重组腺病毒Ad-ES对人脐静脉内皮细胞的体外抑制作用

目的 构建携带人内皮抑素(ES)的重组腺病毒Ad-ES,体外感染人脐静脉内皮细胞ECV-304,观察抑制作用.方法 以Pshuttle-ES质粒为模板PCR扩增ES基因片断,利用AdEasy-1系统及AAV293细胞构建并包装出Ad-ES,感染ECV-304细胞,病毒感染48 h后,Western blot检测ES蛋白表达,流式细胞术及DNA ladder检测ECV-304细胞凋亡情况,绘制细胞生长曲线.结果 ECV-304细胞在感染Ad-ES后生长受到抑制,感染3 d后出现细胞凋亡.结论 重组腺病毒Ad-ES在体外可抑制ECV-304细胞的生长并诱导其凋亡.     

重组腺病毒Ad-PTEN对肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒Ad-PTEN介导786-O细胞中PTEN的表达,以探讨其对癌细胞增殖和迁移的抑制以及诱导细胞凋亡的作用。方法:将构建的重组腺病毒Ad-PTEN体外感染786-O细胞,荧光显微镜下观察感染效率;免疫印迹检测细胞中PTEN的表达;MTT实验观察其对细胞增殖的影响作用;细胞划痕实验观察其对细胞迁移的抑制;PI染色观察其对细胞凋亡的诱导作用。结果:以MOI为100的病毒量感染细胞后48 h,感染效率达到100%;感染病毒后,细胞可检测到PTEN蛋白的表达,细胞的增殖和迁移均受到抑制,细胞被诱导出现凋亡。结论:重组腺病毒Ad-PTEN可高效介导786-O细胞表达PTEN,并产生抑制细胞增殖和迁移以及诱导细胞凋亡作用,为肾癌的基因治疗提供理论基础。     

KISS1基因激活ERK1/2磷酸化通路抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的研究

目的:探讨KISS1及其受体基因KISS1-R在ERK1/2磷酸化通路中调节鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的分子机制。方法:采用实时荧光定量PCR以及蛋白免疫印迹技术,检测KISS1、KISS1-R基因、黏着斑激酶（FAK）的表达;验证ERK1/2信号通路的磷酸化激活,EZR蛋白的表达与鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的关系。构建过表达KISS1及KISS1-R基因载体,通过划痕实验及Transwell实验分析过表达KISS1（SUNE-KISS1）及KISS1-R（SUNE-1R）基因对SUNE-1-5-8F鼻咽癌细胞系的迁移能力的影响。通过蛋白免疫印迹技术,检测在过表达KISS1及KISS1-R基因后,磷酸化FAK（p-FAK）和磷酸化ERK（p-ERK）以及EZR蛋白的表达水平。通过阻断ERK1/2通路的磷酸化激活,验证KISS1及KISS1-R基因对鼻咽癌细胞迁移能力的影响,以及对细胞转移相关蛋白p-FAK、EZR表达量的影响。最后,通过siRNA抑制KISS1基因表达,进一步验证KISS1基因对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的调控作用。结果:实时荧光定量PCR实验发现,KISS1基因在SUNE-1-6-10B细胞中表达量相对于SUNE-1-5-8F细胞中较高。蛋白免疫印迹分析发现,KISS1及KISS1-R的蛋白表达量,以及p-FAK的表达量与鼻咽癌细胞转移能力呈负相关;EZR与鼻咽癌细胞转移能力呈正相关关系。划痕及Transwell实验分析发现,过表达KISS1及KISS1-R基因均能够有效抑制SUNE-1-5-8F细胞的迁移和侵袭能力。蛋白免疫印迹分析发现,过表达KISS1及KISS1-R基因能增加p-FAK及p-ERK1/2的蛋白表达量,抑制EZR蛋白的表达。加入ERK1/2通路特异性的阻断剂PD98059后,由过表达KISS1及KISS1-R基因引起的细胞迁移和侵袭的抑制状态被阻断。同时,由过表达KISS1及KISS1-R引起的p-FAK与p-ERK1/2的上调,EZR的下调均被恢复。通过siRNA的干扰,抑制了KISS1基因表达,从而引起SUNE-1-5-8F细胞的迁移和侵袭能力的增加。结论:过表达KISS1基因可以显著抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力;同时,通过siRNA干扰KISS1基因的表达,能够增加鼻咽癌细胞的迁移能力。KISS1及KISS1-R基因通过磷酸化激活ERK1/2通路,进一步激活p-FAK并抑制EZR表达,从而抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力。     

C5a激活Akt1⁃ERK1/2通路促进NSCLC细胞的增殖和迁移

目的：探讨C5a对非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer,NSCLC）细胞增殖和迁移的影响及其潜在的分子机制。方法：RT?PCR和Western blot检测人正常支气管上皮细胞系BEAS?2B和3种NSCLC细胞系（H1703、PC9、H1299）中C5a受体（C5aR）的表达;CCK?8和划痕实验检测C5a对PC9细胞增殖和迁移的影响;Western blot检查C5a刺激PC9细胞后蛋白激酶Akt1、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal?regulated kinase,ERK1/2）和蛋白激酶C?α（protein kinase C?α,PKC?α）表达及磷酸化水平;用Akt1抑制剂Perifosine和ERK1/2抑制剂U0126分别处理PC9细胞后再给予C5a刺激,Western blot检测Akt1和ERK1/2的表达和磷酸化及其上下游调控关系,CCK?8和划痕实验检测Perifosine和U0126对细胞增殖和迁移的影响。结果：PC9细胞C5aR的表达水平显著高于其他细胞;C5a可明显促进PC9细胞的增殖和迁移能力;C5a刺激PC9细胞后,可显著增强Akt1和ERK1/2的磷酸化;Akt1和ERK1/2抑制剂均能明显降低C5a刺激PC9细胞后引起的细胞增殖和迁移,且Akt1抑制剂不仅能减弱Akt1的磷酸化,还能减弱ERK1/2的磷酸化,而ERK1/2抑制剂则仅能阻断其自身的磷酸化。结论：C5a刺激NSCLC细胞后可能通过激活Akt1?ERK1/2通路促进细胞的增殖和迁移。     

PTEN基因表达改变对人气道平滑肌迁移的影响

目的通过腺病毒载体体外转染人气道平滑肌细胞(HASMC),使肿瘤抑制基因PTEN过表达和RNA干扰表达,观察其对HASMC迁移的影响,并探讨其作用机制。方法利用携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-GFP-PTEN)和针对PTEN基因的腺病毒短发夹状RNA(shRNA)载体(Ad-GFP-shRNA-PTEN)转染HASMC细胞,并以感染空载腺病毒Ad-GFP和空白组(DMEM)作为对照,用流式细胞计数确立最佳转染复数后,通过Transwell趋化小室和细胞划痕实验检测HASMC跨膜迁移能力和横向迁移能力的变化。Western blotting检测PTEN蛋白的表达和AKT、ERK1/2通路的活化情况,并加入两通路的抑制剂作为阳性对照。结果腺病毒搭载的PTEN基因过表达和干扰载体能成功改变PTEN基因的表达。上调PTEN表达能显著抑制HASMC迁移;蛋白水平上抑制PI3K/AKT通路,而MAPK/ERK通路未见变化。下调PTEN表达不能明显促进HASMC迁移;但在蛋白水平能使PI3K/AKT通路激活,而MAPK/ERK通路却受到抑制。结论上调PTEN表达能有效抑制HASMC的迁移,可能主要是通过抑制PI3K/AKT通路起作用。     

肿瘤抑制基因PTEN对人气道平滑肌细胞迁移和增殖的影响

目的观察肿瘤抑制基因PTEN对人气道平滑肌细胞(HASMCs)迁移和增殖的影响机制。方法用重组PTEN腺病毒转染体外培养的HASMCs(Ad-PTEN组),并与携带绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒空载体(Ad-GFP组)和空白对照(MOCK)组对比,采用MTS测定细胞增殖、Transwell法观察细胞迁移、共聚焦显微镜观测细胞骨架的变化、免疫印迹法检测PTEN、p-Akt、Akt、p-FAK、FAK蛋白的表达。结果 Ad-PTEN组的吸光度(A)值和每单位面积迁移的细胞数显著低于Ad-GFP及MOCK组(均P<0.05),Ad-GFP和MOCK两对照组间差异无统计学意义(P>0.05),提示过表达PTEN基因能抑制HASMCs的增殖和迁移的作用。Ad-PTEN组细胞轮廓变细,伪足及应力纤维明显变少,而Ad-GFP、MOCK组细胞有少量短而细的应力纤维,很少丝状伪足形成。与AdGFP及MOCK组比较,Ad-PTEN组p-Akt表达水平和FAK蛋白的磷酸化水平显著下调(均P<0.05),Ad-GFP及MOCK两对照组间差异无统计学意义(P>0.05),说明过表达PTEN能下调Akt蛋白和FAK蛋白的磷酸化水平。结论过表达PTEN可能通过下调p-Akt及p-FAK的表达,抑制HASMCs的增殖和迁移,参与哮喘气道重塑的调控。     

小鼠B7-H4重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用AdEasyTM XL system构建携带小鼠B 7-H4基因的重组腺病毒,并鉴定其生物学活性.方法:以RT-PCR方法从C5 7小鼠肺组织中扩增B7-H4全长基因并克隆到T载体,然后测序鉴定.经Xhol Ⅰ和EcoR Ⅴ双 酶切后接入pshuttle-CMV穿梭载体(简称PSC),构建重组腺病毒的穿梭质粒PSC-mB7-H4 ,并电转化至BJ5183-AD-1感受态细菌,经筛选获得携带mB7-H4的重组腺病毒的质粒pmB7 -H4/Ad.将此质粒转化人胚肾细胞(AD-293)产生复制缺陷的重组腺病毒mB7-H4/Ad .以RT-PCR及Western blot方法检测被mB7-H4/Ad感染的AD-293细胞中B7-H4 mRNA和蛋 白的表达,并观察重组腺病毒感染的小鼠成纤维细胞(L929)对T细胞增殖和细胞因子表达的影响. 结果:获得序列准确的mB7-H4基因并成功构建重组腺病毒表达质 粒,转化AD-293细胞获得重组腺病毒;细胞生物学实验证实,该重组腺病毒具有抑制CD3单抗诱导的T淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌. 结论:成功构建具有免疫抑制功能的mB7-H4重组腺病毒.     

腺病毒介导p55γ基因N末端的过表达对胃癌细胞增殖的影响

目的：通过腺病毒介导,研究磷脂酰肌醇3-激酶p55γ调节亚基N末端24个氨基酸的过表达对胃癌MGC803细胞生长增殖的影响。方法：在HEK293细胞中扩增重组腺病毒Ad—N24-GFP以及空载体病毒Ad—GFP,并进行病毒滴度以及腺病毒对胃癌细胞感染率的测定,免疫印迹方法鉴定重组腺病毒感染MGC803细胞后融合蛋白N24-GFP的表达。通过细胞生长曲线和克隆形成实验观察Ad—N24-GFP对细胞增殖的影响。结果：重组腺病毒经过感染HEK293细胞后大量扩增,病毒滴度测定为1．0&#215;10^10pfu／ml,重组腺病毒对MGC803细胞的感染率在感染复数（MOI）为100时最强。与空载体细胞相比较,N24-GFP的高表达明显抑制MGC803细胞的生长,且抑制程度随病毒感染复数的增加呈逐渐增强的趋势;感染Ad—N24-GFP组细胞的克隆形成率[（28．30&#177;3．25）％]明显低于对照组细胞[（42．16&#177;2．84）％,P〈0．05]。结论：腺病毒介导N24p55γ基因的过表达能抑制胃癌细胞MGC803的增殖,其在胃癌基因治疗上可能具有潜在的应用前景。     

Runx3对人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制

目的探讨Runt域转录因子3（Runx3）对人骨肉瘤细胞143B细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法构建Ruxn3的RNA干扰（Ad-siRunx3）和过表达Runx3（Ad-Runx3）的重组腺病毒质粒;MTT和克隆形成实验检测143B细胞的增殖;划痕实验和Transwell小室实验分别检测143B细胞的迁移和侵袭;RT-qPCR和Western blot检测上皮-间质转化（EMT）关键分子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的表达;Western blot检测PI3K/AKT和丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路关键分子的表达。结果下调Runx3表达可促进143B细胞的增殖、迁移和侵袭,增强N-cadherin、Vimentin和Snail表达,但抑制E-cadherin表达;过表达Runx3则可抑制143B细胞增殖、迁移和侵袭,抑制N-cadherin、Vimentin和Snail表达,但促进E-cadherin表达;同时,下调Runx3表达可增加AKT、p38和ERK1/2磷酸化水平,而过表达Runx3则能够降低AKT、p38和ERK1/2的磷酸化水平。结论 Runx3能抑制143B细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制可能与Runx3阻止EMT进程、抑制AKT信号以及p38和ERK1/2 MAPKs信号途径有关。     

重组人内皮抑素腺病毒对人脐静脉内皮细胞系的影响

目的 探讨重组人内皮抑素腺病毒(Ad-hEndo)感染人脐静脉内皮细胞(ECV-304)后,对细胞生长状态及生理功能的影响.方法 重组人内皮抑素腺病毒Ad-hEndo感染ECV-304细胞,western blot测定hEndostatin蛋白表达情况,流式细胞术检测Ad-hEndo引起ECV-304细胞凋亡情况,并绘制各组细胞生长曲线.结果 与对照组相比,病毒感染48 h后检测到明显的hEndostatin蛋白表达,Ad-hEndo在感染3 d后出现ECV-304细胞凋亡,且ECV-304细胞在Ad-hEndo感染后生长受到明显限制.结论 Ad-hEndo感染的ECV-304细胞能有效表达hEndostatin,hEndostatin能诱导ECV-304细胞发生细胞凋亡且明显抑制其生长增殖.     

重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP的构建及其对UT-7/Epo细胞感染效率的检测

目的构建携带报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,并且研究该病毒对人白血病细胞UT-7/Epo的感染效率及其在细胞中的复制。方法先通过分子克隆技术构建重组腺病毒质粒pAd5F11pTPEGFP,然后利用脂质体转染法,将其转染至HEK293细胞包装出重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,经酶切和PCR鉴定正确后,扩增并纯化得到滴度较高的重组腺病毒。以空载体病毒Ad5GFP作为对照,将纯化的重组腺病毒感染UT-7/Epo细胞,经流式细胞仪检测在不同感染复数(MOI)下荧光阳性细胞比例,即为Ad5F11pTPEGFP病毒对UT-7/Epo细胞的感染效率,同时将冻融后的重组腺病毒感染的UT-7/Epo细胞上清感染HEK293细胞,48 h后观察GFP在HEK293细胞中的表达。结果成功制备了重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞的感染效率明显高于空载体对照病毒Ad5GFP,在MOI为200时,感染效率达98.2%,而空载体病毒在MOI为200时,对UT-7/Epo细胞的感染效率仅为29.7%。感染了重组腺病毒的UT-7/Epo细胞冻融上清感染新的HEK293细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞有较高的感染效率,并能在其中复制。     

携SH2-Caspase8融合基因重组腺病毒的构建及对K562细胞增殖的影响

目的构建并鉴定携SH2 -Caspase8融合基因的重组腺病毒AdE-SC-EGFP及其突变体,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法采用RT-PCR、重叠PCR扩增SH2-Caspase8融合基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-SC-EGFP,进行酶切和测序鉴定。将PmeⅠ酶...     

Noggin蛋白对MCF-7细胞增殖、侵袭能力的影响

目的观察Noggin蛋白对乳腺癌细胞MCF-7增殖、侵袭能力的影响。方法以Noggin重组腺病毒感染乳腺癌细胞株MCF-7,MTT法检测Noggin对MCF-7细胞增殖能力的影响,划痕修复实验及Transwell细胞侵袭实验检测其运动和侵袭能力的改变,Real-time PCR和Western blot检测CXCR4和MMP1基因的表达改变。结果过表达Noggin蛋白的MCF-7细胞增殖能力增强(P<0.05);划痕修复实验提示过表达Noggin蛋白的MCF-7细胞划痕愈合延迟;Transwell细胞侵袭实验提示与空病毒组相比,Noggin组穿膜细胞数显著降低(55±4 vs 25±3,P<0.05)。RT-PCR和Western blot结果:过表达Noggin后,MCF-7细胞中CXCR4和MMP1基因表达下调。结论 Noggin蛋白可抑制乳腺癌细胞MCF-7的运动和迁移,可能与下调CXCR4和MMP1基因的表达相关。     

重组腺病毒载体介导结缔组织生长因子对人腴腺癌细胞系的抑制作用

目的:研究结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)对人胰腺癌细胞(Pancreatic cancer cell-1,PANC-1)生长的影响.方法:采用重组腺病毒介导CTGF(Recombinant adenodrus mediated CTGF,rAd-CTGF)感...     

特异性溶瘤重组腺病毒KH901的体外特异性抗肿瘤作用研究

目的 研究特异性溶瘤重组腺病毒KH901在体外培养的人肿瘤细胞中的选择性复制和杀伤作用.方法 以感染复数(MOI)=2 PPC的KH901和野生型腺病毒(Ad5)感染人肿瘤和正常细胞,72 h后采用病毒滴定法测定病毒滴度;以MOI＝10 PPC和1 PPC的KH901感染人肿瘤和正常细胞,24 h后通过ELISA法和TF-1依赖细胞株/MTT比色法测定粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的免疫活性和生物活性;以MOI分别为0、0.1、1、10、100、1000 PPC的KH901和野生型Ad5感染人肿瘤和正常细胞,采用MTT法测定各细胞活力,计算半数药物有效浓度(EC50).结果 野生型Ad5在正常细胞和肿瘤细胞中均大量复制,均表现出明显的杀伤作用;KH901在肿瘤细胞中大量复制[(2526.4±136.8)～(2796.6±104.6) TCID50/cell],表达大量的人GM-CSF[(1177.793±6.62)～(3924.497±17.79) IU/(106细胞·24 h)],并显示出明显的杀伤作用[EC50为(0.31±0.06)～(0.19±0.01) pfu/cell],在正常细胞中KH901复制较差[(56.8±9.2)～(90.1±14.4) TCID50/cell],只有少量的GM-CSF产生[(13.397±0.82) IU/(106细胞·24 h)],杀伤作用轻微[EC50为(92.33±9.12)～(121.20±19.94) pfu/cell],两者间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 KH901具有肿瘤选择性复制和杀伤作用,并能表达具有生物活性的GM-CSF,显示出治疗实质性肿瘤的潜力.     

端粒酶逆转录酶启动子调控的肿瘤增殖腺病毒CNHK300对肝癌细胞的杀伤作用

目的观察端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的肿瘤增殖腺病毒CNHK300对肝癌细胞的杀伤作用。方法采用Western印迹检测了腺病毒E1A在细胞中的表达;通过病毒增殖实验和细胞生长抑制实验,验证CNHK300选择性复制和杀伤能力,并与ONYX-015(E1B55000蛋白缺失的2型和5型嵌和型腺病毒)和wtAd5(野生型腺病毒)进行比较;用携带绿色荧光蛋白的CNHK300-EGFP感染BJ和Hep3B,直观的观察其增殖过程。结果CNHK300病毒48h在Hep3B和HepGⅡ中的增殖倍数分别为40625和65326倍,与wtAd5增殖能力相近,较ONYX-015强几倍至十几倍。在BJ正常成纤维细胞中CNHK300病毒增殖能力减弱,CNHK300病毒48h增殖倍数为180倍,而wtAd5增殖能力仍可高达4000倍。CNHK300在MOI 0．5集落形成单位／细胞以下就可以有效地杀伤肝癌细胞,MOI 0．002集落形成单位／细胞时就可以杀伤半数Uep3B细胞,较ONYX-015具有更强的肿瘤杀伤能力。CNHK300对正常成纤维细胞的杀伤力明显弱于wtAd5,CNHK300在MOI100集落形成单位／细胞时BJ细胞存活率近50％。结论肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK300可选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中复制,并产生溶瘤作用,在正常细胞中复制能力和杀伤能力明显减弱,且无论选择性和杀伤能力均优于ONYX-015。     

人p27~(kipl)可调控性重组腺病毒载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的:体外构建人p27kipl可调控性重组腺病毒载体,并观察其在前列腺癌细胞系PC-3细胞中的表达及其对细胞生长的影响。方法:采用Ad-X Tet-Off表达系统,将人全长p27kipl cDNA经过穿梭载体,与可调控性腺病毒载体骨架连接,得到重组人p27kipl基因腺病毒(Ad-p27kipl),在HEK293细胞包装、扩增,获得高滴度病毒,采用空斑试验测定病毒滴度,体外转染PC-3细胞,RT-PCR、Western杂交分别检测目的基因不同水平的表达,并通过MTT法观察转染前后细胞增殖力的变化。Ad-X-TRE-β gal病毒作为对照。结果:构建的Ad-p27kipl病毒滴度为1.2×109 pfu/ml,RT-PCR、Western杂交检测有特异的高表达,转染后对细胞的生长有抑制作用。结论:体外连接法成功地构建携带人p27kipl基因的可调控性重组腺病毒载体,在人前列腺癌细胞系PC-3中有高表达并对细胞生长有抑制作用。     

人碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast cell growth factor,bFGF)腺病毒载体,并观察其在体外血管内皮细胞中的表达.方法:采用同源重组的方法,构建重组腺病毒Ad5-bFGF.携有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的Ad5腺病毒转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),检测最佳转染复数.Ad5-bFGF体外转染HUVEC,免疫细胞化学法、Western印迹法检测bFGF蛋白的表达.结果:Ad5转染HUVEC的最佳转染复数为200,转染率为90%.免疫细胞化学法和Western印迹结果显示bFGF基因以Ad5为载体可以在HUVEC的胞质和胞核表达,并且表达量较未转染的HUVEC明显增加.结论:成功构建了携带bFGF基因的腺病毒载体,体外可以成功表达,为bFGF基因治疗及肿瘤发病机制的研究奠定了基础.     

携带野生型PTEN基因的重组腺病毒治疗子宫内膜癌的体外研究

目的:观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)体外转染子宫内膜癌细胞后的表达,并探讨其对肿瘤细胞产生抑制增殖、诱导凋亡的作用及机制.方法:细菌内同源重组方法构建Ad-PTEN,体外转染PTEN基因突变的子宫内膜腺癌RL95-2细胞中,X-gal染色检测转染效率.应用RT-PCR、Western印迹、细胞免疫组化检测Ad-PTEN在RL95-2细胞中的转录及表达; 应用细胞计数、MTT实验, 观察Ad-PTEN对RL95-2细胞生长的影响;应用光镜、透射电镜观察外源性PTEN基因表达对RL95-2细胞形态学及超微结构的影响;应用流式细胞分析仪(FCM)检测Ad-PTEN对RL95-2细胞周期分布的影响、凋亡诱导作用及半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶casapase-3的激活.结果:外源性野生型PTEN基因经腺病毒介导成功转入RL95-2细胞,3种方法均检测出有PTEN mRNA及PTEN蛋白的表达,当感染复数(MOI)为50时,体外转染效率达到100%.Ad-PTEN显著抑制RL95-2细胞生长并诱导其凋亡.此外, Ad-PTEN还能诱导RL95-2细胞周期G0/G1期阻滞以及caspase-3的激活.结论:重组腺病毒Ad-PTEN是高效的基因转移系统,能将PTEN目的基因转移到丧失该基因功能的子宫内膜癌RL95-2细胞中,对RL95-2细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用,其机制可能包括细胞周期G0/G1阻滞及caspase-3 蛋白酶的激活.     

泛素在高糖诱导的血管内皮细胞凋亡中的表达

目的检测高浓度葡萄糖对血管内皮细胞凋亡的影响和泛素表达的变化.方法ECV-304细胞在高糖(25 mmol/L)和正常糖浓度(5.5 mmol/L)DMEM培养液中分别培养24、48、72 h,用MTT法检测细胞活力,用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡特异性的DNA片段,并用Northern blot检测泛素mRNA的变化.结果高糖24、48、72 h组细胞OD值比正常浓度组均显著下降(P＜0.05);1.8%琼脂糖凝胶电泳在高糖48、72 h组检测到细胞凋亡特异性DNA片段;泛素mRNA在高糖24、48、72 h组分别增加25.37%、53.47%和63.93%(P＜0.05).结论高浓度葡萄糖可增加血管内皮细胞凋亡,泛素mRNA在高糖诱导的内皮细胞凋亡中表达上调,且发生在凋亡形态学改变之前,泛素参与调节高血糖诱导的细胞凋亡.