血病K562细胞增殖的作用,其作用强度与浓度呈正相关;可诱导白血病细胞K562发生形态学改变,形成凋亡小体。其作用机理可能与其直接细胞毒作用有关。     

细胞增殖的检测方法

近年来,细胞增殖一直是生物医学领域各专业的研究热点,细胞增殖检测技术种类繁多却并不完善,本文就细胞增殖的特征以及常用的细胞增殖的各种检测方法的优缺点作一综述.     

人参皂甙单体Rh2对人K562白血病细胞增殖和凋亡的时效和量效分析

目的：观察人参皂甙单体Rh2对人K562细胞增殖和凋亡的影响，分析该影响的时间和剂量依赖性。方法：实验于2006-07／08在吉林医药学院临床检验系实验室完成。①取对数生长期人K562细胞制成细胞悬液，浓度1&;#215;10^8L^-1，接种于96孔培养板内，每孔100μL，6h后加入终质量浓度分别为6.25，12.5，25．0，50.0，100．0mg／L的人参皂甙单体Rh2 100μL（购自吉林省宏久生物科技股份有限公司），每一浓度组均设4孔。对照孔及调零孔加100μL培养液。各孔总体积均为200μL。在加药后48h采用四甲基偶氮比色法检测各孔中细胞的抑制率。在接近于半数抑郁浓度的人参皂甙单体Rh2处理作用于细胞6，12，24，48和72h后采用四甲基偶氮唑盐比色法计算抑制率。②在倒置显微镜下观察加药与未加药孔K562细胞形态。（蓼常规苏木精-伊红染色，检测25．0mg/L人参皂甙单体Rh2作用0，12，24和48h后K562细胞的凋亡率，并观察人参皂甙单体Rh2质量浓度分别为0，12．5，25．0，50．0，100．0mg／L时，培养24h后的细胞凋亡率。结果：①人参皂甙单体Rh2对K562细胞生长抑制作用：当人参皂甙单体Rh2质量浓度为6．25，12．5，25、0，50．0和100．0mg／L时，抑制率逐渐升高，呈现明显剂量依赖性。人参皂甙单体Rh2对K562细胞的半数抑制浓度为25．8mg/L处理K562细胞6，12，24，48，72h后细胞抑制率逐渐升高，且后4个时间点明显高于处理6h时（t=11．79-50．89．P〈0、01）。②人参皂甙单体Rhz对K562细胞形态的影响：细胞经人参皂甙单体Rh2作用后呈现出明显的凋亡细胞形态，细胞分散，体积缩小，胞浆浓缩，细胞核膜消失，细胞核断裂呈小块或碎片状，但细胞膜较完整并可见凋亡小体。③人参皂甙单体Rh2对K562细胞凋亡的影响：在25．0mg／L人参皂甙单体Rh2作用K562细胞0，12，24和48h后，K562细胞的凋亡率依次升高，分别为（3．8&;#177;0.5）％，（9．4&;#177;1．1）％，（23.2&;#177;2.2）％和（34.5&;#177;3.5）％（与作用0h比较，t=8.78&;#177;20.06．P〈0.05-0．01）。人参皂甙单体Rh2质量浓度分别为0，12.5，25,0，50.0，100.0mgL培养K562细胞24h，细胞凋亡率依次升高，分别为[（3．7&;#177;0.6）％，（9．4&;#177;1.3）％，（21.2&;#177;2.1）％，（28.5&;#177;2．5）％，（31．8&;#177;3.4）％，与0mg／L人参皂甙单体比较，t=9．39～18、54．P〈0．01]。结论：人参皂甙单体Rh：能抑制体外培养的K562细胞增殖并诱导其凋亡，且呈时间和剂量依赖性。     

LRP16基因对慢性髓系白血病K562细胞促增殖作用的研究

本研究探讨超表达LRP16基因对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响。采用RT—PCR法扩增人LRP16基因开放阅读框（open reading frame,ORF）片段,将其连接到pGEM—T质粒以构建LRP16基因ORF—pGEM—T重组载体。再将测序鉴定过的LRP16基因ORF插入pcDNA3．1^＋质粒以构建LRP16基因ORF—pcDNA3．1^＋重组表达质粒,转染K562细胞,建立稳定超表达LRP16基因的K562细胞系。用M1Tr法测定细胞存活率并绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞周期。结果表明：成功扩增出人LRP16基因ORF片段,并构建LRP16基因ORF—pcDNA3．1^＋重组表达质粒;建立稳定超表达LRPl6基因的K562细胞系;超表达LRPl6基因具有促进K562细胞增殖的作用,且这种促增殖作用部分是通过促进细胞由G0期进入S期而实现的。结论：超表达LRP16基因可促进K562细胞增殖。     

六亚甲基二乙酰胺对人多药耐药白血病K562/ADM细胞的诱导分化作用

六亚甲基二乙酰胺 (ＨＭＢＡ)是一种杂合极性化合物类强效分化诱导剂 ,对小鼠及人红白血病ＭＥＬ细胞、Ｋ5 6 2细胞有很强的分化诱导作用[1 ,2 ] ,亦可诱导其它白血病 (肿瘤 )细胞成熟分化和凋亡[3 ,4] ,在大剂量时对Ｐ 糖蛋白 (Ｐ ｇｐ ,Ｐ170 )阳性的多药耐药 (ＭＤＲ)肿瘤细胞和Ｐ ｇｐ阴性的肿瘤细胞的增殖均有抑制作用[5] 。Ｋ5 6 2 ＡＤＭ细胞是经阿霉素诱导的ｍｄｒ1基因超表达的白血病多药耐药细胞[6] 。我们选用ＨＭＢＡ作为分化诱导剂 ,通过观察其对Ｋ5 6 2 ＡＤＭ细胞增殖活性、形态学、细胞功能、细胞周期和Ｐ ｇｐ表达的作用…     

雷帕霉素对慢性髓性白血病细胞增殖的抑制作用及其机制

目的 探讨雷帕霉素对慢性髓性白血病(CML)细胞增殖的抑制作用及可能机制.方法 用不同浓度雷帕霉素处理CML细胞系K562细胞,用MTT法检测雷帕霉素对K562细胞的增殖抑制率;Western blot法及RT-PCR法检测不同浓度雷帕霉素作用后的K562细胞中mTOR、4E-BP1、p70S6K蛋白及mRNA表达水平,Western blot法检测CML慢性期患者骨髓原代细胞中mTOR、4E-BP1、p70S6K蛋白及磷酸化水平,并以健康人骨髓细胞为对照;数据采用x2检验、Fisher确切概率计算、单因素方差分析(ANOVA)方法进行分析.结果 CML慢性期患者骨髓中mTOR、4E-BP1、p70S6K蛋白磷酸化水平与正常对照相比明显增高(70.6％对30.0％,76.5％对40.0％,73.5％对20.0％,P值均＜0.05);20 nmol/L及更高浓度雷帕霉素对K562细胞增殖有明显抑制作用;雷帕霉素作用可降低K562细胞中mTOR磷酸化水平,及4E-BP1、p70S6K蛋白及mRNA表达水平(P值均＜0.05).结论 mTOR途径在CML的发病中发挥重要作用,其靶向抑制剂雷帕霉素可通过阻断mTOR途径抑制K562细胞增殖.     

塞来昔布对人白血病细胞株HL-60细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制

本研究旨在探讨塞来昔布（celecoxib）对人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。不同浓度塞来昔布作用于HL-60细胞24h后,CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞技术分析细胞凋亡及细胞周期分布的变化,定量RT—PCR的方法检测细胞周期蛋白DJ、EI及COX-2mRNA的表达。结果表明,不同浓度塞来昔布作用于HL-60细胞24h后,细胞增殖明显受抑,且呈-定的浓度依赖性（r=0．955）,24h的IC50值为63．037μmol／L。塞来昔布可诱导HL-60细胞的凋亡,也呈剂量依赖性（r=0．988）。塞来昔布可使HL-60细胞明显阻滞于G0／G1期,可下调cyclinD1、cyclinE1mRNA的表达。塞来昔布可使细胞COX-2mRNA表达水平降低。结论：塞来昔布呈浓度依赖性抑制HL-60细胞增殖,并可能通过下调cyclinD1、cyclinE1的表达引起细胞G0／G1,期阻滞,下调COX-2的表达诱导细胞凋亡。     

YCD/5-FC自杀基因治疗系统对K562B白血病细胞杀伤作用的小鼠体内实验研究

目的　了解酵母菌胞嘧啶脱氨酶 5 氟胞嘧啶 (YCD 5 FC)系统在体内对转基因高致瘤性K5 6 2细胞 (K5 6 2B细胞 )的杀伤效应。方法　以高滴度逆转录病毒转染K5 6 2B细胞并筛选出阳性转染克隆YCD K5 6 2B ;12只SCID小鼠分为治疗及对照组 ,在小鼠左右两侧近前肢处腹部皮下注射YCD K5 6 2B及K5 6 2B细胞 ,成瘤后治疗组腹腔注射 5 0 0mg kg 5 FC共 10d ,对照组腹腔注射生理盐水 ,观察瘤体相对体积变化及病理变化。结果　瘤细胞接种第 2 1天 ,瘤体相对体积分别为 :YCD K5 6 2B +5 FC组 2 .92 2± 0 .5 81,YCD K5 6 2B +生理盐水组 2 4.434± 4.790 ,K5 6 2B +5 FC组 2 2 .70 1± 2 35 0 ,K5 6 2B +生理盐水组 2 4.46 0± 1.6 70 ;YCD K5 6 2B +5 FC组与YCD K5 6 2B +生理盐水组相比差异非常显著 (P =0 0 0 0 1) ,K5 6 2B +5 FC组及K5 6 2B +生理盐水组相比 ,差异无显著性 (P =0 .0 96 ) ,表明 5 FC对转YCD基因的K5 6 2B白血病细胞有明显的杀伤效应 ,而对未转基因细胞的生长无影响 ;YCD K5 6 2B +5 FC组瘤体于瘤细胞接种后第 12～第 15天 (5 FC治疗的第 3～第 6天 )有所缩小 (最小的相对体积为 0 .6 81) ,病理检查可见 5 FC治疗组瘤体有以小动脉血管为中心的坏死。结论　YCD 5 FC系统在体内对转YCD     

急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/A02 细胞株耐药的影响

本研究探讨急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)对K562/A02细胞耐药性的影响及其机制。从白血病患儿骨髓中分离、培养并鉴定MSC;建立K562/A02细胞株与MSC共培养的体系,应用AnnexinV-FITC检测一定浓度的阿霉素(ADM)对不同培养条件下K562/A02细胞凋亡的影响;RT-PCR检测K562/A02细胞中的凋亡基因家族中bcl-2和bax基因;荧光定量PCR检测多药耐药基因mdr1浓度。结果表明,单独培养组白血病细胞早期凋亡率为(8.38±0.29)%,而黏附培养组为(1.97±0.11)%,差异具有统计学意义(p<0.05)。相对于单独悬浮培养的K562/A02细胞,黏附共培养的K562/A02细胞bcl-2基因表达明显增强,bcl-2/bax比值显著增高;K562/A02单独悬浮培养组、黏附共培养组细胞中mdr1的水平比较无统计学差异(p>0.05)。结论:白血病患儿MSC能够使白血病细胞逃避药物的促凋亡作用,K562/A02对阿霉素产生耐药性可能与黏附共培养后bcl-2基因表达增强有关,而与其本身含有的mdr1基因无关。     

CCK-8和MTS法检测人羊膜上皮细胞增殖的比较

目的探讨CCK-8、MTS两种不同的四唑盐试剂在羊膜上皮细胞增殖检测中的最适实验条件,并比较两者细胞毒性。方法取体外培养对数生长期羊膜上皮细胞,用完全培养基(DMEM/F12+10%胎牛血清)配制成不同浓度的细胞悬液加入96孔板中培养24 h,分别加入CCK-8、MTS后于450 nm、492 nm波长处测定光密度(OD)。在同一细胞浓度下,根据同一波长不同时间检测的OD确定CCK-8的最佳孵育时间。取体外培养的对数生长期羊膜上皮细胞分别用DMSO、CCK-8、MTS处理1 h、2 h、3 h和4 h后,继续培养24 h,在450 nm处以CCK-8检测细胞增殖,并通过台盼蓝染色计数活细胞数。结果 CCK-8法的最佳波长为450 nm,MTS法的最佳波长为492 nm。CCK-8法灵敏度稍低于MTS法。1~4 h内,CCK-8试剂与待检测细胞最佳孵育时间为4 h。CCK-8法对细胞增殖影响及细胞毒性均小于MTS法。结论 CCK-8法是一种更为方便、细胞毒性作用较小的试剂。     

二磷酸氯喹对K562细胞增殖与凋亡的影响

本研究探讨二磷酸氯喹对K562细胞增殖与凋亡的影响及其可能的作用机制。用细胞增殖试验（MTT法）检测不同浓度二磷酸氯喹对K562细胞的增殖抑制作用；应用细胞形态学检查、流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡；以罗丹明123（Rhodamine 123）为细胞染色剂，采用流式细胞术检测不同浓度二磷酸氯喹处理后K562细胞线粒体膜电位（△Ψm）的变化。结果表明：用不同浓度二磷酸氯喹（1.5625、3．125、6．25、12．5、25、50、100μmol／L）分别作用于K562细胞24、48和72小时后，细胞生长活力明显降低，具有剂量依赖性；典型的细胞形态学改变、亚G1峰的测出、梯形条带的显现共同证实了二磷酸氯喹能诱导K562白血病细胞凋亡；Rhodamine 123染色显示二磷酸氯喹处理的K562细胞线粒体膜电位强度下降。结论：二磷酸氯喹对K562细胞有生长抑制、诱导凋亡作用，其作用可能与细胞线粒体膜电位（△Ψm）下降有关。     

氯化锂抑制K562白血病细胞增殖及诱导凋亡机理的研究

本研究旨在探讨氯化锂(LiCl)在体外抑制K562白血病细胞增殖和诱导凋亡的机制。在细胞培养体系中加入LiCl(30mmol/L)进行培养;以流式细胞术分析细胞周期;用半定量RTPCR检测bcr/abl融合基因mRNA的表达;用原子吸收光谱仪检测不同时间点细胞内Li 浓度及Na 、K 通道阻断剂TTX、FSK分别对细胞内Li 浓度的影响,并观察了Na 、K 通道阻断剂对LiCl抑制细胞生长的作用。结果显示:LiCl(30mmol/L)导致K562白血病细胞出现G2/M期阻滞,bcr/ablmRNA表达下降,细胞内Li 的浓度从30分钟开始增加,在2小时达高峰,以后逐渐下降,4小时达到平衡;Na 、K 通道阻断剂TTX(3.4×10-7mol/L)与FSK(5×10-5mol/L)分别阻断Na 、K 通道后可升高细胞内Li 的浓度,并增加LiCl对K562白血病细胞增殖的抑制作用。结论:LiCl诱导K562细胞增殖抑制和凋亡的机制可能与K562细胞G2/M期阻滞、下调bcr/ablmRNA的表达及Na 、K 通道被阻断后Li 通道的状态有关。     

D-柠檬烯对K562细胞增殖及凋亡的影响

本研究探讨D-柠檬烯对K562白血病细胞增殖的影响及机制。应用MTT试验观察不同浓度D-柠檬烯作用后K562细胞增殖的改变；应用细胞形态学检查、流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡。结果表明：在0．125-1．0mmol／L浓度范围内，D-柠檬烯对K562细胞增殖的抑制作用呈现剂量依赖的关系。典型的细胞形态学改变、DNA琼脂糖凝胶电泳梯形条带及流式细胞仪检测出亚G1峰共同证实了D-柠檬烯能诱导K562白血病细胞凋亡。结论：D-柠檬烯抑制K562细胞的增殖并呈剂量依赖的方式，使细胞滞留于G1期，诱导其凋亡。     

CIAPIN1基因对K562细胞增殖能力的影响

本研究旨在探讨CIAPIN1基因对慢性髓系白血病（CML）细胞系I（562细胞增殖能力的影响。针对C1APIN1基因构建shRNA真核表达载体并稳定转染K562细胞,用real—timePCR和Westernblot技术验证干扰效率,采用MTT法检测K562细胞的增殖活性的改变,利用甲基纤维素集落形成实验观察K562细胞集落形成大小和数量的变化,通过体内实验观察K562细胞在小鼠体内的成瘤能力。结果表明,与对照组相比,K562细胞的CIAPIN1基因表达被有效抑制;干扰CIAPIN1基因后K562细胞的增殖活性明显下降,集落形成数量减少和集落大小显著减小,小鼠体内成瘤能力明显降低。结论：干扰CIAP删基因表达能抑制K562细胞在体内及体外的增殖能力。     

骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖及凋亡的影响

本研究比较K562细胞与相同数量以及不同数量的人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后K562细胞增殖、细胞周期和凋亡的变化,以探讨MSC对人白血病K562细胞生长的影响。通过建立正常人骨髓MSC的体外培养体系及其与K562细胞共培养的体系测定K562细胞的生长曲线;将不同数量的MSC与K562细胞共培养测定K562细胞的增殖率曲线;应用流式细胞术检测K562细胞周期以及凋亡的变化。结果显示：与单独K562细胞培养相比,K562细胞与相同数量MSC共培养后,生长受抑;K562细胞与不同数量MSC共培养后,MSC对K562细胞的抗增殖作用呈剂量依赖性;细胞周期分析发现,K562细胞与MSC共培养后,G0／G1期以及G2／M期的细胞增加,S期的细胞减少。共培养24、48、72小时后流式细胞仪检测发现,K562细胞的凋亡率下降。结论：正常人骨髓MSC能使导致K562细胞生长抑制,阻止K562细胞周期的运行,凋亡率下降,且在一定范围内,随着MSC数量的增加,对K562细胞的抗增殖作用增强。     

神经毡蛋白-1在急性髓系白血病细胞中的表达和作用

本研究旨在探索神经毡蛋白(neuropilin-1,NRP-1)和NRP-2在髓系白血病细胞中的表达及抑制NRP-1基因表达后对白血病细胞生长和迁移的影响.采用RT-PCR观察NRP-1和NRP-2 mRNA在24例急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞(MNC)及7种髓系白血病细胞系中的表达;以小干扰RNA(siRNA)干扰NRP-1基因在HEL细胞的表达,用MTT和细胞迁移试验观察细胞增殖、迁移的变化.结果显示NRP-1在24例AML患者骨髓MNC中表达,其阳性率为100%,显著高于正常对照组67%(p=0.03).79%AML患者表达NRP-2,67%正常人表达NRP-2,两者无明显差异(p=0.6).NRP-1的表达与AML患者骨髓、外周血原始细胞比例呈正相关(r=0.5,r=0.4,p＜0.05).NRP-1和NRP-2 mRNA分别在6/7和3/7种髓系白血病细胞系表达.用siRNA转染HEL细胞24小时后NRP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低,当有VEGF165作用时,对照组细胞增殖明显增加,而干扰组无变化(MTT值对照组vs干扰组0.6±0.01 vs 0.49±0.02,p＜0.001).转染24小时后干扰组细胞迁移显著降低,其迁移细胞数干扰组vs对照组为500±17 vs 123±7(p＜0.001).结论NRP-1在AML患者骨髓MNC中表达增高,并在髓系白血病细胞的增殖和迁移中起重要作用.     

整合蛋白β1在藻蓝蛋白抑制白血病细胞系K562细胞增殖中的作用

本研究观察不同浓度藻蓝蛋白（phycocyanin）对K562细胞增殖的影响，并检测藻蓝蛋白处理后细胞表面整合蛋白β1表达和胞内黏着斑激酶（FAK）基因表达的变化，探讨整合蛋白β1在藻蓝蛋白抑制K562细胞增殖中的可能作用机制。用流式细胞术（FCM）检测藻蓝蛋白处理前后K562细胞表面整合蛋白β1表达变化；MTT法测定不同浓度藻蓝蛋白对K562细胞增殖的影响；RT—PCR检测不同浓度藻蓝蛋白对K562细胞内FAK基因表达的作用。结果表明：整合蛋白β1在K562细胞上高表达；藻蓝蛋白不能改变其表达量。不同浓度藻蓝蛋白对K562细胞的增殖均有抑制作用。藻蓝蛋白可上调胞内FAK的基因表达水平，恢复整合蛋白β1介导的细胞增殖抑制信号。结论：藻蓝蛋白可能通过增强细胞基质与K562细胞表面的整合蛋白β1结合，上调K562细胞内FAK基因表达水平，恢复整合蛋白β1介导的细胞增殖抑制信号而发挥抑制K562细胞增殖的作用。     

DLL4/Notch1配体过表达抑制K562细胞生长机制研究

本研究旨在探讨Notch1信号通路的配体delta-like ligand4（DLL4）基因过表达对K562细胞增殖的影响及其可能的作用机制.采用脂质体介导将含配体DLL4基因的质粒pBudCE4.1-DLL4转染K562细胞,通过RT-PCR和Western blot检测转染48 h后DLL4基因的mRNA及蛋白表达,同样检测转染后Notch1受体胞内区（NICD）、下游靶基因Hesl的mRNA及蛋白表达;通过Western blot检测与Notch信号通路相关的细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达水平;用CCK-8法检测转染后细胞的增殖情况;用流式细胞术检测转染质粒48 h后各组细胞的凋亡情况.结果表明,DLL4基因转染后的K562细胞中DLL4、NICD及下游靶基因Hesl的mRNA及蛋白表达量比对照组明显增多（P＜0.05）,说明DLL4的过表达激活了Notch1信号通路;Western blot方法检测显示,DLL4的转染增加了细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达,从而抑制了K562细胞的生长,诱导细胞周期停滞于G1期及细胞凋亡的增加.结论：外源性DLL4基因过表达可有效活化K562细胞内Notch1信号通路,可能通过YY1、C-MYC及Rb等Notch信号通路相关基因的高表达诱导K562细胞的生长减慢及细胞凋亡.