大鼠脑微血管内皮细胞的分离、培养及不同纯化方法的比较

目的 对脑微血管内皮细胞分离、培养方法进行探索性研究,并对目前常用的纯化方法进行比较.方法 首先采用两次酶消化、两次梯度离心法对大鼠脑血管内皮原代细胞进行分离,然后分别采用免疫磁珠和Thy1.1抗体杀伤法分别进行纯化.结果 采用两次酶消化、两次梯度离心法可以成功分离到脑微血管内皮细胞,磁珠纯化法可得到纯度高但是数量较少的细胞,Thy1.1抗体杀伤法可得到纯度及得率均较高的内皮细胞.结论 我们所摸索的方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养.     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞在动脉粥样硬化的发病机制中发挥重要作用。本文通过胶原酶消化、密度梯度离心等技术建立一种程序简便、经济、稳定、获得细胞纯度较高的体外分离、长期培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的 建立稳定的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)体外培养模型,并对其生物学特性进行初步研究.方法 取Sprague-Dawley大鼠脑组织,通过匀浆、酶消化和梯度离心获得纯化的脑微血管段后,接种于涂布明胶的培养瓶进行原代培养;培养的细胞采用相差显微镜形态学观察、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定;采用跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance, TEER)检测单层细胞通透性;Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法测定细胞生长曲线.结果 细胞从贴壁的脑微血管段周围长出,呈短梭形和多角形,区域性单层生长,5～7 d细胞融合,经Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学检测证实培养的细胞是血管内皮细胞,原代培养的脑微血管内皮细胞表现出很强的屏障特性,随着传代次数的增加脑微血管内皮细胞的跨内皮阻抗减弱.结论 提示该方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养,原代培养的脑微血管内皮细胞是研究脑部微血管和血脑屏障的可靠技术手段.     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的探索一种简便可行的脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelialcells,BMECs)的培养方法,为研究BMECs在脑血管疾病中的重要作用提供技术支持.方法分离出生后1～4 d内的Wistar大鼠乳鼠大脑皮质,用植块法培养BMECs;用倒置显微镜观察BMECs的形态以及从皮质块细胞迁出的过程;通过形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光细胞化学法对培养细胞进行鉴定.结果大脑皮质块植块法培养的大鼠BMECs呈单层贴壁生长,细胞形态以长梭形、多角形、三角形、四边形为主,呈典型的"铺路石"样征象,第3代细胞经免疫荧光染色,第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,阳性率达95%以上.结论植块法具有经济、简便、要求条件不高,可成功培养高纯度的脑微血管内皮细胞的优点.     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

大鼠脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型的建立及他汀的保护作用

目的 建立大鼠脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型,并观察辛伐他汀、洛伐他汀的保护作用.方法 原代分离培养SD大鼠脑微血管内皮细胞,以无糖Krebs溶液再复氧复糖模拟体外缺血再灌注损伤,并实施辛伐他汀、洛伐他汀预处理干预.观察各组细胞形态,测定各组细胞上清中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性,利用CCK-8检测各组细胞增殖活性.结果 氧糖剥夺(Krebs液) 缺氧12h再复氧复糖4h模型可成功模拟大鼠脑微血管内皮细胞缺血再灌注损伤.辛伐他汀、洛伐他汀预处理后,脑微血管内皮细胞eNOS活性增强、iNOS活性降低,细胞增殖活性提高.结论 辛伐他汀、洛伐他汀具有显著的脑缺血再灌注损伤保护作用.     

兔脑微血管内皮细胞的培养及鉴定

目的：建立简便、有效的兔脑微血管内皮细胞体外原代培养方法。方法：兔脑皮质通过匀浆、过筛分离处理后接种，原代培养兔脑微血管内皮细胞，并通过Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色和透射电镜观察鉴定。结果：培养的细胞呈典型的“铺路石”状生长，Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阳性。结论：该方法可方便获取较纯净的脑微血管内皮细胞。     

同型半胱氨酸对脑微血管内皮细胞损伤的研究

目的：观察同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）对大鼠脑微血管内皮细胞（Rat cerebral microvascular endothelial cecl,RCMEC）的损伤效应,以揭示Hcy致动脉粥样硬化的可能机制.方法：①将不同浓度的Hcy分别加入培养的RCMEC中孵育2、4、6、8、10 h后,测定细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放率;②观察同型半胱氨酸损伤组和对照组细胞生长曲线以及相差显微镜下、透射电镜下结构改变.结果：Hcy使RCMEC的LDH释放率明显增加,破坏细胞形态结构并抑制其生长.结论：Hcy可能通过氧化应激损伤机制对RCMEC产生毒性损伤作用.     

大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法

目的建立一种简便可靠的脑微血管内皮细胞的培养方法.方法新生SD乳鼠脑皮质经匀浆、过滤、消化和差速贴壁等方法对大鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养及传代培养,对培养的细胞进行形态学观察,并用Ⅷ因子相关抗原进行免疫细胞化学鉴定.结果培养的细胞呈单层贴壁生长,约7～9d后呈典型的"铺路石"征象,免疫细胞化学鉴定证实为内皮细胞.结论此种脑微血管内皮细胞培养方法的建立为体外研究脑血管疾病提供了可靠的手段.     

Protective effects of icariin on neurons injured by cerebral ischemia/reperfusion

Background It is very important to search for novel anti-ischemia/reperfusion neuroprotective drugs for prevention or treatment of cerebrovascular diseases. Icariin, the major active component of traditional Chinese herb Yinyanghuo, may have a beneficial role for neurons in cerebral ischemia/reperfusion caused by accident. However, it was not clear yet. In this study, we observed the protective effects of icariin on neurons injured by ischemia/reperfusion in vitro and in vivo and investigated its protective mechanism. Methods Cerebral cortical neurons of Wistar rats in primary culture were studied during the different periods of oxygen-glucose deprivation and reperfusion with oxygen and glucose. Cell viability was determined by methyl thiazoleterazolium （MTY） assay. The activity of lactate dehydrogenase （LDH） leaked from neurons, cell apoptosis and the concentration of intracellular free calcium were measured respectively. On the other hand, the mice model of transient cerebral ischemia/reperfusion was made by bilateral occlusion of common carotid arteries and ischemic hypotension/reperfusion. The mice were divided into several groups at random： sham operated group, model group and icariin preventive treatment group. The changes of mice behavioral, activities of superoxide dismutase （SOD） and the content of malondialdehyde （MDA） were measured, respectively. Results Treatment with icariin （ final concentration 0. 25, 0. 5, and 1 mg/L） during ischemia./reperfusion- mimetic incubation in vitro concentration-dependently attenuated neuronal damage with characteristics of increasing injured neuronal absorbance of MTT, decreasing LDH release, decreasing cell apoptosis, and blunting elevation of intracellular calcium concentration. And in vivo the learning and memory abilities significantly decreased, activities of SOD were diminished and MDA level increased obviously in model group, compared with that in sham operated group. But pre-treatment of model mice with icariin （ 10, 30 and 100 mg/kg, i.g. ） significantly blunted the decrease of mice learning, memory ability and SOD activity, and markedly decreased MDA level. Conclusions Icariin has protective effects on cerebral ischemia./reperfusion injured neurons. And decreasing cell apoptosis, preventing intracellular calcium concentration elevation and enhancing anti-oxidant capacity may contribute to its protective effects.     

丹酚酸B对脑缺血再灌注小鼠内皮细胞分泌的影响

目的 动态观察丹酚酸B(SalB)对脑缺血再灌注小鼠血管内皮细胞分泌功能的影响.方法 NIH小鼠随机分为假手术组、模型组、丹酚酸B治疗组和尼莫地平对照组,复制脑缺血再灌注病理模型,并分别在脑缺血30 min再灌注0、30、60 min时测定脑组织一氧化氮(NO)、血浆内皮素(ET)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、组织型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)以及血管性假血友病因子(vWF)的含量.结果 模型组不同时点的ET,NO,PAI-1和vWF含量明显升高,而t-PA的含量降低.用丹酚酸B治疗,可调整内皮细胞的分泌功能,尤其是再灌注60 min时可显著降低ET、NO、PAI-1和vWF的含量(P<0.01或P<0.05),同时升高t-PA的含量(P<0.01).结论 丹酚酸B可能通过调整血管内皮细胞分泌舒缩、促凝和抗凝物质的平衡,起到减轻缺血再灌注脑损伤的作用.     

猪胆酸对体外缺血再灌注大鼠脑微血管内皮细胞ICAM-1的影响

目的观察大鼠脑微血管内皮细胞缺血再灌注损伤细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响,探讨清开灵有效组分猪胆酸阻抑脑缺血炎症反应的作用途径。方法体外培养大鼠脑微血管内皮细胞,氧糖剥夺法模拟缺血再灌注损伤,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法半定量检测ICAM-1蛋白和mRNA的表达。结果与正常组比较,模型组ICAM-1蛋白和mRNA的表达明显增高(P<0.01);与模型组比,猪胆酸显著降低ICAM-1的表达(P<0.05)。结论猪胆酸可能通过干预ICAM-1表达而阻抑脑缺血损伤炎症反应。     

Proliferation and differentiation of neural stem cells co-cultured with cerebral microvascular endothelial cells after oxygen-glucose deprivation

Various stem cells, including neural stem cells (NSCs), have been extensively studied in stroke models, but how to increase neuronal differentiation rate of NSCs remains unresolved, particu- larly in a damaged environment. The purpose of this study was to investigate the effects of cerebral mi- crovascular endothelial cells (CMECs) on the neurogenesis of NSCs with or without oxygen-glucose deprivation (OGD). The NSCs acquired from primary culture were immunostained to prove cell purity. Survival and proliferation of NSCs were determined after the co-culture with CMECs for 7 days. After removing the CMECs, NSCs were randomly divided into two groups as follows:OGD and non-OGD groups. Both groups were maintained in differentiation culture for 4 days to evaluate the differentiation rate. Mouse embryo fibroblast (MEF) cells co-cultured with NSCs served as control group. NSCs co-cultured with CMECs had an increase in size (on the 7th day:89.80±26.12μm vs. 73.08±15.01 μm, P<0.001) (n=12) and number [on the 7th day:6.33±5.61/high power objective (HP) vs. 2.23±1.61/HP, P<0.001] (n=12) as compared with those co-cultured with MEF cells. After further differentiation culture for 4 days, NSCs co-cultured with CMECs had an increase in neuronal differentiation rate in OGD and non-OGD groups, but not in the control group (15.16% and 16.07% vs. 8.81%; both P<0.001) (n=6). This study provided evidence that OGD could not alter the effects of CMECs in promoting the neuronal differentiation potential of NSCs. These findings may have important implications for the development of new cell therapies for cerebral vascular diseases.     

欧芹素乙对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的 :观察欧芹素乙 (imperatorin,IMP)对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用和对缺氧 /复氧诱导人脐静脉内皮细胞ECV30 4凋亡的影响。 方法 :栓线法阻断大脑中动脉建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型 ;以 L onga5分制评分标准对实验大鼠作行为评分 ,以图像分析仪测算实验鼠大脑梗死面积 ,细胞凋亡采用碘化丙啶染色方法 ,流式细胞术检测 ECV30 4细胞的凋亡。 结果 :IMP可显著减轻脑缺血再灌注损伤大鼠的神经损伤症状 (行为评分 ) ,缩小脑梗死面积 ;IMP可剂量依赖性降低缺氧 /复氧引起的 ECV30 4细胞的凋亡。 结论 :IMP对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用 ;IMP降低缺氧 /复氧引起的内皮细胞凋亡是其保护机制之一。     

美金刚保护缺血神经元分子机制的研究

目的 探讨N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体非竞争性抑制剂美金刚（memantine）对脑缺血再灌注（I/R）损伤的影响及其分子机制.方法 制备四动脉结扎（4-VO）大鼠全脑缺血模型.实验分为4组（n=6）：假手术组（sham组）,缺血/再灌注组（I/R组）,美金刚处理组和生理盐水组.在缺血后立刻腹腔注射美金刚或生理盐水.焦油紫染色观察海马CA1区神经元的存活情况,免疫印迹检测大鼠海马中p-ERK1/2的表达.结果 与sham组相比,I/R组神经元死亡增加,p-ERK1/2表达下调;与I/R组相比,美金刚处理组显著降低了神经元的死亡率,同时也明显升高了p-ERK1/2的表达.结论 美金刚抑制了I/R引起的神经元死亡.其机制可能与美金刚抑制突触外NMDA受体的过度激活进而激活ERK通路有关.     

脑栓通对脑缺血再灌注大鼠神经血管单元的保护作用

目的：观察中药脑栓通对脑缺血再灌注大鼠神经血管单元主要成分神经元、星形胶质细胞以及脑血管内皮细胞的保护作用。方法：30只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和1g/（kg·d）脑栓通组。采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血损伤模型,1.5h后拔出线栓实施再灌注。再灌注24h时后进行大鼠神经功能缺损评分,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷原位末端标记法结合神经元核抗原、胶质纤维酸性蛋白及CD31免疫荧光双染检测缺血再灌注24h时缺血灶周边的神经元、星形胶质细胞以及脑血管内皮细胞的凋亡情况。结果：脑栓通能显著改善脑缺血损伤大鼠的神经功能缺损,减少缺血灶周边星形胶质细胞、脑血管内皮细胞和神经元的凋亡。结论：脑栓通通过保护脑缺血再灌注后大鼠的神经血管单元促进神经功能的改善。     

大鼠局灶脑缺血后内皮前体细胞的相关实验研究

目的探讨缺血性卒中后外周血CD34^＋细胞和脑组织AC133抗原的变化。方法本研究采用大鼠大脑中动脉缺血再灌注线栓法模型,缺血2h。将成年SD雄性大鼠随机分为正常组、假手术组、动物模型组,分别取缺血再灌注1、3、6、12、24、48、72h、4、7、14d等作为观察点。取再灌注1、3、6、12、24、48、72h、4、7、14d外周血标本,采用流式细胞术检测外周血单个核CD34＋细胞平均荧光强度。采用免疫组化染色法检测2,3、4、7d脑组织AC133抗原表达。每个观察点5只大鼠,共60只大鼠,根据神经功能计分纳入实验。结果①大鼠脑缺血／再灌注3d外周血单个核CD34^＋细胞平均荧光强度明显降低,直到7d。14d恢复到基线水平。②AC133抗原在再灌注4d梗死半球半暗带区域的血管内皮细胞表达阳性,3、7d组无阳性表达。结论脑缺血再灌注后早期外周血CD34^＋干细胞明显下降,脑梗死半暗带区域部分血管内皮细胞出现AC33抗原的表达,提示内源性血管内皮干细胞可能参与脑缺血损伤的血管修复。     

脑溢安对缺氧大鼠脑微血管内皮细胞VEGF蛋白表达的影响

目的:观察脑溢安血清对体外缺氧培养的大鼠脑微血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法:大鼠用脑溢安浸膏连续灌胃3d后,心脏内采血分离出血清;用新生7d SD大鼠脑内分离培养的微血管内皮细胞（RCMEC）移入厌氧培养箱造成缺氧模型;MTT法测定细胞活性;免疫细胞化学及Werstern blotting研究脑微血管内皮细胞VEGF蛋白表达。结果:缺氧18h脑溢安组OD值较对照组增高（P<0.05）。缺氧损伤的脑微血管内皮细胞内VEGF蛋白表达增强,脑溢安血清组VEGF蛋白的表达水平高于对照组(P<0.01)。结论:缺氧可诱导脑微血管内皮细胞VEGF蛋白的表达;脑溢安可以上调VEGF蛋白的表达,这可能是脑溢安对缺氧的脑微血管内皮细胞的保护作用机制之一。     

SD大鼠线栓法局灶性脑缺血/再灌注模型的改进

目的 探索大鼠线栓法局灶性脑缺血／再灌注模型制备方法的改进。方法 按照文献方法,用头端处理过的尼龙钓丝,从颈外动脉向颈内动脉插入,可逆性阻断大鼠一侧中动脉。结果 在模型制作过程中,遇到的最大困难是栓线插线时的大出血,以及有时栓线无法正确插入颈内动脉。除了用血管夹夹闭颈总、颈内动脉外,直接在颈总、颈内动脉套上一根丝线牵拉,既有助于手术分离,又有助于控制出血;遇到栓线插入困难时,颈总、颈内动脉的复流可以有效地消除颈内动脉痉挛,成功率明显提高。结论 采用预先在颈总、颈内动脉套线,可以方便有效地控制出血。插线困难时,颈总、颈内动脉的复流可以提高成功率。