自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景：自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。目的：观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞（P〈0.01）。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制效应

目的:一些理论质疑富血小板血浆对骨前体细胞成骨分化的作用,本实验拟验证富血小板血浆对体外培养的人骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制效应。方法:实验于2005-05/11在南方医科大学组织工程试验室(省级)完成。①实验方法:抽取6名健康志愿者髂前上棘骨髓5mL进行体外细胞培养扩增,静脉血10mL以二次离心法制得富血小板血浆。诱导骨髓间充质干细胞时富血小板血浆与骨髓间充质干细胞均来自同一个体。②碱性磷酸酶染色:取第4代骨髓间充质干细胞,分为两组:富血小板血浆组加入富血小板血浆使终浓度为100g/L,单纯血清培养组仅加入等量胎牛血清。培养后第7天进行碱性磷酸酶染色,阳性细胞为胞质中呈现黑色颗粒或块状沉淀。③矿化结节染色:取第4代骨髓间充质干细胞,分组同上。培养后第19天以0.1%茜素红-TrisHcl(pH8.3)37℃下放置30min,矿盐沉积染色阳性为红色。④Cbfa1基因表达:取第4代骨髓间充质干细胞,分组同上。培养后第3,7,12,16天RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞Cbfa1基因的表达。⑤形态学观察:实验过程中使用相差显微镜观察各组细胞生长情况及形态学变化。结果:①骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色结果:培养后第7天,富血小板血浆组碱性磷酸酶阳性细胞数量较单纯血清培养组明显减少,且阳性细胞内灰黑色颗粒也明显减少,为弱阳性。②骨髓间充质干细胞矿化结节染色结果:培养后第19天,单纯血清培养组可见细胞表面有较多的矿盐沉积,但未形成明显的矿化结节。富血小板血浆组细胞表面只有稀少的矿盐沉积。③骨髓间充质干细胞cbfa1mRNA的表达:培养后第3,7,12,16天,随着培养时间的延长单纯血清培养组与富血小板血浆组cbfa1基因表达量均逐渐增高,同一时间点两组间cbfa1基因的表达基本相似。④骨髓间充质干细胞形态学变化:富血小板血浆组骨髓间充质干细胞增殖旺盛,细胞达到单层汇合的时间较单纯血清培养组明显缩短。单纯血清培养组细胞在完全汇合后开始出现聚合现象(14～16d),但趋向性不明显,未完全形成团簇;富血小板血浆组细胞在完全汇合后未出现聚合现象,细胞密集生长。培养初期两组细胞以梭形为主,多角形细胞较少,培养至14～16d单纯血清培养组多角形细胞较富血小板血浆组增多。结论:富血小板血浆可抑制人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的分泌与矿盐沉积,对人骨髓间充质干细胞成骨分化的直接效应是抑制其分化。     

脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞成软骨能力的比较

背景：脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞是软骨组织工程中应用较多细胞,二者在生物学特性上有诸多相似之处。目的：比较脂肪来源和骨髓来源的2种间充质干细胞的成软骨分化能力。方法：选取3月龄新西兰大白兔,取腹部脂肪,分离提取脂肪干细胞。取兔双侧股骨,采用贴壁筛选法分离提取骨髓间充质干细胞。绘制第3代脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞的生长曲线,比较2种细胞的倍增时间。对第3代脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞进行成软骨诱导,分别对诱导14d的2种细胞行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果与结论：骨髓间充质干细胞原代细胞呈聚集样生长,而脂肪干细胞原代细胞呈单个、散在生长。脂肪干细胞增殖速度要快于骨髓间充质干细胞,倍增时间短于骨髓间充质干细胞h。2种细胞成软骨诱导14d后,均表达糖胺聚糖和Ⅱ型胶原,且骨髓间充质干细胞成软骨诱导后表达Ⅱ型胶原水平高于脂肪干细胞。说明脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞体外增殖皆迅速且稳定,但是脂肪干细胞的生长增殖速度更快。单层培养时,特定条件下,脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞均能向软骨细胞转化,但是骨髓间充质干细胞比脂肪干细胞具有更高的潜能。     

富血小板血浆体外培养骨髓间充质干细胞的增殖与胶原产生

背景:间充质干细胞是可大量获取的肌腱组织工程种子细胞,但体外如何诱导其分化为功能化腱样细胞成为此项技术的关键.目的:观察富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞分裂增殖和胶原产生的影响.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,并采用自体富血小板血浆对骨髓间充质干细胞进行干预(设立高、中、低剂量富血小板血浆组,并设空白对照组),每日计数细胞并绘制细胞生长曲线,用MTT比色法分析各组骨髓间充质干细胞的存活和增殖能力.以ELISA定量检测细胞的胶原产生,通过RT-PCR反应测定富血小板血浆干预前后细胞Ⅰ型胶原基因的表达.结果与结论:高、中、低浓度富血小板血浆组骨髓间充质干细胞均保持较高的增殖活性,呈快速生长,曲线上升幅度大,与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05).培养时间越长作用越明显,培养一定时间后其作用具有剂量依赖性,较高剂量的富血小板血浆对细胞的增殖作用较为明显.富血小板血浆能明显促进骨髓间充质干细胞的Ⅰ和Ⅲ型胶原合成,剂量越大,刺激胶原产生的作用越明显.说明骨髓间充质干细胞具备组织工程化肌腱种子细胞的基本条件,富血小板血浆具有促进间充质干细胞向肌腱细胞转化的作用.     

富血小板血浆及脐带间充质干细胞修复软骨损伤

背景：研究者直接将富血小板血浆作为支架材料与骨髓基质干细胞、软骨细胞等复合后体外培养发现软骨细胞在富血小板血浆三维支架呈现增殖生长,骨髓基质干细胞在增殖的同时有向软骨细胞分化的倾向。目的：观察富血小板血浆和人脐带间充质干细胞对受损软骨修复的影响。方法：正常健康新西兰大白兔40只,制备兔软骨损伤模型。2次离心法制备富血小板血浆,制备3代人脐带间充质干细胞。随机将动物分为4组,造模后生理盐水组关节腔一次性注入生理盐水0.5 mL;富血小板血浆组注入12.5%富血小板血浆0.5 mL;人脐带间充质干细胞组注入1×107人脐带间充质干细胞0.5 mL;富血小板血浆(12.5%)联合人脐带间充质干细胞(1×107)组注入两种物质0.5 mL。造模后第12周,大体观察软骨损伤修复情况;苏木精-伊红染色光镜下观察损伤部位细胞修复情况;根据O’Driscol组织学评分标准对造模后第12周切片进行组织学评分。结果与结论：软骨损伤后大体观察、苏木精-伊红染色组织学观察及组织学评分均显示富血小板血浆组、人脐带间充质干细胞组、富血小板血浆联合人脐带间充质干细胞组对软骨损伤的修复效果优于生理盐水组,差异有显著性意义(P<0.05),富血小板血浆组、富血小板血浆联合人脐带间充质干细胞组的修复效果优于人脐带间充质干细胞组,差异有显著性意义(P<0.05)。结果说明富血小板血浆、人脐带间充质干细胞均能促进软骨损伤的修复,而且富血小板血浆、富血小板血浆联合人脐带间充质干细胞较单独应用人脐带间充质干细胞效果好。     

富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞成骨诱导的影响

背景:富血小板血浆足经过特殊方法提取的血小板含量丰富的血浆,相较普通血清含有更丰富的细胞因子,如血小板衍生因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子等.目的:观察富血小板血浆对成骨诱导人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响,拟探讨促进人骨髓间充质干细胞的增殖与诱导成骨细胞的培养方法.设计、时间及地点:配对样本对比观察,于2007-03/2008-03在中山大学组织工程实验室完成.对象:18名健康志愿者,男12名,女6名,平均年龄27.5岁.随机分为3组:富血小板血浆组、胎生血清组、无血清对照组,每组6人.方法:抽取18名健康志愿者自体外周静脉血获取富血小板血浆.采用密度梯度离心法获取健康志愿者骨髓间充质干细胞,常规原代培养,传代诱导培养时根据分组情况,分别采用10%AB型血清、10%自体富血小板血浆与无血清,配比高糖DMEM培养基、50mg/L抗坏血酸、1008mol/L地塞米松、103mol/L-β甘油磷酸钠.主要观察指标:倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞彤态,MTT法检测细胞增殖情况,细胞碱性磷酸酶活性、骨钙素水平.结果:3组细胞均存接种后12～24 h开始贴壁,并由圆形逐步变化为梭型、多角形、有多个突起的不规则形状等.细胞传代诱导培养后,富血小板血浆组与胎生血清组细胞生长迅速,明显快于无血清对照组(P<0.05).从传代培养第2、4、6代的细胞生长看,随着培养时间的延长富血小板血浆组细胞增殖明显快于胎生血清组.3组细胞碱性磷酸酶活性与骨钙素随诱导时间的延长而增高,培养第3,6,9,12天胎生血清组碱性磷酸酶活性较富血小板血浆组低,培养第15天两组无明显差异.培养第3,6,9天富血小板血浆组细胞内骨钙素含量与胎生血清组无明显差别,12 d后明显高于胎生血清组.无血清对照组碱性磷酸酶活性及骨钙索含量较富血小板血浆组变化程度明显减小.并且各时间点碱性磷酸酶活性与骨钙素含量均低于富血小板血浆组(P<0.01).结论:自体富血小板血浆能够有效加快人骨髓间充质干细胞的增殖,并能有效促进诱导培养的人骨髓间充质干细胞成骨特性表达.     

富血小板血浆对兔骨髓间充质干细胞增殖的作用

背景：自体富血小板血浆含有多种生长因子，可以克服外源性生长因子成分单一、来源有限、价格昂贵且存在一定的免疫排斥反应等不足。目的：观察富虹小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖的影响。设计、时间及地点：区组设计，开放实验．于2004-09／2005—02在同济医学院医学实验公共实验室完成。材料：2月龄新西兰大耳白兔。方法：采用密度梯度离心结合贴壁筛选及传代方法提取、纯化骨髓间充质干细胞，取较纯和生长状态较好的第3代细胞。采用二次离心法提取兔富血小板血浆。在完全培养基加入体积分数为0．2，0．1，0.05富血小板血浆培养骨髓间充质干细胞，以未加入富血小板血浆的完全培养基为对照。主要观察指标：①骨髓间充质干细胞生长曲线。②以MTT比色法观察骨髓间充质干细胞的存活和增殖能力。结果：①加入富血小板血浆干预第2天，骨髓间充质干细胞出现较高的增殖活性，呈快速生长，曲线上升幅度大，细胞倍增时间最短，约30h。以体积分数为0．2富血小板血浆组明显。对照组细胞从第3天起呈快速生长，细胞倍增时间最长，约46h。②富缸小板血浆体外培养骨髓间充质干细胞时间越长作用越明显，在培养第3天细胞生长的剂量依赖不明显，培养第6天后较高剂量的富血小板血浆对细胞的增殖作用显著增强，与对照组比较差异有显著性意义（P〈0．05，P〈0．01）。结论：富血小板血浆能明显促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖，并使细胞产生剂量依赖性。     

富血小板血浆优化培养间充质干细胞的实验研究

目的探讨以人富血小板血浆(PRP)取代动物血清培养可供临床应用的间充质干细胞(MSC)的新方法。方法骨髓标本取自行全髋关节置换术的造血功能正常患者的近端股骨。有核细胞2×10~5/cm~2接种于25 cm~2培养瓶中培养 MSC,比较含12.5% 胎牛血清(FCS)和12.5% 马血清的完全 Dexter 培养液,含10.0% FCS 的α-MEM 培养液和含5% PRP 的α-MEM 培养液三种培养体系的扩增效果。有核细胞1×10~6与采自健康供者髂骨的相同数量的骨髓细胞分别接种于25 cm~2培养瓶,14 d 后计数成纤维细胞集落(CFU-F)。结果从近端股骨中分离和扩增的细胞呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定 CD34、CD45阴性,SH2(CD105)、SH3(CD73)、Thy-1(CD90)阳性,体外诱导可向成骨细胞分化。其中含5% PRP 的培养体系较其他两种传统培养方法具有显著增强的 MSC 扩增效果且不改变细胞表型及分化功能;来源于近端股骨的骨髓细胞 CFU-F 较常规髂骨穿刺物显著增高(分别为89±17和16±5,P<0.01)。结论建立以 PRP 取代 FCS 的培养体系,并采用取自外科手术中近端股骨的骨髓标本可在体外高效扩增可备临床细胞治疗应用的 MSC。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及多向诱导分化

背景:间充质干细胞不仅自身免疫原性弱,还可以调节细胞免疫功能,减轻移植物排斥反应,在组织工程中具有良好的应用前景.但骨髓中间充质干细胞含量稀少,约占单个核细胞的十万分之一到百万分之一.目的:建立一种分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的方法,观察体外培养骨髓间充质干细胞的生长特性,及其潜在的诱导分化能力.方法:采用灌流法获取兔胫骨骨髓,密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增,相差显微镜观察其形态学特点,MTT法测定绘制传代骨髓间充质干细胞生长曲线,经成骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,0.1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L抗坏血酸,10 mmol/L β-甘油磷酸钠)、成脂诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L吲哚美辛,0.5 mmol/L IBMX,10 mg/L胰岛素)、成软骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,10 μg/L转化生长因子β1,0.1 μmol/L地塞米松,50 μmol/L抗坏血酸,6.25 mg/L胰岛素)体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化,并分别经碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色法鉴定.结果与结论:通过密度梯度离心法联合贴壁培养法可在体外大量扩增、纯化骨髓间充质干细胞,所获细胞具有高度自我更新能力和多向分化潜能,原代及传代骨髓间充质干细胞为梭形.经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红色脂滴,经成软骨细胞诱导,甲苯胺蓝染色阳性.     

不同分离方法对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

背景：目前并没有特定的实验对骨髓间充质干细胞分离的两种基本方法进行系统评估，所以贴壁分离法和密度梯度离心法对细胞诱导分化是否存在不同影响，尚无定论。目的：拟验证两种基本分离方法对骨髓间充质干细胞成软骨分化影响的差别。设计、时间及地点：对照观察实验，2005—03／09在中国医科大学附属盛京医院儿外实验室完成。材料：2-3月龄体质量1．2-2．0kg的日本大耳兔20只用于抽取骨髓。方法：用贴壁分离法和密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。选择两组同代的骨髓间充质于细胞，用转化生长因子β1诱导其向软骨方向分化。主要观察指标：①倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞的生长情况，绘制两组细胞生长曲线。②免疫组化检测两组Ⅱ型胶原表达。⑧原位杂交检测两组细胞Ⅱ型胶原mRNA表达。结果：绘制生长曲线表明两组细胞生长速度趋于一致。免疫组化法检测两种方法分离的骨髓骨髓间充质干细胞的软骨细胞分化率为76．1％和77．7％，原位杂交法检测的软骨细胞分化率为70．3％和71．0％，差异无显著性意义。结论：两种分离方法对骨髓间充质干细胞的生长和成软骨分化结果的影响无差异。     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化

背景：实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达。目的：通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响。方法：将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组。分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察。结果与结论：空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色。诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组（P〈0.05）;各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组（P〈0.05）。提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用。虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距。     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化

背景:实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达.目的:通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响.方法:将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10 mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组.分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察.结果与结论:空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色.诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组(P < 0.05);各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组 (P < 0.05).提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用.虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距.     

骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态观察

背景：骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向诱导时间报道不一,对诱导中细胞动态变化进行观察比较的研究较少。目的：观察兔骨髓间充质干细胞诱导8,11,14,17,20d向成软骨细胞定向分化的动态变化情况以及诱导成熟时间。方法：穿刺新西兰大白兔股骨穿刺抽取骨髓,密度梯度离心法分离、培养骨髓间充质干细胞。传至第3代后予以含转化生长因子B1等成分的无血清诱导液定向向软骨细胞诱导。根据不同的诱导时间分成为5组：8d组、11d组、14d组、17d组及20d组。通过观察各组细胞形态、甲苯胺蓝染色结果、Ⅱ型胶原免疫组化结果、培养液内多聚蛋白聚糖含量,比较各实验组定向诱导为成软骨细胞的情况。结果与结论：诱导8d时细胞形态有较明显改变,14d时具有明显的软骨细胞形态。诱导培养液在诱导4d时即可检出少量多聚蛋白聚糖,在8d时浓度出现明显升高,并保持缓慢升高至20d。在14d时,诱导的细胞爬片甲苯胺蓝染色可见异染颗粒;Ⅱ型胶原免疫组化明显阳性表现。提示单层高密度接种的骨髓间充质干细胞,在转化生长因子B1等因子作用下能定向诱导为软骨细胞,诱导早期即可能有少量细胞向成软骨细胞分化,8d时初步具有软骨细胞的形态、功能特征,14d时成为较成熟的软骨细胞;诱导过程中细胞保持较高的生物活性。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景:透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢?目的:通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法:全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论:经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景：透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢？目的：通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法：全骨髓法＋贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论：经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

兔骨髓基质干细胞诱导分化为软骨细胞的体外实验研究

目的:在体外分离获得兔骨髓基质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)的基础上探索诱导该细胞向软骨细胞方向分化的转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)的适宜浓度。方法:第3代BMSCs分别用TGF-β15ng/mL、10ng/mL和20ng/mL诱导2周,通过倒置相差显微镜、MTT法、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学等方法,观察细胞的生物学特性。结果:骨髓中分离获得的BMSCs在体外增殖旺盛,TGF-β1诱导后细胞生长明显减缓。与对照组相比,经过诱导2周后的BMSCs在48h时5ng/mLTGF-β1组的MTT光密度值差异无显著性(P>0.05),而10ng/mL组和20ng/mL组差异有显著性(P<0.05),但在72h时3个诱导组与对照组比较差异均有显著性(P<0.05),而3个诱导组间差异无显著性(P>0.05)。5ng/mLTGF-β1体外诱导BMSCs2周后,细胞甲苯胺蓝异染明显,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,表现为软骨细胞生物学特性。结论:5ng/mLTGF-β1诱导BMSCs向软骨细胞...     

小鼠骨髓间充质干细胞体外成肌分化中基质金属蛋白酶1的作用

背景:小鼠骨髓间充质干细胞体外成肌诱导分化效率较低。目的:观察基质金属蛋白酶1在体外对小鼠骨髓间充质干细胞成肌分化的作用。方法:利用差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定后,按照不同基质金属蛋白酶1药物处理浓度将小鼠骨髓间充质干细胞分成4组,即10μg/L组、1μg/L组、0.1μg/L组、对照组,给予相应处理后,Real-time定量PCR检测MyoD、Desmin mRNA表达,WesternBlotting检测Desmin蛋白表达。结果与结论:利用差速贴壁法分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞形态较一致,表面分子检测示CD29+、Sca-1+、CD45-、CD34-,并具有多向分化潜能;经基质金属蛋白酶1处理后,Real-time定量PCR检测示Desmin、MyoD mRNA表达上调,Western Blotting检测示Desmin蛋白表达上调,并且以上各成肌相关基因、蛋白表达增高程度与基质金属蛋白酶1具有浓度依赖性。提示基质金属蛋白酶1在体外可促进骨髓间充质干细胞向肌肉细胞分化。