人乳头瘤病毒16型E6E7反义RNA抑制宫颈癌细胞恶性？…

目的 研究癌基因的特异性反义ＲＮＡ对癌细胞生长繁殖和恶性程度的影响。方法 用逆转录病毒载体将人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）－６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ导入ＨＰＶ－１６ＤＮＡ阳性的宫颈癌细胞株ＣａＳｋｉ中，观察该细胞在导入反义ＲＮＡ后其表型特征和在裸鼠体内致癌能力的变化。结果 ＨＰＶ－１６ Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ能降低宫颈癌细胞ＣａＳｋｉ的生长速率，抑制其在软琼脂上的集落形成能力，并能明显地抑制其在裸鼠体内的致癌能力     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因反义质粒对人宫颈癌细胞恶性的逆转…

构建可为地塞米松诱导表达的人乳头瘤病毒１６型Ｅ６Ｅ７，基因反义质粒，利用磷酸钙沉淀法将其分别转染到ＨＰＶ－１６阳性的人宫颈癌株Ｃａｓｋｉ和ＨＰＶ阴性的人宫颈癌细胞株Ｃ－３３Ａ中。地塞米松诱导反义质粒表达后，ＣａｓＫｉ细胞失去其恶性表型，而Ｃ－３３１细胞的生长特性及恶性行为未发生变化。     

含人乳头瘤病毒16型E6E7反意基因的假型逆转录病毒对人乳头瘤病毒16型转化细胞生长的抑制作用

构建了一个含人乳头瘤病毒１６型Ｅ６Ｅ７反意基因片断的逆转录病毒载体ｐＨ１９。用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将ｐＨ１９导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，使之产生假型逆转录病毒Ｈ１９。Ｈ１９病毒感染人乳头瘤病毒１６型转化的细胞后，使转化细胞的生长速率和裸鼠体内形成肿瘤的能力均明显下降。     

子宫颈癌中人乳头瘤病毒16型E7基因检测及变异分析

用聚合酶链反庆法检测宫颈癌中人乳头瘤病毒１６型转化基因Ｅ７，检出阳性率为１０／２２，其中４例进行ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析发现该基因与标准对照株存在明显变异。核苷酸序列分析证实有两处发生碱基突变。研究提示，ＰＣＲ方法能快速检测宫颈癌中人乳头瘤 转化基因，可作为宫颈癌的辅助诊断方法，ＳＳＣＰ分析能发现病毒株间小变异的基因片段。     

人乳头瘤病毒16型E＿6E＿7基因反义质粒对人宫颈癌细胞恶性的逆转作用

构建可为地塞米松诱导表达的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ－１６）Ｅ＿６Ｅ＿７基因反义质粒（ｐ１６ａｓＥ＿６Ｅ＿７Ｎｅｏ），利用磷酸钙沉淀法将其分别转染到ＨＰＶ－１６阳性的人宫颈癌细胞株Ｃａｓｋｉ和ＨＰＶ阴性的人宫颈癌细胞株Ｃ－３３Ａ中。地塞米松诱导反义质粒表达后，ＣａｓＫｉ细胞失去其恶性表型，而Ｃ－３３Ａ细胞的生长特性及恶性行为未发生变化。说明反义质粒能够改变Ｃａｓｋｉ细胞的恶性表型，且这种改变是通过特异性抑制Ｅ＿６Ｅ＿７基因表达实现的。     

特异siRNA抑制宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒16型E6表达的研究

目的 优化HPV-16 E6癌基因特异的U6质粒表达的siRNA，抑制HPV癌基因表达及其对子宫颈癌细胞生长繁殖的影响。方法 选择4个分别针对HPV-16 E6 mRNA外显子和内含子序列为靶序列，合成DNA链，构建表达HPV-16 E6短发卡样dsRNA的重组pSilencer1．0-U6载体，导入HPV-16DNA阳性的宫颈癌细胞株CaSki中，观察该细胞中HPV-16 E6、E7基因表达水平及其蛋白含量的变化，并观察细胞生长被抑制的情况。结果 4种HPV-16 E6 siRNA均能降低宫颈癌细胞CaSki的生长速率。通过细胞生长曲线观察到HPV-16 E6 shRNA表达质粒导入细胞0-96h内，可降低细胞生长速度。荧光定量RT-PCR检测HPV-16 E6 siRNA可使宫颈癌细胞株CaSki中HPV-16 E6、E7基因转录的mRNA水平降低，其中针对E6 mRNA内含子的重组shRNA只抑制E6基因的表达水平。Western blot分析表明，4个HPV-16 E6 siRNA作用72h后，未能检测到宫颈癌细胞中HPV-16 E6蛋白。结论 HPV-16 E6 siRNA能使宫颈癌细胞CaSki生长缓慢；选择针对E6内含子的siRNA作用位点，特异性抑制E6表达；而针对E6外显子的siRNA作用位点，可抑制E6和E7基因的表达，是用于治疗HPV阳性宫颈癌细胞的理想靶位。     

宫颈脱落细胞标本中人乳头瘤病毒16、18型E6基因的检测

观察宫颈脱落细胞标本是否能替代宫颈组织标检测HPV16、18型的感染。通过聚合酶链反应－限制性片段多态性分析。比较127例宫颈患者的单、双份宫颈脱落细胞和宫颈病变组织中HPV16、18型E6基因的检出率。发现单、双份宫颈脱落细胞标本中HPV16型E6基因的检出率分别为34．64％和40．73％;HPV18型的检出率为17．32和22．04％,存在差异。组织标本中HPV16、18型的检出率分别为41．73％和22．83％,与双份脱落细胞本的检出率无明显,表明双宫颈脱落细胞标本可替代宫颈组织标本检测患者宫颈组织中HPV16、18型感染情况。     

西多福韦对人宫颈癌细胞CaSki内人乳头瘤病毒16抑制作用研究

目的从抗病毒角度探讨西多福韦对宫颈癌细胞 CaSki内人乳头瘤病毒16（HPV16）的抑制作用及对细胞周期的影响。方法用 MTT法检测西多福韦对细胞的毒性;用实时定量 PCR法检测其对病毒 E6、E7 mRNA水平的影响;用 Western blot方法检测其对病毒蛋白 E6、E7和细胞抑癌蛋白 p53、pRb表达水平的影响;用流式细胞法检测其对宫颈癌细胞周期的影响。结果西多福韦对宫颈癌细胞毒性较正常细胞大。可使HPV16阳性宫颈癌细胞 CaSki内 E6、E7 mRNA和蛋白水平降低,最大抑制率分别为（33.38±8.00）%、（28.32±2.73）%和98.92%、97.46%;可以使 p53、pRb蛋白水平升高,最大浓度时可以上调12.06和3.53倍;对 HPV16阴性宫颈癌细胞 C-33A p53蛋白表达无影响,但可提高 pRb蛋白水平;可导致 CaSki和 C-33A细胞发生 S期阻滞,最高浓度组细胞相对对照组 S期分别增加22.83%和67.64%。结论西多福韦可以在对细胞无毒的浓度下,抑制宫颈癌细胞内的 HPV16,诱导宫颈癌细胞发生 S期阻滞。     

人乳头瘤病毒16 E6蛋白单克隆抗体的研制

运用杂交瘤技术，我们成功地建立了两株能稳定分泌小鼠抗人乳头瘤病毒１６Ｅ６蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。经鉴定单克隆抗体均属ＩｇＧ１ｋ。试验结果表明，所得单克隆抗体仅与ＨＰＶ１６Ｅ６融合蛋白反应，不与ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２融合蛋白以及Ｌ１－Ｌ２真核表达蛋白反应，也只与Ｃａｓｋｉ细胞反应，不与Ｈｅｌａ细胞反应。初步结果说明，该抗体是ＨＰＶ１６Ｅ１６蛋白特异性的ＭｃＡｂ。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞免疫学特性影响的研究

目的 研究特异性抗体HPV16E6核酶的转染对宫颈癌细胞免疫学特性的影响。方法 以脂质体法将抗HPV16E6-ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi、CaSKi-P细胞。流式细胞仪分别检测3种细胞HLA－1、HL2－2、B7－1和B7－2基因的表达,分析CaSKi细胞转染酶后免疫学特性的变化。诱导制备NK、LAK、CD3AK和肿瘤细胞共激活杀伤细胞,检测各种免疫细胞对CaSKi-R、CaSKi-P、CaSKi细胞的杀伤效应。结果 CaSKi和CaSKi-p细胞中HLA－2、B7－1、B7－2表达都很低,两者差异无显著性。CaSKi-R中HLA－2、B7－1、B7－2表达率均明显升高。3种细胞中HLA－1表达率都很高。NK、LAK、CD3AK细胞对CaSKi-R细胞伤率显著高于CaSKi细胞,CaSKi、CaSKi-R分别与rIL－2共激活杀伤细胞（称CASKI和CASKI－R）的样伤活性无明显差别,对CaSKi-R的杀伤活性高于CaSKi细胞。而各种免疫细胞对CaSKi-P细胞的杀伤率与CaSKi细胞差异无显著性。结论 抗HPV16E6－nrbozyme的导入能使宫颈癌CaSKi细胞易于被机体免疫系统识别杀伤,难于免疫逃避,但不能增强其免疫原性。     

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E7蛋白致癌机理初探

目的 研究宫颈癌组织中人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６－Ｅ７蛋白对视网膜母细胞瘤基因（Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）Ｒｂ蛋白及Ｅ２Ｆ－１的作用的机制,探讨ＨＰＶ１６－Ｅ７蛋白与宫颈癌发生的关系。方法 采用聚合酶链反应检测宫颈癌及正常宫颈组织中ＨＰＶ１６感染等,用蛋白印迹技术对ＨＰＶ１６ ＤＮＡ阳性的宫颈癌组织中是否存在ＨＰＶ１６－Ｅ７蛋白和Ｒ６蛋白－Ｅ２Ｆ－１形成的复合物进行检测。正常宫颈组织作为对照,     

新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV-16型L2基因多态性分析

目的探讨新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirus16,HPV16)L2基因的变异,并预测L2蛋白的功能变化。方法从19份中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA,以此DNA为模板,PCR扩增HPV16L2全长基因,PCR产物直接测序或克隆后测序,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织HPV16L2基因多态性及HPV16L2蛋白功能的变化。结果PCR检测结果显示宫颈癌组织中HPV16L2阳性率为84.21%(1619);测序和序列分析表明L2基因核苷酸多处发生变异,并引起编码氨基酸的变异;L2基因在核苷酸水平上形成7种突变模式(XJL21～XJL27),各模式与HPV16原型比较,同源性在99.37%～99.79%之间;在氨基酸水平上形成5种突变模式,其中XJL1123突变模式占66.67%(812),是突变的主流模式,各模式与HPV16原型比较,同源性在98.31%～99.58%之间;以上突变引起HPV16L2蛋白疏水性和抗原性的改变,继而改变了L1蛋白的结构及功能。结论中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16L2基因发生多位点变异,并形成多种突变模式和突变主流模式;这些突变引起HPV16L2蛋白疏水性和抗原性的改变,提示HPV16L2基因突变可能与HPV16的系统发生以及病毒逃避机体免疫识别有关。     

人乳头瘤病毒16型E6E7 ORF转化作用的研究

构建了含人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）－Ｅ６Ｅ７ＯＲＦｓ（ｎｔ８３－８５５）片段和ＨＰＶ１６长控制区（ＬＣＲ）加Ｅ６Ｅ７ＯＲＦｓ片段（ｎｔ７００７－７９０４／０－８７９）的逆转录病毒载体ｐＨ２１和ｐＨ１８质粒，利用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ分别将它们导入病毒包装细胞ｐＡ３１７中，经过筛选获得Ｇ４１８抗性的病毒包装细胞，产生的重组病毒Ｈ２１和Ｈ１８感染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞都具有恶性细胞的形态学特征，并能在裸鼠体内形成肿瘤。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证明，上述两基因片段都整合到细胞基因组中。本实验结果说明ＨＰＶ１６－Ｅ６Ｅ７基因片段是ＨＰＶ１６转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞的关键早期区，其自身ＬＣＲ区在该转化过程中没有显示出重要作用。     

人乳头瘤病毒E6、E7的表达对足叶乙甙作用下细胞凋亡的影响

目的探讨人乳头瘤毒(HPV)16早期基因E6和E7的表达对NIKS细胞凋亡表型的影响。方法用含有HPV16的E6、HPV16E7、HPV16E6E7病毒癌基因的逆转录病毒感染角质生成细胞株NIKS,puromycin筛选稳定表达细胞;基因组PCR和Western blot方法验证E6和E7的表达;转染后的NIKS细胞用不同浓度的足叶乙甙处理,流式细胞仪和Annexin V染色检测细胞凋亡情况。结果经逆转录病毒感染后,建立表达E6、E7及E6E7的NIKS细胞株,基因组PCR证明E6和E7整合入NIKS细胞基因组;Western blot证实表达的E6、E7具有生物学活性,能够分别降解p53和pRB;在足叶乙甙处理后,E6、E7以及E6E7表达细胞发生明显的细胞死亡,E6和E7具有叠加作用,且具有剂量依赖性,Annexin V染色证实细胞发生凋亡,凋亡率分别为(33.5±3.2)%、(38.3±2.4)%和(56.7±4.3)%。结论人乳头瘤病毒E6和E7的表达都可以促进细胞对DNA损伤药物的敏感性,提示乳头瘤病毒感染状态有可能影响肿瘤细胞对化疗的敏感性。     

稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。