siRNA抑制感染细胞模型中HCV复制的研究

目的:探讨siRNA能否有效抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞中HCV的复制.方法:用HCV JC1质粒体外制备HCV RNA转录体,转染Huh-7.5.1细胞,收集细胞上清,再次孵育Huh-7.5.1细胞以建立HCV感染细胞模型,并用间接免疫荧光检测细胞内HCV核心蛋白的表达.将针对HCV NS5B基因的siRNA转染HCV感染细胞(浓度为4、40和200 nmol/L,时间为24 h、48 h和72 h),将4、40和200 nmol/L siRNA转染正常Huh-7.5.1细胞,并设空白对照、脂质体对照、无关siRNA对照以及IFNα-2b(1 000 IU/ml)组,用荧光定量PCR检测细胞内HCV RNA和PKRmRNA水平.结果:HCV感染的Huh-7.5.1细胞中检测出HCV核心蛋白表达.40 nmol和200nmol/L siRNA 24 h组及4、40、200 nmol/L siRNA 48 h和72 h组,HCV RNA水平分别降至58％、54％、29％、17％、17％、33％、22％、19％,明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).1 000 IU/mlIFN的各时间组HCV RNA水平均明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).各浓度siRNA组的PKR mRNA的表达与对照组无明显差异(P＞0.05).结论:针对HCV NS5B区的siRNA能够明显抑制HCV感染细胞中HCV的复制,而不引起双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)基因表达的激活.     

T103A变异MxA蛋白抑制水泡性口膜炎病毒复制的体外研究

目的研究T103A变异MxA蛋白抑制水疱性口膜炎病毒(VSV)复制活性。方法将野生型、T103A变异MxA蛋白表达载体和对照质粒分别瞬时转染Wish细胞,24h后VSV感染细胞,48h后用MTT法检测各组细胞增殖;另取Wish细胞转染上述3种质粒,转染24h加入VSV感染细胞,24h后收集细胞采用RT-PCR检测VSV mRNA水平;Western blot检测各组MxA蛋白表达。结果野生型、T103A变异MxA蛋白均在Wish细胞有较好表达;MTT检测结果提示T103A变异组细胞增殖数显著低于野生型组(P<0.01);RT-PCR结果显示T103A变异组VSVmRNA水平显著高于野生型组(P<0.01),但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论T103A变异MxA蛋白失去了抑制VSV复制活性。     

华南HCV 1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建和序列分析

目的构建来自华南不同慢性丙型肝炎(CHC)患者的HCV NS5A的复制子重组质粒并测序分析,探索HCV NS5A在抗病毒应答中生物学特性。方法以能够高效复制的1b型HCV复制子质粒为骨架,构成带有MIuⅠ和BclⅠ双酶切位点的开关质粒,采用逆转录-聚合酶链反应从不同CHC患者血清中扩增获得HCV 1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况。扩增产物中无MIuⅠ和BclⅠ酶切序列的,在引物中引入相关酶切序列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV 1b复制子骨架中。结果成功扩增出NS5A全长片段并克隆测序,将NS5A区ISDR-V3区域置换入复制子中,测序结果正确。序列比对显示应答株的ISDR和PKRBD氨基酸变异数目比无应答株高;V3和IRRDR区域存在较高氨基酸突变率。结论成功构建包含华南HCV 1b亚型NS5A核心区域的复制子插入式重组质粒,为研究HCV NS5A生物学特性、干扰素抵抗的机制以及难治性CHC患者的个体化抗病毒治疗分析奠定了基础。     

TNF—α和IFN对骨肉瘤细胞的作用研究

目的 :探讨肿瘤环死因子 (TNF)对骨肉瘤细胞 (Os732细胞株 )的细胞毒作用 ,为骨恶性肿瘤临床治疗提供依据。方法 :将Os732细胞株培养于 16 4 0培养液中 ,放置于 37℃、5 % CO2 培养箱中 ,根据细胞的生长特性及倍增时间 ,待细胞生长到一定的数量进行传代 ,传代后的细胞足以施行实验后收集起来 ,调整为 5× 10 4个 / m l细胞悬液备用。分别将 TNF、干扰素 (IFN)、TNF+IFN各调整为不同的浓度梯度。取细胞培养板每孔加入 15 0μl细胞悬液。分别加入不同浓度的细胞悬液 5 0μl,每浓度重复 4～ 6孔 ,分别于 2 4、4 8、72、96 h各取一培养板加入浓度为 5 g/ L MTT液 2 5 μl设置空白对照 ,培养 4 h后 ,倒弃培养液每孔加入 2 0 0μl二甲基亚砜 ,于微型震荡器上震荡完全溶解结晶后放入免疫酶联测定仪测各值。结果 :TNF、IFN、TNF+IFN各试验组均对骨肉瘤细胞有细胞毒作用 ,其中 TNF浓度从 5 0 0～ 4 0 0 0 U/ ml其细胞杀伤力由 13%～ 2 7.6 3% ,IFN浓度从 5 0 0～ 4 0 0 0 U/ ml其细胞杀伤力从 13.95 %～ 33.2 4 % ,而联合应用的 TNF+IFN浓度由 2 5 0 +2 5 0 U/ ml至 2 0 0 0 +2 0 0 0 U/ m l其杀伤力从 2 0 .6 1%～ 5 9.6 1% ,各浓度梯度越往上细胞杀伤力越高 ,联合应用时 ,半量的剂量浓度即达到同一浓度全量的效     

苏拉明对黄病毒类NS3蛋白质合成的影响

寻找有效的抗黄病毒类药物,为临床应用提供理论依据.在病毒吸附培养细胞HepG2后加入不同浓度的苏拉明,48 h后采取培养上清液及感染细胞,运用病毒滴度测算(plaque法)、Western blot法及RT-PCR法,检测其对病毒增殖的影响.结果显示用苏拉明50 μg/m1处理后产生的病毒量是对照组的51.8%,同时显示病毒NS3蛋白质合成量减少,而对病毒RNA无任何影响.提示苏拉明抑制病毒复制作用主要是阻碍了病毒NS3蛋白质的合成.     

呼吸道合胞病毒非结构蛋白NS1调节Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的表达

目的:研究呼吸道合胞病毒(RSV)非结构蛋白NS1转染人上皮细胞后对Ⅰ/Ⅱ型细胞因子表达的调节效应。方法:在遗传信息不变的条件下,构建稳定的RSV-NS1表达质粒(富含GC),采用Western blotting技术检测质粒NS1在转染A549细胞不同时间段其蛋白的表达,并用ELISA法检测培养上清中干扰素(IFN)-β和白细胞介素(IL)-10的浓度。结果:NS1转染A549细胞1、2、4、8、24 h后,Western blotting法鉴定显示质粒NS1转染细胞1 h后即可检测到其蛋白表达。IFN-β在NS1转染细胞8 h后浓度逐渐降低(P<0.05),这一下降趋势持续至24 h仍有意义;IL-10在NS1转染细胞4 h后浓度开始上调,8 h增加到基础值7.8倍,并在8~24 h内持续上调(P<0.05)。结论:RSV NS1转染早期即在上皮细胞表达并差异性调节Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的表达。     

丙型肝炎病毒亚基因组复制子模型及其应用

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是丙型肝炎的致病体。目前对HCV的预防和治疗缺乏有效手段,常规的干扰素单用或者IFN联用病毒唑治疗的总体应答率比较低,治疗费用颇高,且具有明显的毒副作用。长期以来,由于缺乏适合HCV体外病毒复制的培养细胞系和动物模型,对于病毒生活周期     

丙型肝炎病毒NS5A基因的克隆及序列比对分析

目的:研究HCV N S5A区基因的结构与功能,为提高干扰素(IFN)治疗HCV感染的有效性提供依据,及为建立以N S5A蛋白做抗原的新一代诊断试剂盒,提高HCV感染检出率作出有益的尝试。方法:以含HCV 1b全长cDNA的质粒HCV 17为模板,利用巢式PCR扩增出一段长约500bp的cDNA片段,以此基因片段作为目的基因,进行T-A克隆,构建PMD 18-T-N S5A。结果:经酶切及测序证实,PMD 18-T-N S5A质粒中的插入基因片段为HCV 1b N S5A区部分基因,与HCV标准株HCV J序列进行比对分析,核苷酸和氨基酸序列的同源性均为90%以上,并且该区段包含了干扰素敏感决定区(ISDR)。结论:建立HCVN S5A基因片段稳定的无性繁殖系,并进行同源性分析对研究ISDR序列与IFN疗效的关系是非常重要的;通过基因重组表达N S5A蛋白,可用于HCV诊断试剂盒的研究。     

以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVNS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

目的：构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体，并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达，为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础。方法：从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1（+）/ NS345中扩增出HCV NS5A基因片段，构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒。用脂质体将其转染HL-7702细胞，通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白。结果：用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组，测序证实所克隆的NS5A基因片段大小正确；成功地构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒，瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白，Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000。结论：HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/ NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白，NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生，且NS5A区为IFN敏感性决定区。     

南京市生殖器疱疹人群乙肝、丙肝和艾滋病检测结果分析

目的：了解南京市性病门诊中生殖器疱疹人群中乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和艾滋病病毒的携带情况。方法：收集南京市性病门诊HSV阳性血液样本266份,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBV表面抗原、HCV抗体和HIV抗体。结果：266份生殖器疱疹人群血液样本中HBV、HCV及HIV的感染率分别为11.65%（31/266）、2.26%（6/266）,1.13%（3/266）。结论：HSV/HBV混合感染率高于HSV/HCV混合感染率和HSV/HIV混合感染率。HSV/HBV双重感染在通过性接触途径而感染HSV者中多见,性病门诊中感染单纯疱疹病毒（HSV）人群可易感HBV、HCV、HIV,尤其易感HBV,要引起高度重视。     

荧光定量PCR检测TTV方法学建立及临床应用

目的　建立一种灵敏度高、特异性好、操作简便的荧光实时定量PCR技术。方法　设计针对TT型肝炎病毒(TTV)基因保守序列非转录区的一对引物和一条荧光基团双标记探针。将PCR扩增所得的产物片段克隆 ,作为定量检测的标准品。对 36例丙肝患者及 12 3例不同血清标志物阳性的乙肝患者、16 6例健康体检者血清中TTVDNA定量检测 ,评估TTVDNA在不同人群中检出阳性率的差异显著性。结果　该方法检测TTVDNA的灵敏度高于普通套式PCR ELISA方法 ,线性范围为 10 2～ 7拷贝 /ml;批间CV为 13.2 %～ 16 .0 % ,批内CV为 6 .5 %～ 11.3%。健康体检者、丙肝患者、乙肝患者三组人群阳性检出率无显著性差异 ;且乙肝患者 (TTVDNA )血清ALT水平与TTVDNA载量无显著相关性 (P >0 .0 5 ) ;乙肝患者血清ALT异常与正常两组TTVDNA阳性检出率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　该方法操作简单、灵敏度高、特异性好、结果数据化 ,适合于临床实验室进行临床标本的TTVDNA定量检测。     

洛阳市城乡幼儿园儿童蛲虫感染情况调查

目的：了解洛阳市城乡儿童蛲虫感染情况并为该病的防治提供依据。方法：采用透明胶纸拭子法，将透明胶纸粘贴于受检者肛门周围后取下贴在玻片上显微镜下检查虫卵。结果：城市和农村儿童蛲虫感染率分别为２１７３％和６５５７％，两者有显著性差异（Ｐ＜００１）。男女儿童感染率分别为４６４５％和４３９８％，两者无显著性差异（Ｐ＞００５）。城市儿童各年龄组感染率为５７１％～２８．００％，其中４岁组儿童感染率最高为２８％。农村儿童各年龄组感染率为６２７％～６７．２％，各年龄组间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。结论：农村儿童感染率显著高于城市儿童，男女儿童之间无明显差别。     

云南省澜沧江下游地区人、鼠血清三种蚊媒病毒抗体调查

目的;对澜沧江下游地区的思茅,澜沧,景洪,勐腊,孟海5个县,市进行三种蚊媒病毒的抗体调查,了解当地蚊媒病毒的流行情况。方法：血凝抑制试验。结果：在人血清中,乙型脑炎的阳性率为46．94％,基孔肯雅的阳性率为2．63％,辛德毕斯的阳性率为1．93％;在鼠血清中,乙型脑炎的阳性率为16．15％,基孔肯雅的阳性率为0．73％,辛德毕斯的阳性率为0．73％。结论：证实澜沧江下游地区在人群和鼠间存在乙型脑炎,基孔肯雅和辛德毕斯病毒的感染。     

HBV阳性肝病者肾组织内HBSAg和HBCAg的形态研究

从尸检材料中获得３０例ＨＢＶ阳性的肝组织，观察其组织学，并进行ＨＢＳＡｇ、ＨＢＣＡｇ的免疫组化染色。根据ＨＢＡｇ的染色形态，将其分成两类：反映病毒活跃复制的第一类（１８例）；病毒可能呈整合状态的第二类（１２例）。同时检测肾组织内ＨＢＳＡｇ和ＨＢＣＡｇ的表达情况，其ＨＢＡｇ阳性者１２例，阳性率为４０．０％。其中肾小球阳性者１０例，分布主要在系膜区和沿毛细血管袢，也有核内ＨＢＣＡｇ表达；肾小管ＨＢＡｇ阳性１２例，其中ＨＢＳＡｇ阳性１１例，形态有膜型、弥漫型、周边型和包涵体样型，ＨＢＣＡｇ阳性５例，形态有弥漫型、膜型或伴间质分布及核内表达。肾小管ＨＢＡｇ表达与肾小管和肾间质病变有关。     

HIV与HBV/HCV共感染的临床研究进展

人类免疫缺陷病毒（HIV）,乙型肝炎病毒（HBV）及丙型肝炎病毒（HCV）具有相似的传播途径,均可通过血液（包括输血和输血制品）、性接触（包括同性接触和异性接触）、母婴垂直及静脉注射吸毒等途径传播.所以,HIV合并HBV/HCV感染比较常见,引起了国内外研究人员的重视,近年来的相关研究取得了一些成果.该文就目前HIV合并HBV/HCV感染的流行病学、临床治疗等方面的研究进展予以综述.     

122例艾滋病患者合并乙肝病毒 丙肝病毒感染的临床流行病学研究

目的 研究在抗逆转录病毒药物治疗(HAART)状态下HIV/AIDS患者合并乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)的流行状况以及相关血清生化和病毒学特征.方法 对122例正在接受HAART治疗的HIV/AIDS患者采集血标本,使用酶免法(ME-IA)检测乙肝五项指标(HBs Ag、抗-HBs、HBe Ag、抗-HBe、抗-HBc)、肝功能,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测丙型肝炎病毒抗体,运用RT-PCR法对丙肝病毒抗体阳性标本以及表面抗原和/或核心抗体阳性标本分别进行HCV-RNA以及HBV-DNA测定.以43名单纯HCV感染者作为对照组进行研究.结果 122名 HIV/AIDS患者,乙肝五项指标全阴性97例(78.86％),表面抗原阳性3例(2.46％),表面抗体阳性者总计19例(15.57％),单纯核心抗体阳性者3例(2.46％).HCV 抗体阳性84例(68.85％),84例HCV抗体阳性标本中HCV-RNA 阳性58例(69.05％),HIV/HCV/HBV合并感染者为0.HIV/HCV合并感染组 HCV-RNA 水平与感染者性别,CD4 +细胞数水平无明显差异(P＞0.05);HIV/HCV合并感染组与单纯HCV感染组 HCV-RNA水平、肝功能异常率无明显差异(P＞0.05).结论 HIV感染者HBsAg阳性率低于普通人群,HIV/HCV合并感染的比例显著高于普通人群.HIV/HCV合并感染与单纯HCV感染者血清生化及病毒学改变相似.     

728例急慢性肝病病因的血清学诊断分析

对728例急慢性肝病患者进行了甲、乙、丙型肝炎病毒标志物的检测。结果显示：甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染率分别为25．8％、67．5％、21．6％，双重感染率为20．5％，三重感染率为1．8％，三型病毒标志物均阴者67例（9．2％），提示本地区肝病以HBV感染为主。性别与感染肝炎病毒类型关系不大（P＞0．05）。小儿HAV感染率明显高于成人（P＜0．01），成人HBV感染率高。丙型肝炎病毒抗体在各年龄组均可检出，且阳性率随年龄增加而升高。     

EB病毒血清学联合DNA定量检测在诊断婴儿传染性单核细胞增多症中的意义

目的 评估EB病毒抗体VCA-IgM、VCA-IgG、EA-IgG、EBNA-IgG及EBV-DNA载量检测在婴儿传染性单核细胞增多症（IM）中的诊断意义.方法 用ELISA法检测78例IN患儿血清中EBV四种抗体及PCR荧光定量法检测外周血单个核细胞EBV-DNA载量.结果 在IM急性期VCA-IgM阳性率在＜1岁患儿中为27.8％,而≥4岁组患儿中为83.3％.有近20％＜1岁患儿所有EBV抗体均阴性,需重复做抗体测定.EBV-DNA载量检测总阳性率为70.5％,＜1岁患儿中阳性率为61.1％,＜1岁组患儿中有5例,在1岁组患儿中3例早期检测VCA-IgM抗体是阴性,而EBV-DNA载体是阳性的,但在后来的VCA-IgG检测均是阳性的.结论 在婴儿期IM急性阶段,只用血清学方法来诊断不够灵敏,建议在VCA-IgM阴性的患儿中联合EBV-DNA载量检测,以提高婴幼儿IM临床诊断的敏感性.     

丙型肝炎病毒母婴传播及机制研究

目的 对丙型肝炎病毒母婴传播及其机制进行研究。方法 联合检测抗－ＨＣＶ和ＨＣＶ－ＲＮＡ确定孕妇和婴儿丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染,分析ＨＣＶ基因型和定量检测孕妇血清中ＨＣＶ,研究ＨＣＶ的婴母传播及其影响因素。结果 对６１０名孕妇进行了研究,孕妇ＨＣＶ感染率为２．９５％（１８／６１０）,对感染ＨＣＶ的孕妇所生１８名婴儿随访１２个月,其中５名婴儿感染了ＨＣＶ,ＨＣＶ母婴传播率为２７．８％（５／１８）,所