HBsAg及B7—2抗原重组腺病毒载体感染免疫研究

目的 为激发机体对HBsAg的CTL反应,寻求对慢性乙型肝炎更有效的治疗方法。方法 构建了共表达HBsAg及B7－2抗原的E1区插入重组腺病毒载体,用脂质体法转染293细胞,经空斑筛选表达目的抗原的重组腺病毒,用ELISA法及Western blotting法分别检测HBsAg及B7－2抗原表达,在293细胞中扩增,再纯化、浓缩后,体内感染C57小鼠,检测体液免疫反应和细胞免疫反应。结果 重线腺病毒在体外培养的293细胞及HepG2细胞中高效表达HBsAg及B7－2抗原。感染小鼠体液免疫较弱,但可通过注射乙型肝炎疫苗而加强;重组腺病毒载体能诱导强而有效的细胞免疫反应;未观察到明显毒副作用。结论 HBsAg及B7－2抗原重组腺病毒载体体外感染293、HepG2细胞后高效表达目的抗原,感染免疫后诱导有效的细胞免疫反应。初步结果显示腺病毒载体是一种高效、安全的载体系统。     

HBsAg及B_(7-2)抗原重组腺病毒载体感染免疫研究

目的　为激发机体对ＨＢｓＡｇ的ＣＴＬ反应,寻求对慢性乙型肝炎更有效的治疗方法。方法　构建了共表达ＨＢＳＡｇ及Ｂ７－２抗原的Ｅ１区插入重组腺病毒载体,用脂质体法转染２９３细胞,经空斑筛选表达目的抗原的重组腺病毒,用ＥＬＩＳＡ法及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法分别检测ＨＢｓＡｇ及Ｂ７－２抗原表达。在２９３细胞中扩增,再纯化、浓缩后,体内感染Ｃ５７小鼠,检测体液免疫反应和细胞免疫反应。结果　重组腺病毒在体外培养的２９３细胞及ＨｅｐＧ２细胞中高效表达ＨＢＳＡｇ及Ｂ７－２抗原。感染小鼠体液免疫较弱,但可通过注射乙型肝炎疫苗而加强;重组腺病毒载体能诱导强而有效的细胞免疫反应;未观察到明显毒副作用。结论　ＨＢｓＡｇ及Ｂ７－２抗原重组腺病毒载体体外感染２９３、ＨｅｐＧ２细胞后高效表达目的抗原,感染免疫局诱导有效的细胞免疫反应。初步结果显示腺病毒载体是一种高效、安全的载体系统。     

表达丙型肝炎病毒非结构蛋白3的重组腺病毒免疫小鼠的研究

目的构建表达HCV非结构蛋白3（NS3）的重组腺病毒RAd／NS3，探讨其免疫小鼠后诱导机体产生特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增编码NS3蛋白（329～935位氨基酸）的基因片段，定向克隆至重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上，与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化BJ5183菌，利用细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒，转染293细胞，以包装、扩增重组腺病毒。将重组腺病毒以1×10^8 pfu剂量经皮下注射免疫BALB／c小鼠，并以100μg重组质粒pRC／NS3经肌内注射途径免疫小鼠为对照。ELISA法检测免疫小鼠血清抗体水平，^51 Cr释放法检测免疫小鼠细胞毒性T淋巴细胞体外杀伤功能。结果重组腺病毒经皮下免疫小鼠后可刺激机体产生较强的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，且免疫效果强于重组质粒pRC／NS3组，初次免疫后2周，前者20只小鼠抗-HCV全部阳转，而后者10只小鼠仅3只阳转，未观察到明显的不良反应。结论表达HCV NS3抗原的重组腺病毒载体疫苗能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答。     

乙型肝炎病毒隐匿型感染

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)感染是一个全球性的公共健康问题。多数感染是没有症状的 ,而且病毒标志很快转阴。幼儿期间感染ＨＢＶ容易演变为慢性病毒携带状态 (危险性 >5 0 % ) ,而成人型感染慢性化的危险性较低 (3 %～ 8% )。血清中乙型肝炎表面抗原 (ＨＢｓＡｇ)阳性持续达 6个月者为ＨＢＶ慢性感染。ＨＢＶ慢性感染可分为早期的高复制期和以后的低复制期 ,可能还有非复制期。这种慢性感染可在某些患者引起持续性的肝实质损伤 ,即慢性乙型肝炎和肝硬化 ;也可能不引起明显肝损害 ,称为无症状携带者。但两者都能使肝细胞癌 (ＨＣＣ)发生危险性显…     

乙型肝炎病毒核心区基因免疫小鼠细胞免疫应答研究

目的观察小鼠对ＨＢＶ核心区基因疫苗的免疫应答。方法将经过基因修饰的乙型肝炎病毒核心区基因定向克隆于真核表达载体（ｐｃＤＮＡ３），构建成ＨＢＶ核心区基因疫苗（ｐｃＤＮＡ－ＨＢＶ），给Ｂａｌｂ／ｃ小鼠多点肌肉注射，２周后追加免疫一次，用竞争抑制酶联法及ＭＴＴ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ及脾细胞对ＨＢｃＡｇ的特异性增殖反应。结果免疫接种２周后小鼠血清抗－ＨＢｃ均阳性，持续１２周以上，脾细胞对ＨＢｃＡｇ的刺激指数明显高于对照组（Ｐ＜０．０５）。结论ｐｃＤＮＡ－ＨＢＶ在Ｂａｌｂ／ｃ小鼠体内既可诱导体液免疫应答，又可诱导特异性的细胞免疫应答     

甲型与乙型肝炎病毒合并感染

甲型肝炎病毒(HAV)或乙型肝炎病毒(HBV)感染均在我国广泛流行,两者不存在交叉免疫。同一个体中,同时或先后感染而致体内两种病毒并存的现象并不少见。HAV与HBV病毒学标志检测技术的进步及其应用意义的了解,使我们有可能深入探讨这两种病毒合并感染时的相互关系与后果。     

乙型肝炎病毒基因疫苗诱导小鼠产生免疫应答的效应

目的 :构建编码乙型肝炎病毒 (HBV)表面蛋白S的重组质粒pCR 3 .1 S,将之直接肌肉注射balb/c小鼠 ,观察小鼠HBV特异的免疫应答。方法 :以ELISA法检测小鼠血清 ,3H TdR掺入法测定淋巴细胞增殖 ,51 Cr 4h释放法检测淋巴细胞杀伤功能。结果 :与空载体对照组相比较 ,基因疫苗诱发小鼠产生良好的抗HBs反应及HBV特异的细胞免疫应答 (P <0 .0 5)。结论 :基因疫苗pCR 3 .1 S可诱导balb/c小鼠产生全面的免疫应答     

乙型肝炎病毒基因分型及其临床意义

目的了解慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者HBV基因分型及其对慢性肝病的影响,为制定针对不同HBV基因型抗病毒的个体化方案提供分子病毒学依据。方法临床确诊的慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及肝癌患者314例,采用RDB法对HBV进行基因分型检测。结果山西地区的200例慢性乙型肝炎患者所感染的HBV均为B和C基因型,分别占56%、26%,并存在混合感染(17%);C与B基因型患者相比,血清病毒载量高、肝脏损伤严重;混合感染的患者与单一基因型感染者相比病毒载量更高、肝损伤更严重;肝硬化患者感染的HBV主要为C基因型及B、C混合感染,且肝损害严重、病毒复制率高;肝癌患者中C基因型感染占42.19%,B、C混合感染占37.5%,B基因型感染可能与年轻患者肝癌的发生有关。结论B基因型HBV感染与C基因型及混合感染相比,病毒载量低、肝损害轻,但年轻患者应监测肝癌的发生;C基因型及混合感染的患者预后较差,肝硬化、肝癌发生率高,应进行积极有效的治疗,防止严重肝病发生。     

甲型与乙型肝炎病毒双重感染的临床分析

作者对比分析３０例ＨＡＶ与ＨＢＶ双重感染病例与２０例单纯甲型肝炎（甲肝）病例，结果示两组病情无显著性差异。仅１例慢活肝合并甲肝病例的临床表现较重，提示双重感染的结局与原患乙肝的病例有明显关系。     

乙型肝炎病毒基因整合与相关肝病的研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染是其相关肝病发生、进展的根本原因。HBV基因与宿主基因的整合不一定是病毒复制的必要环节,但越来越多的研究表明HBV基因整合事件可发生于病毒感染宿主的不同疾病阶段。HBV基因整合事件可能是影响包括HBV慢性感染、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌等肝脏疾病发生、发展的重要因素之一。HBV基因整合可诱导宿主对HBV免疫耐受,从而导致病毒感染慢性化;HBV基因组中HBV X区、HBV前S和S片段与宿主基因的整合事件最为常见,这与肝硬化和肝细胞癌的发生密切相关。HBV基因易与宿主端粒反转录酶、赖氨酸甲基转移酶2B和细胞周期E1等基因发生整合,并影响这些基因的转录,进一步引起其他相关基因的功能紊乱。针对HBV基因整合事件,可通过Sanger法测序和HBV捕获测序的方式进行测定研究;虽然越来越多的HBV基因整合事件在二代测序研究中被发现,但HBV基因与宿主基因整合的机制尚未明确。整合事件对疾病的发生、转归和对宿主基因活动的影响仍不清楚,需深入、细致的研究。     

Insights into induction of the immune response by the hepatitis B vaccine

After more than four decades of hepatitis B virus (HBV) vaccine implementation, its safety and efficacy in preventing HBV infection have been proven and several milestones have been achieved. Most countries have included HBV immunization schedules in their health policies and progress has been made regarding universalization of the first HBV vaccine dose at birth. All of these actions have significantly contributed to reducing both the incidence of HBV infection and its related complications. However, there are still many drawbacks to overcome. The main concerns are the deficient coverage rate of the dose at birth and the large adult population that has not been reached timely by universal immunization. Additionally, the current most widely used second-generation vaccines do not induce protective immunity in 5% to 10% of the population, particularly in people over 40-years-old, obese (body mass index > 25 kg/m²), heavy smokers, and patients undergoing dialysis or infection with human immunodeficiency virus. Recently developed and approved novel vaccine formulations using more potent adjuvants or multiple antigens have shown better performance, particularly in difficult settings. These advances re-launch the expectations of achieving the World Health Organization’s objective of completing hepatitis control by 2030.     

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的 构建1.3倍全基因乙型肝炎病毒(HBV)真核细胞表达载体,观察其在HepG2细胞中的表达。方法 从pGEM—HBV载体上将约4.1kb的1.3倍HBV全基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1的Hind Ⅲ位点,将构建的pHBV经Lipofectamine2000导入肝癌细胞系HepG2细胞中。分别在转染后24、48、72h测定HepG2上清液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)的表达,细胞内HBsAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)免疫组织化学染色,Southern、northern杂交鉴定HBV的复制与表达。结果成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体,转染后24、48、72h细胞上清液中HBsAg分别为5.36±0.25,13.42±1.24,7.52±0.43;HBeAg分别为9.16±0.32,22.75±1.49,15.96±1.03。免疫荧光结果显示转染后24 h细胞内HBsAg表达最强,主要呈胞浆内弥漫性分布,HBcAg为核浆型分布,以浆型为主。Southern、northern杂交均证实细胞内存在各种病毒复制中间体和特异的病毒复制转录物。结论 该表达载体可介导高水平病毒复制,其转染细胞可望成为一种新型的HBV 体外感染模型。     

鸭乙型肝炎病毒体液免疫血清学指标的系统建立与应用

目的：建立简便,特异的鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染及免疫血清学检测系统。方法：制备、纯化检测所需同的抗DHVB前S区单克隆抗体腹水,DHBsAg和rDHBcAg , 对随机筛选的80份感染血清及实验感染1日龄重庆麻鸭系列血清分别进行DHBsAg 和抗－DHBc,抗－DHBs检测。结果：PCR方法检测出阳性66份,阴性14例,选用PCR阳性的66份标本,经HDBsAg ELISA检测出58份阳性,斑点杂交检出阳性份数为62份。与DHBVRCR相比较,灵敏度分别为87．9％和93．9％,而8只实验感染鸭仅2只在感染后第3周血清抗－DHBc阳性,抗体效价为1：10,至第4周一已为阴性,抗－DHBs则在所有标本均为阴性,结论：DHBV感染及免疫血清学酶联免疫方法的建立,为进一步研究DHBV感染后腹制规律及体风免疫应答状况奠定了基础。     

DNA疫苗诱导健康小鼠抗-HBs产生的实验研究

目的　初步评价DNA疫苗诱导健康小鼠体液免疫应答效果。方法　应用基因重组技术构建编码乙型肝炎病毒(HBV)中蛋白(preS     

乙型肝炎病毒复制调控元件对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）复制调控元件增强子Ⅰ（ENHⅠ）及前S2（Pre-S2）抗原基因对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答的影响。方法采用常规聚合酶链反应（PCR）从HBV adr亚型全基因DNA序列中分别扩增HBsAg、PreS2-HBsAg、HBsAg-ENHI和PreS2-HBsAg-ENHⅠ基因片段，重组到VR1012载体中，构建4种HBV DNA疫苗，转染HepG2细胞并免疫Balb／C小鼠。通过细胞免疫化学、酶联免疫分析（ELISA）、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）等方法检测其在HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答。结果转染的HepG2细胞表达相应的目的蛋白．ENHⅠ及Pre-S2抗原基因均可增强HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg；免疫接种小鼠后第2周产生抗-HBs及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），Pre—S2抗原基因可增强HBV DNA疫苗免疫Balb／C小鼠诱导的抗-HBs及HBsAg特异性CTL的产生，ENHⅠ基因对免疫应答无影响。结论ENHI及Pre—s2抗原基因均可增强HBVDNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg．Pre-S2抗原基因可增强HBVDNA疫苗免疫Balb／C小鼠引起的免疫应答。     

乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系的建立

目的构建1.3拷贝乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系。方法在野毒株1.3拷贝HBV载体的基础上采用定点突变的方法将rtL180M,rtM204V位点突变,构建拉米夫定耐药病毒株,并通过PCR、限制性内切酶酶切,分别以正向和反向将野毒株和耐药株分别连接于逆转录病毒载体pLNCX2的相应酶切位点,构建成重组逆转录病毒载体,经双酶切及PCR扩增鉴定。重组载体转染包装细胞,筛选培养细胞克隆并进行病毒滴定。结果通过双酶切、PCR扩增、测序鉴定证实成功构建了1.3拷贝HBV拉米夫定耐药株的逆转录病毒载体。成功建立包装细胞系并测得病毒滴度均为1×105cuf/ml。结论含正向及反向1.3拷贝HBV拉米夫定耐药的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系构建成功,可以用于拉米夫定耐药细胞模型研究。     

乙型肝炎病毒感染的免疫耐受状态是否需要打破

对慢性HBV感染自然史的研究发现,母婴垂直传播或幼年期感染HBV后,绝大多数感染者会出现一种被称之为免疫耐受状态的现象,即ALT正常、HBeAg阳性、HBV DNA持续高水平且肝组织没有或仅有轻微的病变.根据目前的慢性乙型肝炎防治指南,对这些感染者在临床上暂时不予抗病毒治疗.然而,在这些人群中,随着时间的推移,这种免疫耐受状态会自发地完全或不完全被打破而出现免疫清除,造成肝组织免疫损伤,使疾病逐渐进展,甚至隐匿进展为肝硬化或肝细胞癌.     

柯萨奇病毒B3的VP1 DNA疫苗与蛋白或重组腺病毒疫苗不同组合免疫方式的免疫效果观察

目的 观察柯萨奇病毒B3 (Coxsackievirus B3, CVB3)衣壳蛋白VP1 DNA疫苗初免后VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强的prime-boost策略的免疫效果。方法 用CVB3 VP1的真核表达质粒pcDNA3/VP1初次免疫小鼠后,分别用VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强免疫2次。检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体、中和抗体滴度以及脾脏细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocytes,CTLs)杀伤活性;致死量CVB3攻击后,检测小鼠血中病毒滴度并观察动物的存活情况。结果 pcDNA3/VP1 +VP1蛋白组小鼠血清IgG抗体、中和抗体滴度以及动物生存率明显高于pcDNA3/VP1 + rAd/VP1组和pcDNA3/VP1质粒组（P<0.05）; pcDNA3/VP1 + rAd/VP1组和pcDNA3/VP1 +VP1蛋白组小鼠脾脏CTLs杀伤活性明显高于pcDNA3/VP1 质粒组（P<0.05）。结论 质粒pcDNA3/VP1初次免疫后,VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强的prime-boost策略有较好的免疫效果,两者比较pcDNA3/VP1 +VP1蛋白prime- boost免疫策略的效果更为明显。     

乙型肝炎病毒L02细胞转染模型的建立与鉴定

我们以L02细胞为基础,利用基因重组技术构建含1.3倍加长乙型肝炎病毒(HBV)全基因组的表达质粒pcDNA-HBV,进行基因转染,获得了类似HepG22.2.15(简称2.2.15细胞)(HepG2转染HBVDNA后所得)具有复制和分泌HBV能力的HBV转染细胞模型。