依地福新诱导重组Fas基因酵母的凋亡

目的将人Fas基因转染至野生型粟酒裂殖酵母细胞中,并观察依地福新对重组酵母的促凋亡作用。方法抽提Jurkat细胞的RNA;RT-PCR制备Jurkat细胞的cDNA;PCR扩增人Fas基因;将人Fas基因克隆到pREP3X-HA质粒中构建pREP3X-HA-Fas穿梭载体,电转化穿梭载体到野生型粟酒裂殖酵母细胞中;应用Western blotting鉴定蛋白表达产物;应用依地福新诱导重组酵母产生凋亡应答。结果在33个酵母转化单菌落中,筛选到一个有表达活性的pREP3X-HA-Fas重组子,且依地福新能诱导此重组子的凋亡。结论成功构建pREP3X-HA-Fas穿梭载体并转入到相应的野生型粟酒裂殖酵母细胞中,且转化子具有表达活性。依地福新可能通过Fas诱导酵母细胞凋亡。     

Edelfosine抑制S.pombe细胞分裂作用机制的研究

目的研究edelfosine(ET-18-OCH3,依地福新)抑制schizosaccharom yces pombe(S.pombe,粟酒裂殖酵母)细胞分裂的作用机制。方法应用胞质分裂抑制试验,平行生长抑制试验,观察edelfosine对S.pombe细胞分裂和生长的抑制作用;应用酵母基因再转染试验,探索其作用机制。结果edelfosine在低剂量浓度时,抑制S.pombe细胞分裂;高剂量时抑制其生长。平行生长抑制试验显示,删除了mid2、spm1和pmp1基因的细胞株(mid2△、spm1△和pmp1△),对高剂量edelfosine有抵抗作用;再转染了相应的基因后,细胞重新恢复了对edelfosine的敏感性。Spm1、Mid2和Pmp1相互作用的试验研究显示,Mid2介导磷酸化Spm1的生成,而Pmp1抑制磷酸化Spm1的生成。结论edelfosine可能通过影响Spm1、Mid2和Pmp1蛋白磷酸化而产生胞质抑制和生长抑制作用。     

TOPO克隆构建SARS-CoV M蛋白基因裂殖酵母表达载体及其稳定性

目的 利用TOPO克隆法构建SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母重组表达载体，并验证重组载体在宿主细胞中的稳定性。方法 运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术从SARS-CoV RNA中扩增出M蛋白基因,AT克隆构建出序列正确的pMD18-T-M重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-M载体上亚克隆出M蛋白基因，与裂殖酵母表达载体pNMT1-TOPO进行TOPO克隆,构建出重组表达载体pNMT1-M,转化TOP10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性转化子后进行测序鉴定。将序列正确的pNMT1-M重组载体电转化入裂殖酵母TCP1菌株中,在EMM培养基中诱导表达,连续传代100代，在EMM+T培养基中验证其稳定性。结果 RT-PCR获得666 bp的片段,pMD18-T-M重组载体经测序验证序列正确；重组表达载体pNMT1-M经菌落PCR和测序鉴定均正确;重组裂殖酵母菌经诱导后，SDS-PAGE检测出了表达条带;重组表达载体连续传代后,未发现丢失现象。结论 成功地构建出了SARS-CoV M蛋白基因的裂殖酵母表达载体，验证了其在裂殖酵母中能稳定地进行遗传,为下一步的表达优化、活性和功能研究垫定了基础.     

依地福新诱导异源表达人凋亡基因的酿酒酵母细胞的凋亡

酵母作为一种容易进行操作的生物模型,广泛应用于异基因表达和结构与功能的研究中[1]。尽管它们可能缺乏某些与高等生物相似的凋亡调节因子的同功异构体,但在某些生理情况下(如突变体、乙酸处理等)或在异源表达哺乳动物促凋亡基因时,可观察到细胞的凋亡。依地福新是目前所发现的第一个通过激活细胞内Fas/CD95死亡受体而起作用的抗癌药物,其抗癌机制涉及到膜阀(membrane raft)介导的过程[2]。在本实验中笔者将Fas、FADD、caspase-8酶原转入到酿酒酵母(Saccharomyces cerevi-siae,S cercvisiae)细胞中,然后用依地福新进行处理,以确定依地福新是否能激活Fas/FADD/caspase-8这一凋亡通路,从而进一步阐明依地福新促细胞凋亡的机制。1资料与方法1.1试验菌株试验中使用的酿酒酵母菌株为:BY4742,MAThis3Δleu2Δlys2Δura3Δ。pGILDA质粒和大肠埃希菌活化态细胞DH5α,均购自于Invitrogen Life Techologies(USA)。1.2主要试剂依地福新由华北生物制药公司(合肥,河北)生产;酵母膏(Yeast Extract...     

突变SOD1cDNA亚克隆入酵母穿梭表达质粒pGBKT7中

目的将突变SOD1cDNA亚克隆入酵母穿梭表达质粒pGBKT7中。方法利用PCR方法从重组子pEGFP—N2-mSOD1中扩增突变的SOD1cDNA片断。以EcoRⅠ／salⅠ双酶切突变SOD1cDNA片断和酵母穿梭表达质粒pGBKT7，在T4DNA连接酶的作用下，连接突变SOD1cDNA片断和酵母穿梭表达质粒pGBKT7。转化感受态DH5α，筛选重组子，进行双酶切和测序鉴定。结果经酶切和测序鉴定，突变SOD1cDNA成功地亚克隆入酵母穿梭表达质粒pGBKT7中。结论亚克隆成功，可以对目的基因进行下一步研究。     

胞质蛋白NOD2重组腺病毒载体的构建

目的构建人NOD2腺病毒表达载体。方法采用分子克隆技术,从CoCa2细胞DNA中PCR扩增NOD2片段,经pcDNA3．1克隆到穿梭质粒pShuttle—CMV,以KpnⅠ和NotⅠ双酶切重组穿梭质粒,经电穿孔、抗性筛选,重组成pAdCMV-NOD2腺病毒质粒,经酶切鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组rvAdCMV-NOD2腺病毒,并进行PCR鉴定测定。结果成功扩增目的基因并鉴定,重组穿梭质粒pShuttle-CMV-NOD2鉴定,经酶切鉴定证实重组腺病毒质粒构建成功。结论腺病毒载体应用广泛,细菌体内同源重组腺病毒pAdCMV-NOD2合成效率高,为炎症的基因治疗研究奠定基础。     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体     

PI16重组腺病毒表达载体的构建及其在人主动脉瓣间质细胞中的表达

目的构建携带人肽酶抑制蛋白16(PI16)基因的重组腺病毒表达载体,并研究其在人主动脉瓣间质细胞(hAVICs)中的表达。方法合成带有EcoRⅠ酶切位点的PI16引物,PCR扩增PI16基因,将目的基因克隆到穿梭载体pAV-MCMV-GFP-3FLAG中,PCR及测序鉴定穿梭质粒pAV-MCMV-PI16-GFP-3FLAG。将穿梭质粒与辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK 293细胞,获取重组腺病毒Ad-MCMV-PI16-GFP-3FLAG。转染HEK 293细胞大量扩增后,采用CsCl梯度离心法纯化病毒,半数组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度。用Ad-MCMV-PI16-GFP-3FLAG感染hAVICs,Western blot检测PI16在hAVICs中的表达。结果成功构建了表达PI16蛋白的重组腺病毒,滴度达到5.01×1010 TCID50/ml,转染hAVICs后能高效地表达PI16蛋白。结论成功构建携带人PI16基因的重组腺病毒,为进一步研究PI16基因的作用提供了基础。     

The construction of recombinat adenovirus vector expressing survivin-related microRNA-494 gene

目的 构建表达生存索(survivin)相关rnicroRNA-494基因的重组腺病毒载体.方法 应用生物学软件Targetscan 5.2对microRNA-494基因与survivin mRNA作相关性分析.RT-PCR调取目的基因,将其连接线性化后的穿梭质粒载体,联合骨架质粒转染入293细胞后同源重组产生重组腺病毒载体.PCR及测序验证重组质粒,荧光显微镜下观察腺病毒荧光蛋白表达.结果 重组腺病毒载体构建成功.结论 成功构建了重组腺病毒载体,可用于研究其在前列腺癌PC-3细胞中对survivin基因表达的影响.     

表达生存素相关microRNA-494基因腺病毒载体的构建

目的构建表达生存素(survivin)相关microRNA-494基因的重组腺病毒载体。方法应用生物学软件Targetscan 5.2对microRNA-494基因与survivin mRNA作相关性分析。RT-PCR调取目的基因,将其连接线性化后的穿梭质粒载体,联合骨架质粒转染入293细胞后同源重组产生重组腺病毒载体。PCR及测序验证重组质粒,荧光显微镜下观察腺病毒荧光蛋白表达。结果重组腺病毒载体构建成功。结论成功构建了重组腺病毒载体,可用于研究其在前列腺癌PC-3细胞中对survivin基因表达的影响。     

甲型H5N1禽流感病毒血凝素在sf9昆虫细胞中的表达及其鉴定

目的  利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达甲型H5N1禽流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）并对其进行鉴定。方法  根据sf9昆虫细胞密码子偏好性,对A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）禽流感病毒的HA基因进行序列优化并全长合成。构建重组供体质粒pFastHA,经PCR及测序鉴定后,转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒BacmidHA,用M13引物进行PCR鉴定。采用脂质体法转染sf9细胞,获得重组杆状病毒rBacHA。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）、蛋白质印迹法以及间接免疫荧光法对rBacHA表达产物进行分析。结果  供体质粒pFastHA经双酶切后产生了1条与预期大小相符的1 707 bp条带,序列测定证实目的基因无突变。穿梭质粒BacmidHA经PCR扩增,得到1条与预期大小相符的3 180 bp条带。SDS-PAGE结果显示,rBacHA表达产物的相对分子质量约为65 000。蛋白质印迹法分析表明,表达产物能与禽流感病毒阳性血清结合。在荧光显微镜下,感染rBacHA的sf9细胞呈现绿色荧光,提示HA基因得到表达。结论  利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功制备了具有良好抗原性的重组HA蛋白。     

一种对趋化因子受体4具有表型剔除效应的重组腺毒表达载体的构建及其体外检测

目的构建含有人趋化因子突变体SDF-1α/54及内质网定位肽段KDEL基因细胞内趋化因子突变体的重组腺病毒表达载体,并在体外探讨对CXCR4的作用。方法以质粒pcDNA3.1/SDF-1为模板,通过PCR扩增获得SDF-1α/54/KDEL基因全长序列。PCR产物回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL。通过酶切、PCR及插入片段测序鉴定,将正确重组体pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL转化E.coliBJ5183并进行细菌内同源重组,然后筛选阳性克隆,提取质粒,将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体Lipofectamine2000介导转染293细胞。制备AdSDF-1α/54/KDEL病毒上清并测定其滴度,将病毒上清转染293细胞,应用RT-PCR分析SDF-1α/54/KDEL的表达。重组病毒感染MCF-7后,MTT法检测其细胞毒性;流式细胞仪检测重组腺病毒对肿瘤细胞表面CXCR4表达的影响。结果通过细菌内同源重组法构建了含SDF-1α/54/KDEL目的基因的重组腺病毒载体AdSDF-1α/54/KDEL,RT-PCR鉴定表明经重组腺病毒转染的293细胞可有效转录SDF-1α/54/KDEL,证实其在293细胞中高效表达并产生6×109PFU/mL的重组腺病毒;AdSDF-1α/54/KDEL处理的乳腺癌细胞,MOI在200以内无细胞毒性对细胞生长生长无影响,但能显著降低肿瘤细胞表面CXCR4的表达量。结论本次构建的细胞内趋化因子突变体重组腺毒表达载体AdSDF-1α/54/KDEL的构建成功,并具有对乳腺癌细胞系MCF-7具有表型剔除作用。     

hMSH2反义核糖核酸表达质粒的构建

利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）, 特异地扩增HeLa细胞中hMSH2 cDNA的最保守区域, 并将其克隆到TA载体, 从重组质粒两端进行序列分析, 证实为目的片段. 将该目的片段反向克隆到哺乳动物表达载体pREP9的 BamHⅠ和KpnⅠ位点之间, 筛选后得pREP9-hMSH2反义表达重组质粒. 用磷酸钙-DNA共沉淀法将重组质粒DNA及载体DNA分别导入HeLa细胞, 经G418筛选, 扩大培养. 凝胶阻滞实验证实转染有pREP9-hMSH2重组质粒的HeLa-MSH2细胞抽提物中G·T和A·C错配结合蛋白质表达明显降低, 为研究hMSH2基因功能提供了一有效细胞系.     

表达甲型H5N1禽流感病毒结构蛋白的重组痘苗病毒的构建与鉴定

目的  构建表达甲型H5N1禽流感病毒（H5N1 avian influenza A virus,H5N1 AIAV）NIBRG14株结构蛋白的重组痘苗病毒,为研制新型人用流感疫苗奠定基础。方法  通过反转录PCR扩增H5N1 AIAV NIBRG14株的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）编码基因,并将改造的HA、NA基因克隆至痘苗病毒穿梭质粒 pSCCK。在重组质粒与痘苗病毒天坛株（vaccinia virus Tiantan,VTT）于Vero细胞中发生同源重组后,筛选同时表达HA和NA的重组痘苗病毒（rVTT-HA/NA）,并对其进行鉴定。结果  反转录PCR扩增的HA和NA基因大小约分别为1 700和1 400 bp,与预期相同。DNA测序证实,改造的HA和NA序列正确。对获得的rVTT-HA/NA进行PCR及测序表明,HA和NA基因正确插入VTT。蛋白质印迹显示,rVTT-HA/NA感染的Vero细胞表达的HA和NA能与相应的抗体发生反应。表达的HA具有血凝活性,血凝滴度为1∶32。结论  重组痘苗病毒rVTT-HA/NA可稳定表达H5N1 AIAV NIBRG14株的HA和NA。     

依地福新对Hela细胞生长的抑制作用及其机制研究

目的:观察依地福新对人宫颈癌Hela细胞的体外生长抑制作用,并进一步探讨其作用机制。方法:细胞中分别加入不同浓度的依地福新(0.5、1.0、5.0、10.0μmol.L-1)处理96h,并设立未加依地福新的对照组。应用MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞周期分布;染色法检测细胞凋亡率。结果:与对照组比较,不同浓度依地福新处理Hela细胞24～96h后,细胞增殖显著受到抑制,并呈浓度及时间依赖性;1.0、5.0、10.0μmol.L-1浓度依地福新处理72h后,Hela细胞G0/G1期细胞数量显著增加,S期细胞数量显著降低(P<0.01);各浓度组细胞凋亡率均显著增加(P<0.01)。结论:依地福新对Hela细胞具有生长抑制作用,其机制可能与阻滞细胞周期及诱导凋亡有关。     

X线修复交叉互补基因1缺陷细胞株的建立及其蛋白的表达

目的 运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制人X线修复交叉互补基因1(XRCC1)在支气管上皮细胞中的表达,为研究人XRCC1蛋白在环境化学污染物所致DNA损伤修复中的功能和机制作准备.方法 利用分子克隆技术构建含pU6启动子的XRCC1 RNA干扰特异性绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-U6-dsRNA";以脂质体法将载体重组子转染人支气管上皮细胞,同时以空白细胞和空载体转染细胞作对照;在经G418筛选后,以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果,以蛋白印迹法分析转染后细胞中的XRCC1蛋白表达情况.结果 在转染重组子的细胞中,XRCC1蛋白的表达明显下调,仅相当于正常细胞的38.2%.结论 人支气管上皮细胞人X线修复交叉互补基因1的靶向抑制成功.     

死亡素突变体TH1在裂殖酵母中的分泌表达

通过PCR方法人工合成带有K28信号肽的死亡素突变体基因，构建了重组表达载体pRHZ-41k28Th1，转化到裂殖酵母中进行表达，发酵液中检测到与TH1理论分子量一致的多肽分子，微量稀释法检验表达产物具有抑菌活性，并计算了粗产物对4种供试菌的最低抑菌浓度。     

共表达人PUMA和HGF／NK4基因的重组腺病毒的制备及在胰腺癌细胞中的表达

目的制备同步表达HGF／NK4基因和PUMA基因的重组腺病毒,感染胰腺癌细胞后检测基因的有效表达。方法将PUMA基因和HGF／NK4基因以串联方式依次克隆至腺病毒穿梭载体,构建重组穿梭载体pAdTrack-PUMA-NK4,转化大肠杆菌BJ5183并在细菌内与腺病毒载体同源重组制备重组腺病毒载体pAd-PUMA-NK4。PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞包装得到重组腺病毒。一定滴度的腺病毒感染人胰腺癌细胞株,荧光定量RT-PCR检测细胞中NK4和PUMA基因mRNA表达水平。结果双酶切重组pad-PUMA-NK4穿梭载体鉴定证实目的基因PUMA和HGF／NK4正确克隆;重组腺病毒载体经PacⅠ酶切得到特异的酶切产物转染HEK293细胞后成功包装出重组腺病毒;病毒感染胰腺癌细胞后3-9d内PUMA和NK4基因的表达水平较高,整体持续表达可维持2w。结论成功构建了同时表达NK4和PUMA基因的重组腺病毒载体并包装出相应的重组腺病毒颗粒,该腺病毒能有效感染胰腺癌细胞并高表达NK4和PUMA基因,这为进一步确定NK4和PUMA基因的功能及指导双基因联合治疗胰腺癌提供了理论依据和必要的材料。     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

人碱性成纤维细胞生长因子(hu-bFGF)在毕赤酵母中的分泌表达

通过PCR技术从pMD18-T/hu-bFGF质粒中扩增出hu-bFGF基因,并将其克隆到pGEM-T Easy克隆载体中。经测序鉴定后,目的基因通过XhoI和XbaI酶切后,以正确的阅读框插入到pGAPZ-αA的编码-αfactor信号肽序列的下游,构建成pGAPZ-αA/hu-bFGF重组分泌表达载体。表达载体用BlnI线性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,转化子经Zeocin抗性筛选、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE复筛获得分泌表达hu-bFGF的工程菌。Western Blot结果表明:重组蛋白能够与兔抗人bFGF抗体发生特异性反应,具有良好的抗原性。对工程菌培养条件的优化表明:以麦芽糖为碳源、培养基起始pH值为6.5、培养96 h时重组蛋白的表达水平最高。