Dicer 1转基因小鼠模型的建立

目的 建立Dicer1转基因小鼠模型.方法 构建pcDNA3.I-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导人BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内.出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基冈表达.结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern榆测6只均为阳性.对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达.对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常.结论 成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础.     

STK15转基因小鼠模型的建立

STK15基因是丝/苏氨酸激酶家族成员之一，其扩增和高表达能引起中心体复制扩增，染色体不稳定性增加，最终导致细胞的恶性转化，从而诱发恶性肿瘤。而且，STK15基因在多种恶性肿瘤组织中都具有高表达。目前，研究者们都是通过取人体不同部位的肿瘤组织来研究STK15基因与恶性肿瘤发生发展的关系，本次实验首次以建立STK15转基因小鼠模型，来进一步研究STK15基因与恶性肿瘤的关系，为今后的基因诊治提供理论基础。实验方法是首先提取人胚肺细胞总RNA作为模版，根据GenBank中STK15基因序列设计一对引物，用RT-PCR技术扩增出1200bp的STK15基因片段，克隆到pTZ57R/T载体，通过测序证实序列的正确性。用BamH1和XbaI双酶切载体pcDNA3.1和pTZ57R/T载体-STK15，然后回收、连接pcDNA3.1-STK15、转化、鉴定，从而成功构建了pcDNA3.1-STK15表达载体。然后对小鼠进行超排获得其原核期胚胎，应用显微注射法进行转基因操作，结果是注射成功率77%（701/907），移植鼠共30只，新生小鼠为106只，PCR检测转基因阳性为3只，经过Southern杂交检测有1只转基因阳性鼠，从而建立了转STK15的转基因小鼠模型。通过建立STK15肿瘤动物模型，找出与人类肿瘤相近的病理生理变化以及控制这些变化的遗传基础，为今后所有的恶性肿瘤的基因诊治提供坚实、有力的理论依据。     

人胰岛素转基因小鼠模型的建立

目的:建立人胰岛素的转基因小鼠模型.方法:通过原核显微注射法,把外源基因pEF1α-mINS注射入FVB种小鼠受精卵,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠获得子代小鼠.结果:移植注射胚胎204枚给38只假孕小鼠共出生108只后代鼠,经PCR和Southern blot检测到5只阳性小鼠.结论:通过显微注射法使外源基因pEF1α-mINS在小鼠基因组中得到整合,建立了人胰岛素的转基因小鼠模型.     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型，并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法，把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中，胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠，经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

瞬时受体电位家族香草醛1型受体转基因小鼠模型的建立

目的 建立瞬时受体电位家族香草醛1型受体(Trpvl)转基因小鼠模型.方法 通过显微注射法把pcDNA3.1-rTrpv1导入C57BL/6J×CBA F1小鼠的受精卵雄原核中并移植到假孕母鼠输卵管内,用PCR方法鉴定子代基因型,用蛋白免疫印迹法检测TRPV1在组织中的表达水平.结果 将400枚注射卵移植到16只假孕母鼠的输卵管中,共出生小鼠120只,获得5只转基因阳性小鼠.其中2只阳性小鼠可稳定传代,经过与C57小鼠回交数次后各自建系.经蛋白免疫印迹法证实,与同窝野生型小鼠相比,转基因小鼠的脑组织和肌肉组织中TRPV1蛋白的表达显著升高.结论 成功建立了Trpv1转基因小鼠模型,为深入研究TRPV1通道的功能提供了更好的条件.     

瞬时受体电位通道家族M8型受体转基因小鼠模型的建立

目的 建立瞬时受体电住通道家族M8型受体(TRPM8)转基因小鼠模型.方法 通过显微注射法将pcDNA3.1-hTrpm8导入C57BL/6J×CBA F1小鼠的受精卵中,并将其移植到假孕母鼠输卵管中获得子代小鼠.采用PCR方法鉴定子代基因型,通过RT-PCR和免疲印迹法检测Trpm8基因及蛋白在组织中的表达.结果 将405枚注射受精卵移植给15只假孕鼠,其中13只顺利妊娠并产下95只子鼠,经PCR鉴定得到5只转基因阳性首建鼠,其中4只小鼠可稳定传代,经与C57BL/6J小鼠回交7代后互交数代建系.子代转基因小鼠经RT-PCR检测发现Trpm8基因在心脏、肝脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中均有表达,且TRPM8蛋白表达在转基因小鼠中显著增加.结论 通过显微注射法成功建立了Trpm8转基因小鼠模型.     

异种肝移植模型-转入CD59蛋白基因小鼠的建立

目的 通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD59蛋白的转基因小鼠模型。方法 实验中利用OMT作为目的基因hCD59 cDNA的启动子．CMV作为报告基因GFP的启动子．构建重组质粒pGOC。通过显微注射法，把CMV-GFP-OMT-CD59基因片断注射入昆明白小鼠受精卵。结果 产生出86只F0代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测，12只阳性．进一步用Southern blot法检测1只阳性。结论 通过显微注射法，外源基因hCD59 cDNA在小鼠基因组中得到整合，产生出了阳性转人CD59蛋白基因小鼠。可用于进一步异种移植研究。     

显微注射法和精原干细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的方法学比较

目的 探讨经济简便有效的制备转基因小鼠的方法。方法 分别将线形和环状乙肝病毒X基因表达载体pcDNA3-X按常规显微注射入小鼠受精卵。导入假孕雌鼠，同时应用微量注射针将脂质体包裹的pcDNA3-X表达麓体直接注入C57BL／6N小鼠雄性小鼠睾丸的曲细精管内，运用PCR法和免疫组化法对所有转基因仔鼠进行鉴定．比较这两种方法的优缺点．结果 显微注射法繁琐，技术要求高，阳性率相对较高，达16．6％。精原干细胞介导法技术简便．阳性率为6．25％。结论 初步证明用精原干细胞介导法是一种经济简便有效的制备X基因转基因小鼠的方法。     

BIGH3R555w突变转基因小鼠模型的建立

目的建立BIGH3R555w突变转基因角膜营养不良小鼠模型。方法构建以磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase,PGK）为启动子的BIGH3（M）-IRES-EGFP重组质粒载体,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植入假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT—PCR及Western印迹法检测BIGH3基因表达。结果8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎84枚,出生35只子代鼠,经PCR检测得到4只转基因阳性小鼠。RT—PCR和Westem印迹法检测结果显示,BIGH3R555w在转基因小鼠角膜表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因B1GH3555w突变体在小鼠基因组中整合,成功建立了BIGH3突变转基因小鼠模型,该模型可为今后进一步研究角膜营养不良疾病的发病机制提供依据。     

GAP-43高表达转基因小鼠的建立

目的构建GAP-43(growth associated protein-43)高表达转基因小鼠,为进一步研究GAP-43对神经发生及损伤修复的作用机制提供基础。方法构建pCEP4-PDGF-GAP-43转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pCEP4-PDGF-GAP-43注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过Western blotting法检测GAP-43基因表达,并通过免疫荧光的方法对GAP-43表达位置进行定位。结果经PCR方法检测得到转基因阳性鼠,Western blotting结果显示GAP-43蛋白的表达量高于同胞对照组的小鼠且差异有统计学意义,免疫荧光染色结果显示GAP-43阳性反应物弥散分布于大脑皮质和海马中,且特异性存在于神经元中。结论外源基因GAP-43在小鼠基因组中得到整合并稳定遗传,为神经损伤修复及神经发育的相关研究提供了有价值的动物模型。     

myc和ras癌基因共整合转基因小鼠的建立

MMTV－H3－c－myc和MMTV－v－Ha－ras癌基因DNA混合显微注射到小鼠受精卵中，并移植到假孕母鼠输卵管内，获得出生后断奶健康小鼠95R（♀55，♂40）。经过斑点杂交显示myc正反应小鼠17只（♀12，♂5），ras正反应小鼠12只（♀7，♂5）。在全部25只癌基因正反应小鼠中，有4只为myc＋ras双重正反应，均为雌性。继续进行Soutnern印迹分析，确认myc正反应小鼠为“建成者”转基因小鼠。许多转基因小鼠发生各种肿瘤。     

显微注射法建成野生型p53转基因小鼠

用显微注射法将野生型p53基因导入C57BL／6J×SJL杂交F1代受精卵的雄性原核中，以ICR品系小鼠为假孕母鼠。结果出生37只原代小鼠，其中有13只在检测前不明原因死亡，其余的24只原代小鼠中有2只基因组中整合有p53基因，整合率为8.3％。     

氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠乙肝抗原表达的影响

目的：研究氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒的作用,并初步探讨其作用机制。方法：以乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠ＩＣＲ－ＴｇＮ（ＨＢＶａｄｒ１．２）ＳＭＭＵ 为动物模型,运用ＥＬＩＳＡ和免疫组化的方法检测小鼠肝脏内乙肝抗原含量。结果：分别予氧化苦参碱１００, ２００, ３００ ｍ ｇ／ｋｇ 腹腔注射,１次／ｄ,３０ ｄ 后,乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量较空白对照组（予等体积生理盐水腹腔注射）均有明显的下降,且对两者作用一致;进一步的研究表明氧化苦参碱２００ ｍ ｇ／ｋｇ 作用１０ ｄ,２０ ｄ 时小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量较治疗前有明显的下降。结论：氧化苦参碱能降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量,有抗乙型肝炎病毒作用。     

姜黄素对阿尔茨海默病模型小鼠胰岛素受体底物-1的影响

目的 观察姜黄素对阿尔茨海默病模型APP/PS1双转基因小鼠胰岛素受体底物-1(IRS-1)和磷酸化胰岛素受体底物-1(p-IRS-1)表达的影响,探讨姜黄素神经保护作用机制.方法 将3月龄的APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、罗格列酮组、姜黄素高(400 mg/kg)、中(200 mg/kg)、低(100 mg/kg)剂量组,并以同窝阴性小鼠作为正常对照组.连续灌胃6个月后,应用免疫组织化学、Western blot和RT-PCR法进行检测.结果 免疫组化染色,模型组小鼠大脑海马CA1区IRS-1阳性细胞较正常组明显增加(P＜0.01),与模型组相比,各干预组IRS-1阳性细胞数减少(P＜0.05或P＜0.01),p-IRS-1结果与IRS-1结果相反.Western blot检测海马IRS-1和p-IRS-1的蛋白表达结果与免疫组化检测结果一致.RT-PCR检测IRS-1 mRNA表达结果与免疫组化和Westernblot结果一致.结论 姜黄素可以使APP/PS1双转基因小鼠海马增加的IRS-1和减少的p-IRS-1得以恢复,并调节IRS-1 mRNA表达,改善APP/PS1双转基因小鼠胰岛素信号转导,提示姜黄素可能通过调节胰岛素信号转导机制发挥抗阿尔茨海默病作用.     

GH/tPA双转基因小鼠的制备及其表达分析

目的 旨在获得GH/tPA双转基因小鼠,并比较分析小鼠乳腺中人组织纤溶酶原激活剂（tPA）的表达水平和个体生长发育状况。方法 利用2只tPA单转基因雄性小鼠（P03、P05）与经超数排卵处理的正常非转基因雌性小鼠交配,受精卵显微注射线性化的GH质粒、胚胎移植而获得后代小鼠,PCR检测基因整合情况,ELISA和Western blotting检测比较单、双基因表达tPA水平,监测转基因小鼠不同生长阶段的体质量来分析GH基因对小鼠生长发育的影响。结果 P03系小鼠共获得286枚受精卵,移植受体母鼠后,顺利产仔77只,经PCR检测获得16只tPA单转基因小鼠（7♂,9♀）,13只GH/tPA双转基因小鼠（8♂,5♀）,双基因整合率为16.9%;P05系小鼠共获得175枚受精卵,移植受体母鼠后,顺利产仔34只,经PCR检测获得12只tPA单转基因小鼠（5♂, 7♀）,7只GH/tPA双转基因小鼠（3♂,4♀）,双基因整合率为20.6%。单、双转基因小鼠乳腺中表达tPA的最高量分别为82.5 μg/mL、674 μg/mL,GH/tPA双转基因小鼠乳腺中表达tPA的量明显高于tPA单转基因（P<0.05）。在小鼠的整个生长周期内,单、双转基因与正常非转基因小鼠的体质量增长均没有显著的差异（P>0.05）。结论 本实验成功地制备了GH/tPA双转基因小鼠,结果表明GH基因导入小鼠体内能够显著地提高目的基因tPA的表达水平,且不会对转基因小鼠的生长发育造成任何明显的影响,这为将来制备高表达转基因动物生产医药蛋白及其育种奠定了基础。     

抗菌肽的研究进展

近年来，随着传统抗生素抗药性的产生，人们对于抗菌肽的研究日益关注。本文主要对于抗菌肽的分类及结构特征、生物学特性、作用机理、分子生物学研究进展、应用与人工合成等方面进行综述。人们期望通过理论研究，探讨ABP的应用开发价值，由于抗菌肽特殊的作用机制为传统抗生素的耐药性这一棘手的世纪难题提供了新的契机，努力使之成为继青霉素等传统抗生素之后又一类重要的新型抗菌药物。研究发现，某些ABP除了具有广谱强力的抗细菌活性外，同时还具有高效的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤的活性。     

基于GFP/SCL-tTA/Bcr-abl转基因小鼠建立CML嵌合小鼠模型

目的 建立慢性粒细胞白血病(CML)的转基因嵌合小鼠模型,为靶向白血病干细胞(LSCs)治疗CML的研究提供良好的动物模型.方法 将Bcr-abl转基因小鼠与SCL-tTA转基因小鼠进行杂交,子代小鼠再与GFP转基因小鼠杂交,PCR鉴定Bcr-abl、tTA和GFP基因三阳性的小鼠(GFP/SCL-tTA/Bcr-abl小鼠).通过诱导GFP/SCL-tTA/Bcr-abl小鼠Bcr-abl基因表达4周后,取其骨髓白细胞移植至经致死剂量(900 cGy)辐照的FVB/N野生型小鼠.移植3周后,采用Western blotting检测Bcr-abl蛋白表达,流式细胞术检测小鼠外周血GFP+中性粒细胞的比例以及脾脏和骨髓GFP+ LSCs的比例.结果 PCR结果显示,GFP/SCL-tTA/Bcr-abl小鼠骨髓细胞成功植入FVB/N受体小鼠;Western blotting检测结果显示,移植小鼠的骨髓细胞中表达Bcr-abl蛋白;流式细胞术结果显示,移植小鼠的外周血GFP+中性粒细胞比例以及脾脏和骨髓GFP+ LSCs的比例明显升高.结论 成功建立了GFP/SCL-tTA/Bcr-abl转基因CML嵌合小鼠模型.