肠道病毒71型检测与VP1基因特征分析

目的 分析肠道病毒71型2011年本地流行株VP1基因特征学特征.方法 收集2011年本地手足口病患者临床标本332份,进行EV71荧光定量RT-PCR鉴定,采用RT-PCR对15株分离到的EV71进行VP1编码区基因扩增,并对扩增产物进行核苷酸序列测序和分析.根据VP1测序结果与国内外报道的各基因型和基因亚型EV71 VP1序列进行同源性和亲缘进化分析.结果 165份标本鉴定为EV71,分离株的VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别是97.5%～99.9%和99.4%～100%.与C4a亚型的核苷酸和氨基酸最高.亲缘进化树显示,本地株全部属于C4基因亚型的C4a进化分支.结论 本地区分离的EV71与近几年国内其他地区EV71分离株亲缘关系很近,有共同进化的趋势,属于C4基因亚型的C4a进化分支,并存在多个传播链.     

大连市肠道病毒71型基因特征分析

目的 了解大连市手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的VP1区段的基因特征.方法 用RT-PCR方法从手足口病患者临床标本中扩增EV71的VP1基因全序列,利用软件进行同源性分析和构建系统发生树.结果 测序获得的9株病毒基因与C4亚型代表株具有较高的核苷酸和氨基酸序列同源性.在系统进化树上,9株病毒基因与C4基因亚型代表株处于同一分支.结论 大连市EV71病毒株属C4亚型.     

漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征分析

目的了解漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征。方法对2010年漳州市的5株肠道病毒71型分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4．0软件构建系统发生树。结果5株肠道病毒71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,且与2008年安徽阜阳流行株Fuyang．Anhui．P．R．C-17．08-2的VP1区核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高,分别为98．2％-98．8％和99．7％-100．0％。5株肠道病毒71型分离株间的核苷酸序列同源性为97．2％-99．8％．氨基酸序列同源性为99．3％～100．0％。氨基酸在98位和218位这两个位点发生了特异性变异。VP1区基因遗传进化分析表明,漳州市所有分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论5株肠道病毒71型分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支．与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型完全-致。     

珠海市2013年肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型基因特征

目的分析2013年珠海市手足口病（Hand-foot-mouth disease,HFMD）患者中,肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）的分子流行病学特征。方法采集珠海市2013年HFMD临床诊断病例粪便标本215份,选取其中Real time RT-PCR检测EV71病毒核酸阳性的18份和Cox A16病毒核酸阳性的8份标本,进行VP4区基因扩增,并进行核苷酸序列和遗传进化关系分析。结果 16份EV71扩增测序成功,与C4a基因亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性（95.2%-99.5%）和氨基酸同源性（91.3%-100%）;5份Cox A16扩增测序成功,有2份与B2a亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性（98.6%-99.0%）和氨基酸同源性（97.1%-98.5%）,3份与B2b亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性（96.6%-97.1%）和氨基酸同源性（100%）。结论 2013年珠海市流行的EV71属于C4a基因亚型,Cox A16为B2a和B2b两种基因亚型。     

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1基因特征分析

目的:探讨苏皖地区手足口病(HFMD)患者肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)分离株的VP1基因特征。方法:采集南京市、马鞍山市2009至2010年HFMD患者临床标本进行病毒分离和RT-PCR鉴定;扩增并测定VP1基因序列;从GenBank中选取EV71和CA16不同基因型参考毒株,利用生物信息学软件进行同源性比对和系统进化树分析。结果:共分离到9株EV71和4株CA16,EV71分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.5%～99.8%和99%～100%;CA16分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性为96.2%～98.5%和99.3%～100%;系统进化树分析显示,9株EV71全部属于C4a基因亚型,而4株CA16则全部属于B1b基因亚型。结论:2009至2010年苏皖地区分离到的EV71和CA16毒株分别属于C4a和B1b基因亚型,与国内其他地区HFMD病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究。     

Genetic evolution of entervirus 71 isolated in Ningxia in 2010

目的 分析2010年宁夏回族自治区手足口病(HFMD) 患者中肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)分离株基因特征.方法 收集宁夏2010年手足口病患者粪便,咽拭子和疱疹液标本,进行病毒分离培养和Real-time RT-PCR检测后,对鉴定为EV71毒株的VP1编码区进行核苷酸序列测定分析.结果 共收集各类标本994份,分离获得EV71 225株,对所有EV71毒株的VP1编码区基因进行序列测定,选择其中53株进行序列分析.宁夏分离株与A、B、C型基因型代表株核苷酸同源性分别为80.0%~81.5%、82.4%~84.7%和87.2%~99.1%;氨基酸同源性分别为93.9%~94.3%、96.3%~97.6%和97.6%~100%,与C4a亚型同源性最高为95.6%~99.1%,在系统发生树上,这53株毒株与C4基因型代表株聚为一簇,属于C4亚型中的C4a分支,而且提示至少存在4条病毒传播链.结论 2010年EV71的C4a亚型在宁夏有较广泛的流行,是宁夏流行的绝对优势基因亚型,其流行存在多条传播链.     

宁夏2010年肠道病毒71型进化分析

目的分析2010年宁夏回族自治区手足口病(HFMD)患者中肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)分离株基因特征。方法收集宁夏2010年手足口病患者粪便,咽拭子和疱疹液标本,进行病毒分离培养和Real-time RT-PCR检测后,对鉴定为EV71毒株的VP1编码区进行核苷酸序列测定分析。结果共收集各类标本994份,分离获得EV71 225株,对所有EV71毒株的VP1编码区基因进行序列测定,选择其中53株进行序列分析。宁夏分离株与A、B、C型基因型代表株核苷酸同源性分别为80.0%～81.5%、82.4%～84.7%和87.2%～99.1%;氨基酸同源性分别为93.9%～94.3%、96.3%～97.6%和97.6%～100%,与C4a亚型同源性最高为95.6%～99.1%,在系统发生树上,这53株毒株与C4基因型代表株聚为一簇,属于C4亚型中的C4a分支,而且提示至少存在4条病毒传播链。结论 2010年EV71的C4a亚型在宁夏有较广泛的流行,是宁夏流行的绝对优势基因亚型,其流行存在多条传播链。     

肠道病毒71型河南分离株2株全基因组序列分析

目的:了解2011年河南洛阳和南阳地区流行的肠道病毒71型(EV71)基因特征。方法:分离洛阳和南阳地区EV71病毒各一株,分别进行全基因测序和基因进化分析。结果:EV71/Luoyang2011和EV71/Nanyang2011的VP1区序列在进化树上均属于C4亚型,与国内流行株都具有较高同源性,与2008年广东流行株亲缘关系最近。这2株全基因核苷酸序列同源性为99.3%,氨基酸序列同源性为97.6%,并且氨基酸均没有发生明显改变。结论:EV71/Luoyang2011和EV71/Nanyang2011属于C4亚型,与我省及我国既往流行株相比,未发生大的变异。     

2014-2015年江苏省肠道病毒71型基因特征分析

目的：探讨2014-2015年江苏省肠道病毒71型(EV71)分离株的病毒基因特征。 方法：用RD细胞对EV71核酸检测阳性的标本进行病毒分离。选取35株具有代表性的EV71分离株进行VP1区的序列测定和分析。序列结果用DNA Star和MEGA 6.0软件进行分析,并与各型参考株进行比较。 结果：35株EV71分离株VP1区的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.3% ～100%和96.6% ～100%,与 EV71的C4a亚型代表株安徽阜阳株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.6%～97.9%和在97.9%～100%;在系统进化树上与C4a亚型代表株相聚在一起,并且存在2个进化分支。 结论：2014-2015年江苏省分离的35株EV71毒株均属于C4a亚型;江苏省EV71流行株可能与国内其他省市流行的病毒有着共同的祖先,再各自进化。     

1株肠道病毒71型毒株的分离与鉴定

目的 探讨手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的分离与鉴定方法。方法 采集手足口病疑似病例的咽拭子标本1份接种于人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell, RD细胞),通过观察病毒的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)来分析EV71的分离效果。分别利用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹分析(Western Blotting)方法来鉴定EV71病毒特异性核酸和蛋白。扩增EV71VP1区全长基因,对其序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 手足口病疑似病例咽拭子标本接种RD细胞传代至第2代后出现CPE。RT-PCR和Western Blotting检测结果均显示,感染组RD细胞中有EV71病毒特异性条带,暂命名为EV71分离株2016SHYP001。序列分析结果显示,2016SHYP001株病毒的VP1区核苷酸与C型代表株的同源性较高,为93.1%~98.3%;其中与C4a亚型代表株的同源性最高,为98.3%。进化树分析发现本地流行株与深圳地区流行株的亲缘较近。结论 成功分离出一株新的EV71病毒株2016SHYP001,其株型为C4a亚型。     

2014—2015年江苏省肠道病毒71型VP1基因特征分析

目的：探讨2014—2015年江苏省肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)分离株的病毒基因特征。方法：用RD细胞对RT?鄄PCR初筛EV71阳性的标本进行病毒分离,成功分离到的EV71分离株进行VP1区的序列测定和分析。序列分析结果用DNA Star和MEGA 6.0软件进行分析,并与各型参考株进行比较。结果：共分离到35株EV71型毒株,分离阳性率为29.17%。35株EV71分离株VP1区的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.3%～100.0%和96.6%～100.0%,与EV71的C4a亚型代表株安徽阜阳株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.6%～97.9%和97.9%～100.0%;在系统进化树上与C4a亚型代表株相聚在一起,并且存在2个进化分支。结论：2014—2015年江苏省分离的35株EV71毒株均属于C4a亚型;江苏省EV71流行株可能与国内其他省市流行的病毒有着共同的祖先,再各自进化。     

手足口病重症患者的临床表现

目的 探索重症手足口病患者中肠道病毒EV71基因特征.方法 对采集的重症手足口患者标本进行实时荧光定量PCR检测后,阳性标本进行病毒分离培养,选取分离毒株,对其VP1区进行核苷酸序列测定并构建系统发生树,且进行核苷酸和氨基酸的同源性比较.结果 106例手足口重症患者,实时荧光定量检测结果47例阳性,47例核酸检测阳性标本病毒分离到19株毒株,对15株毒株VP1进行测序后,确定均为C4a亚型,核苷酸和氨基酸同源性比较分别为98.3%~99.7%,99.3%~100%.结论 2010-2011年银川市手足口重症病例EV71株均为C4a亚型,与2008年宁夏报道的流行亚型相一致,提示C4a亚型是近年来宁夏手足口病流行的主要亚型.     

宁夏2011年肠道病毒71型VP1区域序列分析

目的 分析2011年宁夏肠道病毒71型分离株VP1的遗传特征.方法 对宁夏40株EV71分离株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析.结果 2011年宁夏40株分离株与A、B、C型基因型代表株的核苷酸同源性分别为80.9%～82.7%、81.4%～84.8%、87.2%～93.7%,氨基酸同源性分别为94%～95%、96.6%～98%、97.7%～99.7%,与C4a亚型同源性最高;VP1区遗传进化分析表明,这40株同属于C4a亚型.结论 2011年宁夏流行的肠道病毒71型均为C4a亚型,病毒未产生明显的变异,其流行存在多条传播链.     

VP4基因鉴定非EV71非CoxA16手足口病病原体漏检的研究

目的探讨肠道病毒VP4基因通用引物PCR诊断非肠道病毒71型( EV71)非柯萨奇病毒A组16型( CoxA16)手足口病( HFMD)病毒方案的准确性。方法通过肠道病毒VP4基因通用引物PCR鉴定阜阳地区非EV71非CoxA16 HFMD病毒时,显示两例病毒分离株为Sabin-1(命名为Fy-01和Fy-02株)。分别采用引物EVP4/Q8和VP1特异性引物对Fy-01和Fy-02分离株进行鉴定。结果采用VP4基因PCR扩增产物测序证实,两例病毒分离株为Sabin-1,而采用EVP4/Q8引物PCR扩增Fy-01分离株却存在异常的扩增条带,PCR扩增产物测序结果为柯萨奇病毒A组10型( Cox-A10);将VP4基因PCR产物制备成克隆载体挑选多个单克隆测序结果显示,Fy-01分离株既存在Sabin-1 VP4基因,又存在CoxA10 VP4基因,证实为两种毒株混合感染。结论临床诊断为非EV71非CoxA16 HFMD的病例,如病原学诊断仅采用VP4基因PCR产物测序,特别是针对多种肠道病毒混合感染引起的HFMD,其结果并不完全可靠。     

广州地区儿童肠道病毒71 型分离与鉴定

目的 调查广州地区2004年度EV71感染的流行病学特征.方法 采集可疑为肠道病毒感染患者粪便、疱疹液、咽拭子和脑脊液标本,进行病毒分离和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)特异性扩增进行鉴定,随机选取其中4株EV71分离毒株,对其VPI区进行核苷酸序列测定,并参考EV71各基因型的参考毒株和以往中国EV71的分离毒株进行同源性分析.结果 全年EV71病毒检出率3.09%(13/421),主要集中在该年度4月份,13株均来自手足口病患者.4株EV71病毒株之间同源性高达97.5%～99.6%;与A、B基凼型代表株比较,同源性在83.2～84.7%,83.4%～84.7%之间,差异大于15.3%;与EV71病毒C基因型代表株比较,同源性在89.3%～95.1%,较为接近,差异小于12%;与国内以往分离到的Il株CA亚型毒株的核苷酸同源性可达91.9%-97.5%.结论 广州地区2004年度EV71感染的检出率较低,以手足口病的方式.未见其它的并发症,基因型属C4亚型,与近年我国大陆地区流行的EV71株在进化上可能属于同一基因.     

河南省2010年柯萨奇病毒A组16型VP1区基因特征分析

目的了解河南省2010年柯萨奇病毒A组16型(CA16)流行株VP1区基因特征。方法对河南省2010年手足口病(HFMD)粪便和咽拭子样品中分离到的10株CA16病毒,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP1编码区基因扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列分析,与已报道的CA16标准株序列构建基因亲缘关系树。结果 10株CA16毒株,其VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.9%~100.0%,99.3%~100.0%,与国际CA16标准株G10在VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为67.0%~69.0%,72.0%~74.0%。亲缘进化树显示全部CA16株可分为A和B两个基因型,B基因型又可分为B1和B2两个基因亚型。河南省分离的CA16毒株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a和B1b两条进化分支在河南省共同流行。结论河南省手足口病感染CA16病毒的流行株属B1基因亚型,有B1a和B1b两个进化分支共同进化和循环。     

深圳市龙华区2018年手足口病病原学特征

目的 分析2018年深圳市龙华区手足口病病原学特点,为辖区手足口病预防和控制策略的制定和调整提供科学依据。方法 采用荧光定量RT-PCR方法对哨点医院送检的223份手足口病临床诊断病例的肛拭子样本进行肠道病毒（Enteroviurs, EV）、肠道病毒A组71型（Enteroviurs A71, EV-A71）、柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16, CV-A16）、柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6, CV-A6）、柯萨奇病毒A组10型（Coxsackievirus A10, CV-A10）核酸检测,并对EV核酸阳性样本进行VP1区序列测定、同源性分析、亚型鉴定和系统进化分析。结果 实验室确诊病例有166例,阳性率为74.44%,构成比前3位的病毒亚型依次为CV-A6（43.37%）,CV-A16（31.33%）,CV-A10（13.86%）;2018年深圳市龙华区流行的主要肠道病毒中,EV-A71属于C4a进化分支;CV-A16（n=18）核苷酸同源性为89.0%~99.9%,氨基酸同源性为98.3%~99.7%,属于B1a（38.89%,7/18）和B1b（61.11%,11/18）进化分支;CV-A6（n=45）核苷酸同源性为95.1%~99.9%,氨基酸同源性为98.1%~99.0%,均属于D3进化分支;CV-A10（n=12）核苷酸同源性为93.5%~99.8%,氨基酸同源性为97.6%~99.7%,均属于C进化分支。结论 深圳市龙华区应进一步加强辖区手足口病监测,持续关注病原谱构成和重要病原体进化情况。     

2009年肠道病毒71型广州分离株的全基因组序列分析

目的分析2009年肠道病毒71型广州分离株GZHY09的全基因组序列,并与GenBank中的序列进行分析比对。结论从GenBank上选不同地区的EV71全基因组序列,设计相互重叠的覆盖病毒整个基因组序列的12对引物,采用RT-PCR扩增出12个基因片段,通过测序获得全基因组序列,并参考国内外各EV71基因型的分离毒株,用MEGA4软件进行进化树分析,用DNAStar软件中的MegAlign进行同源性分析。结果 12个重叠基因片段序列拼接获得EV71全基因组序列,共7404个核苷酸,同源性分析结果表明在VP1区,GZHY09株与中国大陆的Anhui08、Zhejiang08、Shenzhen08的核苷酸序列同源性比较高,其中以Anhui08最高(97.7%)。结论 GZHY09属EV71病毒的C4亚型,与近年我国大陆地区流行的EV71株在进化上属于同一基因型,与Anhui08、Zhejiang08、Shenzhen08具有高度的同源性。     

重症手足口病180例病原学检测及肠道病毒71型基因特征分析

目的 探讨重症手足口病病原学特征,分析肠道病毒71型(EV71)基因型的特征.方法 重症手足口病患儿180例,采集发病一周内的咽拭子或肛拭子标本,应用实时反转录-聚合酶链反应方法检测标本中的肠道病毒.分别选取2014年及2015年各5例EV71检测阳性标本扩增基因的VP1区,测序并比对,构建进化树分析.结果 180份标本中肠道病毒核酸阳性153份,阳性率85.00％.153份阳性结果中EV71核酸阳性占50.3％ (77/153),柯萨奇病毒A组16型(CVA16)核酸阳性占19.6％ (30/153),其他肠道病毒核酸阳性占30.1％ (46/153).2014年及2015年以EV71为主,CVA16较少,两年间病毒型别构成比较,差异无统计学意义(P＞0.05).多元线性回归分析示,拟合回归方程:Y =2.095X1+0.462X2-0.214,式中Y为重症病例数,X1为EV71病例数,X2为其他肠道病毒病例数.EV71数可反映99.7％重症病例变化.不同年龄间病毒型别构成比较,差异无统计学意义(P＞0.05).发病高峰集中在每年4～8月;发病以4岁以下儿童为主,占82.7％,尤其是1～3岁年龄段(57.8％).EV71 VP1区与C4a基因型代表株核苷酸同源性为91.6％ ～92.5％,氨基酸同源性为97.5％ ～ 98.8％,亲缘进化分析显示EV71与C4a基因型代表株处于同一分支.结论 EV71是本地区重症手足口病患儿主要病原,且属于C4a基因亚型.     

2010年天津市流行的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VPl区域序列分析

【目的】研究2010年天津市手足口病患者中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的VPl基因特征。【方法】采集60例天津地区2010年手足口病流行期间患儿的粪便标本,分别用EV71和CoxAl6的VPl区域引物对粪样中病毒RNA进行PCR检测。同时选取11株EV71扩增阳性和4株CoxAl6扩增阳性的样本,对其扩增产物的VPl区进行核苷酸序列测定,比照EV71和CoxAl6各基因型进行同源性分析,并构建系统发生树。【结果】从60例手足口病患儿粪便标本共检测出27例EV71阳性和4例CoxAl6阳性。经VPl区测序,11例EV71阳性与EV71C4基因型同源性94．4％～94．8％;4例CoxAl6阳性与CoxAl6C基因型同源性93．4％-94．7％。在系统发生树上,这11株EV71均属于EV71C基因型,与c4亚型属于同一分支;4株CoxAl6均属于CoxAl6的C基因型。【结论】2010年天津市手足口病患者粪便样本中检测出的EV71毒株属于EV71C4亚型,CoxAl6毒株属于CoxAl6C基因型。