抗坏血酸联合胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究

目的 研究抗坏血酸(AA)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.方法 从新生24h内的sD大鼠脑组织分离和培养神经干细胞,进行神经干细胞鉴定.第二代神经干细胞诱导培养基中分别给予AA或(和)GDNF,10d后终止诱导,进行DA能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运蛋白的免疫细胞化学检测和TH基因的RT-PCR检测.结果 各诱导组均检测到TH mRNA的表达;与对照组比较,AA及GDNF均能增加NSC向TH阳性细胞分化的比率(P<0.05);与单独运用100μmol/LAA或10ng/mlGDNF组比较,联合诱导组可明显提高NSCs向TH阳性细胞分化的比率(P<0.05).结论 AA和GDNF均能促进NSCs向DA能神经元分化,两者联合诱导后分化作用得到进一步加强.     

低氧联合GDNF诱导大鼠神经干细胞分化为TH阳性神经元的实验研究

目的本试验在低氧环境下利用胶质源性神经营养因子(GDNF)对大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)进行定向诱导分化,从而研究低氧对NSCs向多巴胺能神经元分化的影响,并获得相当数量的多巴胺能细胞,为下一步的细胞移植奠定基础。方法分离培养孕14 d～16 d Wistar大鼠胚胎皮质NSCs,通过传代培养获得单克隆生长的NSCs,在不同氧浓度下利用GDNF对大鼠NSCs进行定向诱导分化,通过免疫细胞化学方法检测TH阳性细胞表达。结果低氧可明显促进NSCs向TH阳性神经元分化,与常氧对照组比较有显著差异(P 0.01),且在3%低氧浓度时,NSCs向TH阳性神经元分化率最高。结论低氧可促进NSCs向TH阳性神经元分化,3%低氧浓度是促进NSCs向TH阳性神经元分化的最适氧浓度,低氧促进NSCs向TH阳性神经元分化的分化率与氧浓度梯度无依赖关系,低氧联合GDNF诱导NSCs分化为TH阳性神经元,诱导效能更为显著。     

外源性Ang Ⅱ诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究

目的在体外成功分离培养并扩增神经干细胞（NSCs）的基础上,研究外源性血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）对NSCs向多巴胺（DA）能神经元分化的影响。方法（1）分离培养新生1d SD大鼠脑组织NSCs,免疫细胞学方法测定NSCs特异性标志物神经上皮干细胞蛋白（Nestin）表达及其分化为神经元、神经胶质细胞的能力;（2）按培养液中Ang Ⅱ的浓度不同,分5个浓度（100、200、400、600、800nmol/L）对第二代NSCs进行诱导分化。10d后采用免疫细胞学方法检测DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶（TH）和神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,半定量RT-PCR（SQ-PCR）测定分化细胞中TH mRNA的相对表达量。结果外源性Ang Ⅱ诱导提高NSCs向TH阳性细胞分化的比率,TH mRNA相对表达量亦增加,以Ang Ⅱ浓度为400nmol/L及600nmol/L的诱导效果最明显,TH阳性细胞率分别为10.77%和11.34%,TH mRNA相对表达量分别为（0.4023±0.0515）和（0.3971±0.0319）,两组间比较无统计学意义（P〉0.05）;其中400nmol/L Ang Ⅱ组分化细胞中GFAP阳性细胞率高于对照组,有统计学意义（P〈0.05）。结论外源性AngⅡ促进NSCs向DA能神经元分化,在400～600nmol/L浓度范围内AngⅡ的诱导效能更显著;AngⅡ促进NSCs向DA能神经元分化的机制可能与同时促进星型胶质细胞（AS）分化有关。     

肝细胞生长因子对神经干细胞分化的影响

目的体外培养获得神经干细胞并初步研究重组人肝细胞生长因子(human recombinant hepatocyte growth factor,HGF)对神经干细胞(neutal steal cells,NSCs)分化能力的影响。方法从胚胎大鼠脑组织中分离得到神经干细胞,并行免疫荧光鉴定。检测不同浓度的HGF(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml)对神经干细胞分化的影响。结果体外培养的神经干细胞球巢蛋白(nestin)表达阳性,由神经干细胞球分化的细胞神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(galial fibrillary acidic protein,GFAP)表达阳性。并且不同浓度HGF作用下的神经元细胞分化率不同。结论HGF对NSCs分化及较长时间存活具有重要作用,20ng/ml的HGF可以促进较好的分化效果。     

GFP-Nurr1基因修饰神经干细胞的建立及过表达Nurr1对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响

目的利用慢病毒载体建立GFP-Nurr1基因修饰的原代神经干细胞(NSCs)模型并观察Nurr1过表达后NSCs向多巴胺神经元的分化影响。方法利用基因重组构建pLenO-DCE-Nurr1慢病毒载体,用慢病毒转染第三代NSCs,转染72 h后荧光检测转染效果;设置空白对照组、空载体组及DCE-Nurr1组,分别用Western blot及PCR检测Nurr1的表达差异;并将转染后的NSCs分化培养7 d后分别用免疫细胞化学检测、Western blot及PCR检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果慢病毒转染NSCs 72 h后,转染率可达90%,与对照组相比DCE-Nurr1组高表达Nurr1。经慢病毒载体感染后的NSCs仍具备分化潜能,分化培养后发现DCE-Nurr1组分化的神经细胞中TH阳性细胞分化率90.60%,对照组为21.2%。结论慢病毒载体可高效转染NSCs过表达Nurr1;Nurr1基因过表达可以促进中脑腹侧来源NSCs向TH阳性多巴胺能神经元方向分化。     

体外三步法诱导胚胎干细胞定向生成神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的方法。方法 模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境，以脑星形胶质细胞为支持细胞，用全反式维甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)等分三阶段诱导ESCs定向生成NSCs。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定；形态学观察结合免疫组织化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志OCT-4和神经干细胞标志Nestin蛋白和(或)基因表达对诱导全过程进行动态监测；NSCs分化试验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测。结果(1)体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养，仍保持向三胚层分化的能力；(2)随着诱导的进行，OCT-4表达逐渐减弱并消失，而Nestin表达逐渐增强，经三步法最终可诱导形成纯度高达90％以上的Nestin阳性细胞；(3)所诱导生成的细胞在NSCs选择性培养基中反复传代，仍表现为Nestin阳性和具有生成神经球的能力，在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞。结论采用星形胶质细胞作为诱导基质，模拟体内神经分化过程的三步诱导法，可诱导ESCs生成较高纯度的NSCs，并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力。     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

pEGFP-C2基因因转染恒河猴骨髓源神经干细胞的实验研究

目的 探讨恒河猴骨髓基质源神经干细胞进行基因修饰的可行性。方法 分离恒河猴骨髓基质细胞(BMSCs)，体外培养，bFGF诱导增殖，细胞生长至神经干细胞期时以Nucleofector^TM核转染仪行pEGFP—C2转染，倒置荧光显微镜观察基因表达情况，并检测细胞的活力。另外，对同期培养的未转染细胞进行神经干细胞特异性抗原-nestin和CD133抗原的免疫细胞化学检测。结果 分离得到的BMSCs能在体外培养液中进行增殖和分化．而在bFGF诱导的情况下．细胞的增殖更为明显；转染pEGFP—C2的细胞于转染后24h后即表达强绿色荧光蛋白，转染率达30％以上，且细胞的活力基本不受影响；免疫细胞化学检测可见有nestin和CD133抗原在同期培养的未转染细胞内表达。结论 灵长类骨髓基质细胞具有向神经干细胞分化、增殖的能力，bFGF能促进细胞的增殖，在神经干细胞培养条件下，可发育分化成神经干细胞；在神经干细胞阶段，应用电转染技术进行神经干细胞基因修饰是可行的，可应用于骨髓基质源神经干细胞的基因治疗领域。     

bFGF、BMP-2、ATRA对神经干细胞分化及RARαmRNA表达的影响

目的探讨bFGF、ATRA、BMP-2对神经干细胞分化的诱导作用及对RARα mRNA表达的影响。方法采用分别含bFGF、ATRA、BMP-2及其不同组合配方的培养液培养神经干细胞，通过免疫荧光染色观测细胞分化情况，应用RT—PCR法检测其对RARα mRNA表达影响。结果bFGF无明显诱导神经干细胞分化作用，但能增加分化后细胞的存活能力；神经干细胞能被ATRA诱导成为神经元样细胞，被BMP-2诱导成为星形胶质细胞，且在不同组合配方培养液中，诱导效应不同；ATRA或BMP-2在bFGF存在的情况下，能促进神经干细胞RARα mRNA的表达。结论bFGF本身不诱导RARα mRNA的表达，但能增强神经干细胞分化后的存活并影响ATRA、BMP-2对RARα mRNA表达的诱导；ATRA、BMP-2对神经干细胞的分化具诱导功能，但二者可能具有负协同作用。     

不同浓度胰岛素对小鼠神经干细胞分化的影响

目的 体外培养获得神经干细胞并初步探讨不同浓度胰岛素对神经干细胞分化能力的影响。方法 小鼠胎脑细胞体外培养获得神经干细胞,并行免疫荧光检测鉴定。25ng／ml、50ng／ml、100ng／ml、125ng／ml、150ng／ml胰岛素诱导分化后,免疫荧光染色观察不同浓度胰岛素对神经干细胞分化的影响。结果 体外培养的神经球表达巢蛋白（nestin）,神经球分化的细胞表达神经丝和胶质纤维酸性蛋白。不同浓度胰岛素作用下的神经元分化率有差别。其中100ng／ml组的分化率最高。结论 体外培养的细胞为神经干细胞,100ng／ml浓度的胰岛素可以起到较好的促进神经元分化的效果。     

TH基因修饰的神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的 探讨TH基因修饰的神经干细胞脑内移植对帕金森病(PD)的治疗作用。方法 构建pN：ATH逆转录病毒载体质粒，用PA317细胞包装，G418筛选阳性克隆，病毒上清感染神经干细胞，将表达TH的神经干细胞植入：PD大鼠纹状体内，测定：PD大鼠旋转行为改善，DA和DOPAC含量变化，以及TH在纹状体的表达。结果 TH基因修饰的神经干细胞移植8周时能显著降低PD大鼠旋转行为，增加纹状体DA和DOPAC含量，TH在纹状体内的表达增加，疗效好于单纯神经干细胞移植组。结论 TH基因修饰的神经干细胞移植对PD大鼠有明显的治疗作用，可望为PD治疗提供新的途径。     

基因修饰的神经干细胞脑内移植后TH表达和神经递质的变化

目的：探讨经TH基因修饰的神经干细胞脑内移植后，PD模型动物脑内TH表达和神经递质的变化。方法：构建pN2ATH逆转录病毒载体质粒，用PA317细胞包装，G418筛选阳性克隆，病毒上清感染神经干细胞，将神经干细胞和表达TH的神经干细胞植入PD大鼠纹状体内，观察移植后TH的表达情况以及DA和DOPAC含量变化。结果：TH基因修饰的神经干细胞移植2月内，TH在纹状体内的表达增加，纹状体DA和DOPAC含量增高，好于单纯神经干细胞移植组和对照组，但比正常水平低，结论：TH基因修饰的神经干细胞，脑内移植能增加纹状体内TH的表达以及DA和DOPAC含量，为其脑内移植治疗PD提供了理论基础。     

不同促细胞分裂因子对人神经干细胞定向分化的影响

目的观察不同促细胞分裂因子对人神经干细胞(NSCs)增殖及定向分化的影响。方法对人NSCs用无血清DMEM培养基行原代培养的同时,分别加入表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、维甲酸(RA)等因子,观察其对NSCs定向分化的作用。结果EGF培养的NSCs,克隆球形成慢且较松散,经血清诱导分化后,主要为星形胶质细胞,仅有少数神经元。而bFGF培养的NSCs则生长良好。在加血清诱导分化后,不同浓度bFGF培养的NSCs分化的细胞不同。bFGF与EGF共同培养的NSCs,其生长及神经球形成良好。在加血清诱导分化后,分化的神经细胞比例更接近脑内神经细胞的组分。NGF对神经球的形成无明显影响,但可促使其向神经元分化。RA使神经克隆球形成,可使NSCs直接分化为神经元细胞的比例明显增加。结论不同促细胞分裂因子对人NSCs的增殖及定向分化均有一定影响。     

bFGF and heparin but not laminin are necessary factors in the mediums that affect NSCs differentiation into cholinergic neurons

OBJECTIVES: Neural stem cells (NSCs) are self-renewed, pluripotent cells that can differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Cholinergic neurons are an important kind of neurons that play an essential role in the treatment of Parkinsonism and epilepsy. We are interested in how different mediums affect NSCs differentiation into cholinergic neurons. METHODS: NSCs were isolated from the striatum corpora of embryonic brain in a 14-day pregnant rat. Cells were cultured in basic mediums [F12/DMEM (1:1) including 1% B27 (v/v) and 20 ng/ml EGF] but with different combinations of three supplements: bFGF (20 ng/ml), heparin (5 mug/ml) and laminin (1 mug/ml). After 7 days culturing, cells were immunized with choline acetyltransferase (ChAT), a marker enzyme of cholinergic neuron. RESULTS: We found ChAT could not be detected in the basic mediums with only one supplement. Then, we tested the combination of two out of three. We found that ChAT positive cells could only be detected in the medium with bFGF and heparin (FH). However, when we added the laminin into the FH, more ChAT positive cells appeared. DISCUSSION: This finding suggests that bFGF and heparin are essential in the mediums that affect NSCs differentiation into cholinergic neurons, and laminin is an important positive factor in this process.     

胚鼠室管膜神经干细胞体外诱导分化实验研究

目的探寻胚鼠室管膜分离培养及诱导分化为神经干细胞(NSCs)的可行性及规律性,为进一步寻找非神经组织性NSCs种子源提供阳性参照。方法将分离的胚脑室管膜组织以神经干细胞培养液孵育,确定神经干细胞的最佳体外生存环境,细胞培养所涉及的细胞因子主要有:EGF、bFGF和LIF(分别为20 ng/ml)。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖;以镜下细胞形态初步判断神经干细胞分化。结果胚鼠室管膜源性神经干细胞在相应培养条件下呈现出神经干细胞快速增殖,形成由多细胞组成的细胞球(神经球);进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快变成岛屿状神经球。神经干细胞连续培养可进一步有小芽形成并发育成突起状结构、建立神经纤维联系,其中有的胞体增大,逐渐发育为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网。结论由胚鼠室管膜分离培养神经干细胞是可行的;神经干细胞在发育分化过程,基本上遵循着游离神经干细胞、神经细胞球、分化神经元/胶质细胞的生长规律,显现出神经干细胞有别于一般神经细胞的增殖及多分化特性。     

Nurr1对小胶质细胞联合神经干细胞共培养促进神经干细胞向多巴胺神经元分化作用研究

目的探讨联合过表达核受体相关因子1(Nurr1)基因的小胶质细胞(MG)和神经干细胞(NSC)共培养对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响。方法原代培养SD大鼠神经干细胞和小胶质细胞,并过表达Nurr1基因。CCK-8法检测Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率的影响。Transwell系统共培养神经干细胞和小胶质细胞,实验分为NSC组、NSC+MG组和N(NSC+MG)组。ELISA检测共培养后第3天、第6天和第9天各组脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板源性神经营养因子(PDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达变化;RT-PCR和Western Blot检测各组第9天酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)DAT和Nurr1的表达变化;细胞免疫荧光鉴定神经干细胞的分化,并对TH和DAT阳性细胞计数,计算各组神经干细胞向多巴胺神经元的分化效率。结果原代培养小胶质细胞以及神经干细胞并成功过表达Nurr1基因。CCK-8法检测结果表明,Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率无明显影响。ELISA检测结果表明,N(NSC+MG)组在不同时间点神经营养因子(BDNF、PDNF和GDNF)表达量明显高于其他各组(P0.05)。RT-PCR和Westen Blot检测结果表明,N(NSC+MG)组TH、DAT和Nurr1的表达水平明显高于其他各组(P0.05)。细胞免疫荧光鉴定结果表明,N(NSC+MG)组TH阳性细胞率明显高于其他各组(P0.05)。结论Nurr1基因可促进神经干细胞和小胶质细胞共培养系统神经营养因子的分泌。过表达Nurr1基因的神经干细胞和小胶质细胞共培养可促进神经干细胞向多巴胺神经元的分化。     

胚胎大鼠嗅神经干细胞的培养及分化特性

目的建立胚胎大鼠嗅神经干细胞(NSCs)体外培养方法,研究其增殖和分化特性.方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养胚胎14 d(E14)大鼠嗅球NSCs,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSCs及自然分化为特异性神经细胞的类型,测定NSCs的生长曲线.结果从E14大鼠嗅球分离、培养出表达nestin,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSCs.嗅NSCs的增殖依赖表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF.结论从E14大鼠嗅球培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSCs.     

嗅鞘细胞诱导神经干细胞分化后神经元电生理特性的研究

目的探索大鼠嗅鞘细胞对神经干细胞(NSC)分化的影响,以及分化后神经元电生理特性。方法取新生鼠大脑皮质,原代培养大鼠NSC。NSC分为实验组和对照组,实验组将无血清培养的NSC中加入嗅鞘细胞条件培养液,对照组单纯无血清培养NSC。光镜下观察细胞分化情况,免疫组化法分别检测巢蛋白(nestin)、神经生长因子受体(NGFRp75)、神经丝蛋白(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,膜片钳检测神经元电生理特性。结果实验组嗅鞘细胞主要诱导NSC分化为神经元,少量分化为胶质细胞。对照组NSC逐渐萎缩,最终死亡。分化后的神经元记录到快速激活、快速失活能被河豚毒素特异阻断的钠电流,以及慢激活、慢失活能被四乙铵特异阻断的延迟整流性钾电流。结论嗅鞘细胞能诱导NSC分化成神经元,分化后的神经元具有活跃的电生理特性。     

碱性成纤维细胞生长因子预诱导对骨髓基质干细胞向多巴胺能神经元分化的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导对骨髓基质干细胞（MSCs）向多巴胺（DA）能神经元分化的影响。方法取雄性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,进行MSCs的体外培养、传代扩增及纯化。bFGF预诱导24h后,依据加入的神经营养因子不同分为单唾液酸四己糖神经节苷脂（GMl）组、胶质源性神经营养因子（GDNF）组和GDNF＋GMl组,以及对照组。倒置显微镜下观察细胞形态变化,分别在预诱导第3d、7d进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）、酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学检测。计数NSE和TH阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比。结果对照组见少量NSE阳性细胞。实验组于诱导第3d、7d见较多数量的NSE、TH阳性细胞,GFAP阴性。bFGF预诱导各组中GDNF＋GMl组NSE、TH阳性细胞率最高,GDNF组次之,GMl组最低,组间比较差异有统计学意义（均P〈0．01）。结论bF—GF预诱导不仅可明显促进GDNF、GMl诱导MSCs向神经元样细胞分化,表达神经元细胞标志物——NSE;还可促进MSCs向DA能神经元分化,表达DA能神经元标志物——TH。     

脑源性神经生长因子基因转染对脊髓神经干细胞分化的影响

目的 研究BDNF基因转染小鼠脊髓源性NSCs向神经元分化情况.方法 选取体外培养E14小鼠胚胎脊髓来源NSCs,构建整合有BDNF基因的逆转录病毒载体,感染体外培养的NSCs,诱导其向神经元分化.采用免疫细胞化学方法鉴定,确定NSCs的分化比例.结果 转染后诱导分化24 h后可见部分细胞贴壁分化,48 h后转染细胞大部分贴壁.BDNF转染NSCs分化为神经元比例较未转染NSCs明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 逆转录病毒载体介导BDNF基因转染NSCs可促进细胞分化,且分化多为神经元方向.

Abstract：

Objective To study the differentiation potential of mouse spinal cord derived neural stem cells (NSCs) into neurons after being transfected with BDNF gene in vitro. Methods Spinal cord derived NSCs from the E14 fetus mouse were isolated and cultured in vitro; the retrovirus containing pLXSN-BDNF gene was established and transfected into thc above NSCs, and thea, spinal cord derived NSCs were induced to be differentiated into neuron-like cells. Immunohistochemistry was employed to detect and calculate the ratio of differentiation of NSCs into neurons. Results The NSCs cultured in vitro partly adhered to the wall and differentiated within 24 h of transfection with BDNF gene, and most of the NSCs adhered to the wall differentiated within 48 h of transfection. The level of neurons from spinal cord derived NSCs modified by BDNF gene was markedly increased as compared with that that from normal spinal cord derived NSCs (P＜0.05). Conclusion NSCs transfected by retroviral pLXSN-BDNF can promote the cell differentiation. BDNF gene can increase greatly the percentage of neurons in the course of inducing the differentiation of mouse NSCs.