鼻咽癌表达下调基因NASG3''''UTR可变剪接分析及其在多种肿瘤中的表达

背景与目的:采用抑制性消减杂交技术已分离获得了人鼻咽组织特异性基因NASG。本研究对人鼻咽组织特异性表达且在鼻咽癌表达下调的NASG基因3'非编码区(untranslatedregion,UTR)的可变剪接进行分析,并考察NASG基因在多种肿瘤组织中的表达。方法:在NASG基因3'UTR存在可变剪接部位的两端设计引物进行RT-PCR扩增,分离扩增产物并测序。用RT-PCR检测NASG基因在鼻咽癌中的表达,采用了肿瘤表达谱阵列(cancerprofilingarray)杂交分析NASG基因在多种肿瘤组织的表达状况。结果:NASG基因3'UTR存在3种剪接产物,NASG基因在71%的鼻咽癌活检组织中表达下调,25%的肺癌组织中表达上调,而在其他肿瘤及其配对的正常组织未见明显表达。结论:NASG基因3'UTR存在3种剪接产物,NASG基因的表达异常是鼻咽癌和肺癌发生、发展过程中重要的分子事件。     

人鼻咽与鼻咽癌组织p53调节基因差异表达的研究

目的 用cDNA Array比较鼻咽癌组织及正常组织基因表达谱,研究鼻咽癌组织内p53调节基因表达差异。方法 Atlas人类肿瘤cDNA表达阵列7742－1滤膜杂交后,用AtlasImage 1.01a分析膜杂交结果,RT－PCR反应验膜杂交结果,免疫组化证实基因在蛋白质水平的表达改变。结果 在588个肿瘤相关基因中,共有134个基因表达上调,88个基因表达下调。膜上有p53调节基因32种,其中13种显示差异表达,有11个表达上调,2个表达下调。结论 在鼻咽癌组织内,p53的功能失控,MDM2、p21和Bax可能对鼻咽癌细胞的生长起重要的调控作用。     

应用EST策略鉴定人类新基因UBAP1的数字化差异表达图谱

背景与目的：UBAP1（ubiquitin associated protein1）基因是我们先前在人类染色体9p21-22鼻咽癌杂合性丢失（loss of heterozygosity,LOH）高频区所获得的一个鼻咽癌相关新基因。进一步地,我们应用EST策略鉴定UBAP1基因在多种肿瘤组织中的差异表达谱。方法：采用基于生物信息学的电子杂交方法,即以UBAP1基因的全长cDNA为“探针”,利用计算机对人类表达序列标签（expressed sequence tag,EST）和Unigene等数据库中代表UBAP1的EST在各类肿瘤及相应正常组织cDNA文库中的分布进行综合分析,研究UBAP1基因的数字化差异表达图谱。同时采用差异RT－PCR方法对UBAP1在3种肿瘤活检组织中的差异表达进行验证。结果：电子杂交结果表明UBAP1基因不仅在42种人类正常组织中广泛表达,而且在11种肿瘤组织中存在可能的表达差异,尤其是在脑瘤、乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、睾丸癌和宫颈癌等肿瘤组织中表达显著下调（P＜0．05）,而在肾癌、胰腺癌中高表达（P＜0．05）。进一步采用差异RT－PCR方法发现UBAP1基因在64％的脑膜瘤和72％的结直肠癌活检组织中具有明显表达缺失／下调。结论：UBAP1基因有可能与多种肿瘤的发生发展密切相关,有必要深入研究UBAP1基因的表达异常参与肿瘤发生发展的分子机制。     

肿瘤睾丸抗原(CTA)在肺癌中的表达

目的：检测多种肿瘤睾丸抗原（CTA）基因在肺癌中的表达。方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法对35例肺癌患者癌组织和癌旁正常肺组织进行MAGE－1、－3，SSX－1、－2、－4、－5和NY－ESO－mRNA表达检测。随机抽取每种CTA基因的3例RT－PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定。结果：35例肺癌标本中MAGE－1、－3，SSX－1、－2、－4、－5和XY－ESO－1的表达率分别为34．3％（12／35）、57．1％（20／35）、17．1％（6／35）、20．0％（7／35）、26．7％（9／35）和37．1％（13／35）。正常肺组织中7种CTA基因均无表达。肿瘤组织中7种基因至少有1种表达的几率是26／35（74．3％），两种或两种以上同时表达几率是23／35（65．7％）。测序结果表明RT－PCR产物确为CTA基因。结论：CTA在肺癌主动免疫治疗中是一种合适的、有前景的攻击靶点。同时，多种CTA的联合表达为多效价CTA疫苗在肺癌免疫治疗中的应用提供了理论基础。     

用高密度cDNA微阵列技术检测鼻咽癌差异表达基因

背景与目的：鼻咽癌的发生与发展涉及多个步骤,多个因素的参与,对此目前尚缺乏了解,本研究试图通过大规模检测鼻咽癌的基因差异表达来揭示鼻咽癌的差异表达基因谱,以发现与鼻咽癌发生,发展相关的新的候选基因。方法：用由18000个基因构建的高密度cDNA微阵列对21例鼻咽癌分3个样本池分别检测并与鼻咽非癌组织作对比分析。随机选2个基因用半定量RT－PCR验证检测结果。结果：3个样本池鼻咽癌差异表达基因分别为186个,95个和36个,总数达317个,表达上调的277个,表达下调的40个,差异表达基因中2个样本池以上有共同差异表达的基因有23个,表达上调的16个,表达下调的7个,其中3个样本池表达均有差异者6个,5个上调,1个下调,5个上调的基因中2个是已知基因,3个是未知基因,1个下调的是未知基因。结论：本研究揭示了鼻咽癌的基因表达谱,为了解鼻咽癌发生,发展的分子机理提供了大量信息,为寻找鼻咽癌相关基因提供了重要线索。     

一个定位于 7q31 32的鼻咽癌负相关新基因的初步研究

目的：克隆染色体7q31-32区域D7S495附近鼻咽癌相关的候选抑瘤基因,并研究其在鼻咽癌发生发展中的作用。方法：应用定位－候选克隆策略结合生物信息学手段筛选鼻咽癌负相关的EST（Expressed Sequence Tags)cDNA克隆测序和5‘RACE扩增获取候选EST的cDNA序列。Northern杂交和RT－PCR检测其组织表达谱及其在正常人胚鼻咽上皮与鼻咽癌细胞株和活检组织中的表达差异。Southern杂交和甲基化分析表达差异的机制。结果：克隆到一个位于7q31-32的与鼻咽癌负相关的新基因（GenBank登录号：AF196976,命名为NAG－14）,该基因编码649AA,含有LRR和IgC2结构域。Multiple Tissue Northern(MTN^TM)Blot杂交结果显示该基因在脑组织中表达较强,而在心、肝、肾、肺、脾、骨骼肌和胎盘等多种组织中检测不到表达。RT－PCR检测发现其在鼻咽癌细胞株和75％活检组织表达缺失或下调,Southern和甲基化分析表明其在鼻咽癌细胞株中某些位点发生甲基化修饰,鼻咽癌活检组织中存在遗传物质丢失,Southern和甲基化分析表明其在鼻咽癌细胞株中某些位点发生甲基化修饰,鼻咽癌活检组织中存在遗传物质丢失。结论：NAG14可能是定位于7q31-32的一个与鼻咽癌相关的抑瘤基因候选者。     

Notch1 胞内段荧光表达质粒的构建及鉴定

目的：构建能够在鼻咽癌细胞株中高效表达人Notchl信号胞内段（NIC）的荧光质粒。方法：通过RT—PCR获得人NIC的cDNA;利用基因重组技术插入到pEGFP—N1中;在脂质体介导下转染人低分化鼻咽癌细胞CNE2后,经荧光显微镜、RT—PCR和Westernblot检测NIC的表达情况。结果：RT—PCR方法得到一条2424bp的特异性扩增产物,酶切和基因测序结果表明重组质粒构建成功。转染48h后,检测到绿色荧光表达,RT～PCR和Westernblot的结果显示NIC的表达量升高。结论：正确构建了人NIC荧光表达质粒。该质粒能够在鼻咽癌细胞株中高效表达,为研究Notch信号通路在鼻咽癌中的作用奠定了实验基础。     

BRD7交互作用蛋白基因BRD2、BRD3在鼻咽癌组织中的表达

背景与目的：BRD7基因是通过cDNA代表性差异分析获得的一个鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）密切相关基因。采用酵母双杂交技术,已从人胎脑的cDNA文库中筛选到了两个与BRD7蛋白存在交互作用且包含溴区结构域（bromodomain)的蛋白BRD2、BRD3。本研究的目的在于进一步证实BRD7蛋白与BRD2、BRD3蛋白之间的交互作用,探讨BRD2、BRD3基因在鼻咽癌中的表达和作用模式。方法：将BRD2、BRD3基因分别与BRD7基因共转化酵母Y187后将菌落影印到尼龙膜,X－Gal检测酵母中报告基因LacZ的表达,推断BRD2、BRD3与BRD7蛋白之间的交互作用。RT－PCR方法检测BRD2、BRD3基因在正常鼻咽上皮组织和鼻咽癌活检组织中的差异表达以及在BRD7基因稳定转染的鼻咽癌细胞株（HNE1）中,BRD7基因的重表达对BRD2、BRD3基因表达水平的影响。结果：通过特异性酵母双杂交技术,发现酵母转化子的颜色呈蓝色,进一步证实BRD2、BRD3蛋白能分别与BRD7蛋白发生交互作用。RT－PCR结果显示,在鼻咽癌组织中,BRD2和BRD3基因表达下调或缺失;在BRD7基因稳定转染的HNE1细胞株中,随着BRD7基因表达的增强,BRD2、BRD3基因的表达存在明显的上调。结论：BRD7蛋白能分别与BRD2、BRD3蛋白发生交互作用,且在mRNA水平存在一定程度的协同表达作用,彼此可能形成二聚体或三聚体,共同参与鼻咽癌的发病过程。     

鼻咽癌细胞中表达上调的新基因 NAG23 (FBXO 30) 的克隆与分析

目的：分离位于6号染色体长臂鼻咽癌高频等位基因不平衡位点D6S1581（6q25.3-27）附近与鼻咽癌相关的新基因。方法：运用差异RT－PCR检测定位于D6S1581附近的11个表达序列标签（expressed sequence tage,EST)在正常人鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞系中的表达水平,并对其中一个表达上调的EST在鼻咽癌组织和正常鼻咽组织中的表达情况进行分析。用Northern杂交验证其表达差异并检测其在多脏器中的表达及所代表基因的转录本大小。利用生物信息学资源克隆并获得其全长cDNA ,对该序列进行初步分析。结果：获得了一个位于6q25．3－27的在鼻咽癌中表达上调的新基因,命名为NAG23（FBXO30）(GenBank收录编号：AF248640）。该基因在68．9％的鼻咽癌活检组织中表达上调,cDNA全长3301bp,预测其开放阅读框编码一个含390个氨基酸的胞浆蛋白,该蛋白含一个F－box基序。结论：NAG23基因是一个在鼻咽癌中表达上调的新基因,很可能编码一新的F－box蛋白。NAG23可能参与了鼻咽癌的发生发展。     

细胞角蛋白基因13在鼻咽癌中的作用研究

目的 研究细胞角蛋白基因１３（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １３,ＣＫ１３）在人鼻咽癌组织中的表达,并对其甲基化程度进行了检测。方法 应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术检测３２例鼻咽癌活检组织和８例慢性鼻咽炎组织中ＣＫ１３的表达情况。同时运用甲基敏感的限制性内切酶ＨｐａⅡ和ＭｓｐⅠ,结合Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,对鼻咽癌细胞 ＨＮＥ１及正常人上皮ＣＫ１３基因的甲基化状态进行检测。     

组织芯片技术检测人鼻咽癌组织及细胞株KIAA1173基因的表达

背景与目的:鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)致病的分子机制至今仍不清楚,已有研究表明,染色体3p21～22区域存在与鼻咽癌发生密切相关的抑癌基因。KIAA1173基因是定位于3p22.1的一个新的肿瘤相关基因,其与NPC发病的关系尚未见报道。本研究采用KIAA1173基因特异性原位杂交探针,检测其在NPC组织及细胞株中的表达,探讨KIAA1173基因与NPC发病的关系。方法:克隆KIAA1173基因片段(354bp),并制备cDNA探针;采用组织芯片技术,通过原位杂交检测73例鼻咽部不同组织标本(41例NPC、18例鼻咽非典型增生上皮、14例正常鼻咽粘膜上皮)和6种NPC细胞株(CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、6-10B、5-8F)中KIAA1173基因mRNA的表达情况。结果:KIAA1173基因在NPC细胞、非典型增生上皮和正常鼻咽粘膜上皮的阳性率分别为21.9%(9/41)、83.3%(15/18)、92.8%(13/14),而6种NPC细胞株均未见表达;在正常鼻咽粘膜上皮和非典型增生上皮中强阳性率分别是64.3%(9/14)和38.9%(7/18),而NPC中无强阳性,在鼻咽部不同上皮组织中的表达差异有显著性(P<0.001);在38例伴有淋巴细胞浸润的NPC组织中,癌细胞与浸润淋巴细胞之间KIAA1173基因表达有显著性差异(P=0.026),并且呈明显负相关(κ=-0.337,P=0.020)。结论:KIAA1173基因在鼻咽部不同组织中表达不同,正常鼻咽上皮强表达,而NPC细胞中低表达甚至不表达,提示该基因可能参与NPC演变的过程。     

精细定位和克隆9p21-22区域内鼻咽癌候选抑瘤基因

目的：进一步精细限定鼻咽癌９p２１－２２区域等位基因杂合性丢失的频率和范围,筛选 和克隆其共同缺失区内鼻咽癌相关的候选抑瘤基因。方法：应用１１个定位于９p２１－２ ２区域的高密度微卫星位点,检测２５例低分化鼻咽癌患者的杂合笥技失,确定其共同缺失区;用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ筛出在鼻咽癌细胞株ＨＮＥ１和鼻咽癌活检组织中表达下调的、定位于共同缺失区内的３’末端ＥＳＴs（Ｅｘｐｒｉｓｓ Ｓｅｑｕｅｎｃ     

鼻咽癌细胞系中LTF基因的表达及遗传学与表观遗传学改变

目的 检测鼻咽癌(NPC)细胞系中LTF基因的表达水平,并分析遗传学和表观遗传学改变与其表达的关系.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),检测NPC细胞系HNE1、HNE2、HNE3、CNE1、CNE2、5-8F、6-10B和15例慢性鼻咽炎组织中LTF mRNA表达水平,同时通过Western blot法分析6-10B细胞中LTF蛋白水平.运用微卫星分析技术、聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)方法和甲基化特异性PCR(MSP)以及亚硫酸盐克隆测序方法,分别检测LTF的杂合性丢失、突变和启动子区甲基化情况.结果 在15例慢性鼻咽炎组织中,LTF基因稳定表达.在NPC细胞系中,除6-10B细胞有LTF基因弱表达外,其余均表达缺失,显著低于慢性鼻咽炎组织中的表达(Z=-3.738,P=0.000),且6-10B细胞中无LTF蛋白的表达.杂合性丢失分析显示,NPC细胞系中不存在LTF微卫星位点的缺失.突变检测显示,LTF在NPC细胞系中的突变率为14.3%(1/7),且突变存在于HNE1细胞系中,即启动子序列-305至-50 bp发生了缺失突变(-218delT).甲基化分析显示,LTF基因在慢性鼻咽炎组织中无甲基化,而在所有NPC细胞系中均有甲基化.用5-杂氮-2-脱氧包苷处理5-8F和6-10B细胞后,LTF mRNA表达上调.结论 LTF基因在NPC细胞系中表达失活,其分子机制与启动子高甲基化和缺失突变有关.     

间隙连接蛋白Cx43、Cx45在鼻咽癌组织中的表达

背景与目的：间隙连接在细胞间的营养物质,离子和细胞调节因子的交换中起重要作用。间隙连接异常,细胞间的物质交换障碍,往往导致细胞分裂失控,在有些癌组织和癌细胞中存在间隙连接的功能异常。恢复这些癌细胞的间隙连接功能,它们表现出正常细胞的生物学表型,因此,探讨细胞间隙连接蛋白在鼻咽癌中的表达,将有可能为临床诊断提供方法。为鼻咽癌的发病机理提供新思路。方法;采用免疫组化技术检测间障连接蛋白Cx43,Cx45在鼻咽组织中的表达。结果：（1）Cx43,Cx45在鼻咽慢性炎症组织和鼻咽癌组织中有表达差异,在鼻咽癌中,Cx43,Cx45阳性率为44．8％,46．6％,与鼻咽慢性炎症柱状上皮细胞阳性率为85％和100％比较,显著性下降（P＜0．01）,（2）鼻咽慢性炎症组织比鼻咽癌组织含鳞状细胞的百分率低（P＜0．01）,分别为29．7％和56．9％,（3）Cx43,Cx45在鼻咽癌旁柱状上皮细胞中的表达低于癌旁鳞状上皮细胞（P＜0．001）,高于癌细胞（P＜0．01）,结论：Cx43,Cx45在鼻咽组织中的表达异常,可能与鼻咽组织鳞化和癌变有关。     

人鼻咽与鼻咽癌cDNA阵谱中DNA修复相关基因表达差异的初步研究

目的 用cDNA阵卤咽癌组织及正常组织的基因表达谱,研究鼻咽癌组织内修复相关基因的表达差异。方法 Atlas human cancer cDNA expression array 7742-1杂交后,用Atlas Image 1.01a分析滤膜杂交结果,RT－PCR反应验证滤膜杂交结果。结果 在588个肿瘤相关基因中,共有134个基因表达上调,88个基因表达下调。在有DNA损伤应答、修复、重组相关基因的C区中,表达上调的基因有21个,与修复相关的有6个;表达下调的有44个,与修复相关的则有12个。结论 DNA修复相关基因的改变可能在鼻咽癌病理生理过程中起一定作用。     

CSPG4基因在鼻咽癌中的表达分析

  目的  研究硫酸软骨素多糖蛋白4（CSPG4）基因在鼻咽癌及对照组织中的表达。  方法  采用实时荧光定量PCR测定CSPG4基因在4例正常鼻咽上皮和18例鼻咽癌组织（其中Ⅱ期6例,Ⅲ期5例,Ⅳ期7例）中的表达情况;通过构建包含92例对照和187例鼻咽癌的组织芯片,应用免疫组织化学检测CSPG4蛋白的表达和分布。  结果  正常鼻咽上皮中CSPG4基因mRNA表达水平较低,在鼻咽癌中CSPG4表达上调且与临床分期呈正相关,差异具有统计学意义（P=0.017）。免疫组织化学结果表明鼻咽癌中CSPG4蛋白表达水平高于对照组,91.98%的鼻咽癌组织中CSPG4为强阳性表达,而对照组的强阳性率为76.09%（P=0.001）。  结论  CSPG4在鼻咽癌中随着临床进展表达逐渐上调,可能参与了鼻咽癌的发生发展,具体机制及临床应用前景值得进一步深入研究。