登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析

目的克隆登革2型病毒(DEN2)全长NS1基因，构建NS1基因的真核表达重组质粒。方法用RT—PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NSl基因序列，并定向克隆入pPICZαB的KpnⅠ／XbalⅠ位点，构建真核表达载体pPICZαB—NS1，转化E.coli DH5a菌。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。结果阳性质粒经PCR及KpnⅠ／XbaⅠ双酶切获得了一个核苷酸长度为1134bp的基因；序列测定证实该基因与DEN2(NGC株AF038403)NS1基因序列有99％同源。结论成功构建了含有DEN2全长NS1基因的真核表达载体DPICZαB—NS1，为NS1的进一步酵母表达奠定了良好的基础。     

登革Ⅱ型病毒Tr1751株E蛋白基因的克隆与表达载体的构建

目的从登革Ⅱ病毒Tr1751株中克隆表达E蛋白的基因,构建了真核表达质粒,为其后继的关于结构和功能的研究提供了条件。方法合成DEN2(Tr1751株)的E蛋白基因引物,通过RT-PCR的方法扩增含有信号肽E蛋白的基因片段,并与真核载体p IRES-hr GFP-1α连接,得到重组的质粒p IRES-hr GFP-1α-E,再用PCR、双酶切和测序的方法进行鉴定。结果 RT-PCR得到的为1 527bp的E蛋白基因片段,酶切鉴定和测序显示重组的质粒含有DEN2病毒中的E蛋白的基因。用重组质粒测序后与Gen Bank中的已知Tr1751株进行相似性比对,核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性均为99%。结论成功的构建出含有全长DEN2的E蛋白基因的真核质粒,为登革病毒核酸疫苗的研究奠定了基础。     

从贵州白纹伊蚊体内分离到一株2型登革病毒

从贵州省独山县麻尾镇白纹伊蚊标本中分离到一株病毒 ,用抗DEN1 4型单克隆抗体经间接免疫荧光法和RT PCR产物酶切分型鉴定为DEN 2 ,并对其NS1和E基因RT PCR产物进行部分基因序列测定 ,与DEN 2NGC株比较 ,麻尾株的NS1基因区有 7个碱基发生点突变 ,E基因区有 1个碱基的插入 ,两个序列被GenBank收录 ,编号分别为AY2 774 0 2、AY2 782 2 6 ;麻尾分离株与其他 9株DEN 2型病毒进行系统发育关系的分析 ,结果显示与D2 - 4 3株系统进化关系最近 ;证明贵州省存在DEN感染的自然循环。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达

目的:构建登革2型病毒NGC株E基因区1～476 bp的原核表达载体并进行原核表达.方法:将登革2型病毒NGC株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-En;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的TCID50.结果:(1)成功构建了pET28a(+)-En原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,相对分子量约为23 kD,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western印迹表明该目的蛋白可与登革2型病毒鼠单克隆抗体结合;(2)用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%;(3)DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-4.88/0.1 ml.结论:pET28a(+)-En可在BL21(DE3)菌株中高效表达,DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有一定的细胞毒作用.     

登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定

目的 构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆，为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物，从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术扩增出覆盖病毒基因组全长的2个cDNA片段，并克隆至pCR—XL—TOPO载体后测序。结果经酶切鉴定和序列测定表明，获得的cDNA克隆为登革2型病毒NGC株特异的。结论已成功构建出登革2型病毒NGC株基因组的2个cDNA亚克隆。     

登革病毒感染的实验诊断方法进展

登革病毒(dengue virus，DV)是黄病毒科黄病毒属的主要成员，是有包膜的单股正链RNA病毒，基因组长约11kb，整个基因组的编码顺序为：5’Ⅰ型帽子结构、非编码区、C蛋白(核衣壳蛋白)基因、M蛋白(膜蛋白)基因、E蛋白(包膜蛋白)基因、NS1—2A-2B-3—4A-4B-5(7个非结构蛋白)、非编码区3’。DV分4个血清型，可引起登革热(dtengue fever，DF)、登革出血热(dengue haemorrhazic fever，DHF)及登革休克综合征(dengue shock syndrome，DSS)，     

登革2型病毒E基因克隆及B细胞抗原表位分析

目的扩增登革病毒2型新几内亚株(NGC)E基因,并进行B细胞抗原表位分析。方法根据登革2型病毒NGC株E基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增NGC株E基因并克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α后测序。按Kyte-Doolit-tle方案、Jameson-Wolf方案和Emini方案预测B细胞抗原表位。结果通过RT-PCR方法,获得了登革2型病毒NGC株E基因,并对登革2型病毒NGC株E基因进行B细胞抗原表位预测。结论通过RT-PCR方法,获得了登革2型病毒NGC株E基因,为制备登革2型病毒E基因单克隆抗体和疫苗打下基础。     

白纹伊蚊垂直传播登革病毒后E基因区部分序列的变化

目的：通过对登革病毒经垂直传播后亲代和子一代蚊体内病毒基因序列的分析，了解登革病毒在流行过程中的变异性。方法：用登革2型病毒(DEN-2)NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株，提取亲代及子一代蚊体内病毒总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增蚊体内DEN-2病毒核酸，对阳性聚合酶链反应(PCR)产物进行序列测定和比较。结果：用DEN-2 NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株后，子一代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区序列与亲代蚊体内扩增的序列比较，出现3个位点的突变，分别位于第174，215，336位点；亲代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区部分序列与DEN-2 NGC株E基因区序列相同。结论：DEN-2在垂直传播后出现病毒E基因区的点突变。     

深圳市2015年首例输入性登革热病毒溯源分析

目的 对2015年深圳市报告的首例输入性登革热病例进行溯源分析。方法 收集该病例流行病学资料及血清样本,并通过免疫层析法和实时荧光RT-PCR对该病例血清中的特异性IgM抗体、IgG抗体、NS1抗原及病毒核酸进行检测。用C6/36细胞对血清进行病毒分离。对分离株的E基因进行序列测定,与不同型别的标准株及不同地区的分离株进行同源性分析并构建系统发生树。同时对糖基化位点、毒力位点上的序列进行比较。结果 从该病例血清中检测出IgM抗体、NS1抗原和2型登革病毒RNA,并成功从血清样本中分离出登革病毒DEN2-SZ1503。 SZ1503与标准2型登革病毒NGC株E基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.8％和97.8％。系统发生树表明SZ1503与SG（EHI）D2 / 06572Y13株（Malaysia 2013）,具有最高相似性,且位于系统发育树的同一分支中。该分离株同1051株（Indonesia 76）、10株（Somalia 84）和271-206株（Sri Lanka 90）一起属于基因型Ⅳ。SZ1503株E基因的糖基化位点与其他登革热2型毒株相同,毒力位点也与之前报道的毒株一致。结论 病毒学、血清学和流行病学结果表明,该输入登革热病例是由2型登革热病毒引起的,SZ1503病毒株的遗传特征与马来西亚流行的登革热病毒一致。     

登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响

目的：研究登革2型病毒（DENV-2）、登革2型病毒国际参考株（NGC）E基因1-476序列原核蛋白、登革2型病毒贵州蚊虫分离株（M）E基因1476序列原核蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）通透性的影响.方法：将DENV-2 M株和NGC株E基因1-476序列原核表达产物及DENV-2接种于HUVEC单层细胞,用tran-swell法检测HUVEC的通透性,透射电镜观察细胞超微结构的改变.结果：DENV-2、NGC株E基因的原核蛋白、M株E基因的原核蛋白分别在30 min、3h、12 h时对HUVEC通透性的影响最为明显,透射电镜结果显示有细胞超微结构的改变.结论：DENV-2、DENV-2 NGC株E基因原核蛋白、M株E基因原核蛋白对HUVEC通透性、细胞超微结构有明显影响.     

登革病毒非结构蛋白1 氨基端抗原性分析及其检测登革病毒感染动物血清

目的    精确分析登革病毒(dengue virus,DENV)非结构蛋白1（non-structural protein 1, NS1)氨基(N)端抗原性和免疫原性,探讨NS1 N端多肽用于分型检测DENV感染可行性。方法    合成4型DENV 标准株NS1蛋白 N端1-15氨基酸残基序列多肽（D-1 P1、D-2 P1、D-3 P1和D-4 P1）,采用ELISA方法检测多肽同DENV NS1 血清型特异性单抗和各型DENV分别免疫小鼠血清的反应性,竞争抑制法进一步验证单抗和对应多肽反应特异性。分析4型DENV 标准株NS1 N端1-15氨基酸残基序列多肽在Pubmed中已报道的各型DENV分离株中的保守性。结果     6株DENV 1型特异性单抗（5A48A3, 5A65A2, 5B29A1, 5B71A8, 5C29A3和5E68A17）特异性的同D-1 P1;6株DENV-2 NS1型特异性单抗（5D21A1、5E19A5、 5A62A12、5A70A4、5E30A5和5E48A15）特异性的同D 2 P1反应。D-1 P1仅识别DENV 1免疫小鼠血清, 其他多肽同各型DENV 1免疫小鼠血清反应无差异。DENV-1、2、3、4 NS1 N端保守性依次为98.96%、89.09%、83.58%和57.81%。结论     DENV-1 NS1 N端是DENV-1血清型特异性优势线性表位,该多肽可用于研制诊断DENV-1感染试剂盒;DENV-2 NS1 N端是DENV-2血清型特异性表位,以上研究有助于DENV亚单位疫苗和DENV感染分型诊断试剂盒的研制。     

广州登革病毒1型NS2a-NS2b基因序列分析

目的对2004年广州军区总医院收治的1例疑似登革病毒感染者进行确诊,通过对病毒的基因序列分析。寻找该例感染病毒的可能来源。方法首先从疑似病人的血清提取血液RNA,用RT—PCR法对比较保守的病毒非结构蛋白NS2a-NS2b上的部分序列进行扩增,并进行基因克隆、测序及同源性分析。结果经RT-PCR和基因测序检测证实为DEN1感染;基因序列分析结果表明．该病毒与我室保存的1995年、1997年、1999年和2003年的DEN1流行株非结构蛋白NS2a-NS2b的部分序列同源性分别为90．8％、97．6％、100％和99．6％。结论该例疑似登革病毒感染患者被确诊为DEN1型病毒感染。与1999年广东省中山市的登革1型病毒流行株在部分非结构蛋白NS2a-NS2b上完全相同．并与1997年广东省潮州市和2003年广州市的流行株为同一基因型。由此初步推断,在我国可能已存在登革1型病毒的疫源地。     

登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒.方法 RT-PCR扩增NSI-NS2a基因片段后,将其克隆人真核表达载体pReceiver-M01a;过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒.结果 经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-NS1-NS2a;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示细胞质中有登革2型病毒特异性蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pRe·NS1-NS2a.     

我国登革2型病毒包膜E蛋白B区抗原表位的预测

目的 预测登革2型病毒包膜E蛋白B区抗原表位.方法 采用哈佛大学分子免疫基金会在线提供的抗原肽预测软件结合Hopp & woods亲水性参数、Janin可及性参数、极性参数、柔韧性参数及二级结构方案对登革2型病毒包膜E蛋白B区抗原表位进行预测.结果 登革2型病毒包膜E蛋白B区抗原表位可能位于第40-46位、第121-147位,第131-137位氨基酸区域内或附近,这2个被预测的区域均含有β-转角或无规卷曲结构.结论 该研究对应用合成肽抗原进行登革热早期诊断及相关抗体的制备具有重要指导意义.     

登革病毒1型和2型国内分离株NS1基因的扩增和克隆

登革病毒(DEN)为单链正股RNA病毒,其非结构蛋白NS1在病毒免疫反应中起重要作用。我们在NS1基因序列设计了一对通用引物,扩增序列长度为413bP。应用逆转录—聚合酶链反应成功地扩增了DEN1_-4型部分基因片段,采用该引物扩增国内分离株DEN1(GZ)和DEN2(HN91)同样出现一条特异扩增带,并发现国内分离株扩增产物的电泳迁移率与国际参考株有差别。因此我们应用低融点琼脂糖回收该DNA片段,并将DEN1(GZ)和DEN2((HN91)NS1基因部分片段分别克隆到Puc19质粒载体中。经Pst Ⅰ和Ecor Ⅰ双酶切分析和通用引物PCR鉴定证明重组质粒内含有NS1基因部分片段。并准备进行核苷酸序列分析,以进一步了解其核苷酸的变异与抗原性的关系,为我国登革热的预防和控制提供理论依据。     

亚洲地区登革1型病毒基因型及蛋白多样性分析

目的了解我国及周边亚洲地区登革1型病毒株(DENV-1)的基因型及蛋白多样性特征,为今后登革1型病毒的流行监测和防控提供理论基础。方法从NCBI Virus Variation登革病毒数据库筛选出亚洲登革病毒1型全基因组序列共85条,利用生物信息学软件MEGA 7构建系统发生树,应用重组检测软件RDP 4.0检测可能存在的重组事件,计算同源计分比值(BSR)进行蛋白多样性分析。结果进化树显示亚洲地区登革1型病毒分为6种基因型(Ⅰ-Ⅵ),其中Ⅰ型为优势流行基因型,Ⅵ型为新出现的基因型。同时,共发现26个重组事件,主要以基因型间的重组为主。各蛋白BSR均为0.95以上,NS2B蛋白同源计分比值最高(0.99)。结论亚洲地区登革1型病毒存在多种基因型共同流行,进化较为保守;NS2B蛋白的高度保守性,可成为抗登革病毒药物研发的理想靶点。     

登革病毒Ⅱ(NGC株)pET-42a-NS_(4b)-NS_5载体构建

目的:构建NS4b-NS5基因的原核表达载体。方法:用RT-PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NS4b-NS5基因序列,并定向克隆入pET42a,构建原核表达载体pET42a-NS4b-NS5,转化BL21菌。阳性质粒用PCR、酶切等方法鉴定。结果:阳性质粒经PCR及双酶切获得了一个长为1.05Kb的基因片段。结论:成功构建了含有DEN2全长NS4b-NS5基因的原核表达载体pET42a-NS4b-NS5。     

登革2型病毒NGC株感染白纹伊蚊C6/36细胞中浓核病毒DNA的扩增和序列测定

目的:探索白纹伊蚊C6/36细胞对登革2型病毒(Dengue Type 2 virus,DEN2)不敏感的原因.方法:根据Genbank提供的DEN2新几内亚株(NGC株)NS1基因序列设计引物,设立病毒对照组、病毒DNA酶(DNase)处理组和细胞对照组,通过提取核酸、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、限制性内切酶(Hind Ⅲ)酶切、1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR及其酶切产物,并对其扩增产物进行序列测定,用软件比对与白纹伊蚊C6/36细胞浓核病毒(Densonucleosis virus,DNV)基因的同源性.结果:经RT-PCR,细胞和病毒组均出现约1 300 bp的条带,不能被Hind Ⅲ酶切,而病毒DNase处理组未能扩增出此条带;经GenBank比对,该片段序列与白纹伊蚊C6/36细胞DNV部分序列的同源性达95%以上.结论:C6/36细胞对DEN2不敏感的原因是由于伊蚊C6/36 DNV的污染.     

佛山市登革2型病毒流行株结构基因序列测定及分析

目的对我国登革2型病毒1993年广东省佛山市流行株GD06/93结构蛋白基因进行序列测定及分析,追踪其地域来源、基因组结构与致病性的关系,为研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法根据登革2型国际标准株NGC序列,设计2对重叠引物,RT-PCR扩增,分别克隆到pMD18-T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果GD06/93株结构基因序列长度为2325bp,编码775个氨基酸。与其它登革2型病毒株TSV01、Taiwan-1008DHF、NGC、44、ThD2_0038_74、ThNH81/93、gd08/98、04、Cuba165/97及S1进行比较,其核酸序列同源性分别为97%、96%、95%、95%、95%、94%、94%、92%、92%、91%。结论GD06/93病毒株的结构基因序列与已发表的其它登革2型病毒株同源性很高。在比较的6株登革2型病毒株中,GD06/93株与同期在澳大利亚流行的TSV01株同源性最高。