吉林双阳梅花鹿核蛋白体蛋白L27 cDNA的克隆

目的 为了开发我国珍稀动物——吉林双阳梅花鹿的基因资源，在分子水平上揭示鹿药材的药理作用。方法 构建了梅花鹿脾脏细胞cDNA质粒文库，克隆了一些看家基因并进行了序列分析。结果 其中的一个序列在核酸及推导的氨基酸序列水平上与编码人、犬、大鼠、小鼠核蛋白体蛋白L27(ribosomal protein L27)cDNA序列和对应的氨基酸序列高度同源，并具有完整的开放阅读框架(ORF)。结论 发现了双阳梅花鹿核蛋白体蛋白L27全长cDNA序列，此序列已经在(Genbank中登录，登录号为：AF373231。     

红鲫Sox4基因保守区的克隆与序列分析

目的 为进一步全面理解鱼类Sox基因的复制与进化,从红鲫基因组DNA中克隆Sox基因HMG盒保守区.方法 参照Sox基因HMG盒保守区的氨基酸序列设计一对兼并引物,以红鲫基因组DNA为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行亚克隆和测序.结果 获得2个序列(序列Ⅰ和序列Ⅱ).同源性比较显示,序列Ⅰ和序列Ⅱ编码的氨基酸序列均与小鼠Sox4的同源性最高,分别为88.9%和90.7%;氨基酸序列排序比较,序列Ⅰ和序列Ⅱ也都与人Sox4的同源性最高.结果表明,红鲫序列Ⅰ和序列Ⅱ均是小鼠、人Sox4基因的直向同源基因,分别命名为RcSox4-1和RcSox4-2.结论 Sox4基因在红鲫进化过程中发生了基因复制,Sox4基因复制可能发生在红鲫、斑马鱼及草鱼分化之前.     

豫医无毛小鼠无毛基因部分DNA序列分析

目的：探讨豫医无毛小鼠的无毛基因突变情况.方法：采用PCR方法扩增豫医无毛小鼠无毛基因的部分DNA序列,并进行克隆测序,将测序结果与国外公布的小鼠、大鼠及人无毛基因的cDNA序列做同源性比较和分析,确定该鼠无毛基因的特异性.结果：克隆测序结果为一923 bp的片段,相当于Genbank上公布的小鼠无毛基因cDNA序列的3 150～3 565 bp位置,包含4个外显子（外显子13～16）及3个内含子（内含子13～15）;与本室以前所测昆明小鼠无毛基因部分DNA序列100%同源,其外显子部分共416 bp,可编码138个氨基酸,与国外公布的小鼠、大鼠、人的无毛基因核苷酸同源性分别为100%、95%、84%,氨基酸同源性分别为100%、97.8%、84%.结论：①克隆定序了豫医无毛小鼠无毛基因的部分DNA序列;②排除了豫医无毛小鼠无毛基因的突变发生于本段序列的可能;③无毛基因在哺乳动物体内同源性很高,应属保守基因,其蛋白质产物可能在一些基本的调节途径中起重要作用,推测豫医无毛小鼠的无毛基因可能也位于14号染色体.     

基质金属蛋白酶-2C端片段pex的克隆、测序及真核表达载体的构建

目的 :克隆小鼠基质金属蛋白酶 - 2 ( MMP- 2 ) C端片断 pex编码区的 c DNA序列 ,并构建其真核表达载体 ,为进一步研究其抑制肿瘤作用奠定基础。方法 :根据基因 Gen Bank中 MMP- 2基因的碱基序列 ,利用 RT- PCR的方法从 NIH3T3细胞中分别扩增信号肽及目的基因 pex,然后用多重 PCR的方法将两个片段拼接起来 ,再将拼接起来的目的片段 sig- pex与 p MD1 8T载体连接作全自动测序 ,利用亚克隆的方法将 sig- pex c DNA片段克隆到 pc DNA3.1载体中。结果 :DNA测序证实该片断序列与文献报道完全一致。结论 :成功构建出 pc DNA3.1 - sig- pex真核表达载体     

Cloning of Mouse Enamel Matrix Serine Proteinase Encoding Mature Protein

目的 :克隆小鼠牙胚组织中釉基质丝氨酸蛋白酶 ( EMSP1 )成熟肽编码区基因。方法 :提取出生后 7d昆明种小白鼠切牙、磨牙牙胚总 RNA,逆转录为 c DNA,设计两对特异性引物 ,采用 Touchdown PCR和嵌套 PCR方法 ,扩增出小鼠 EMSP1起始密码子至终止密码子基因片段。将目的基因连入载体 p MD- 1 8T,转化入大肠杆菌 JM1 0 9,通过蓝白筛选 ,挑选阳性克隆培养扩增 ,纯化重组质粒进行限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定。结果 :限制性酶切图谱和核苷酸序列分析均表明所克隆 c DNA为小鼠 70 0 bp的 EMSP1成熟肽基因编码。结论 :成功地克隆了小鼠编码EMSP1成熟肽基因片段     

一条人类砷相关新cDNA基因的克隆及生物信息学分析

目的 :探讨砷化物与基因的相互作用 ,克隆砷相关基因 ,利用生物信息学技术分析克隆基因。方法:采用 SMART方法构建 c DNA文库 ,杂交筛选并克隆基因 ,利用生物信息学手段对克隆基因进行结构和功能的分析。6 μm ol/ L Na As O2 处理人正常肝 L- 0 2细胞 2 h,抽提 RNA做基因芯片杂交。结果:成功克隆一条新基因 ,生物信息学分析发现在 7到 4 5 6碱基范围内有一个完整的 ORF,在编码起始区有典型的 Kozak序列 ,编码 14 9个氨基酸的蛋白质。核酸同源性比对发现与人类 1p36 .2 - 36 .3染色体 DNA序列同源性达 98% ,编码蛋白质同 Alu亚家族 SB序列同源性达 85 %。染砷细胞基因芯片杂交发现克隆基因表达增高。结论:克隆的人类砷相关基因 ,编码蛋白质与Alu亚家族 SB序列同源性高。     

双阳型梅花鹿脾脏细胞cDNA文库的构建和四个EST的发现

目的：开发和利用中国梅花鹿的基因资源,以期拥有一批梅花鹿基因的专利,并在专利保护下生产具有自己知识产权的基因工程药物。方法：用Trizol试剂提取梅花鹿脾脏细胞中的总RNA,分离得到mRNA后,用逆转录方法合成与mRNA互补的cDNA单链,再以此cDNA单链为模板,得到与该cDNA互补的另一条DNA链,将得到的DNA双链分子通过合适的Adapter连入pSPORT1质粒,将此重组质粒通过电转化方法导入E.coli DH5α菌,得到脾脏细胞的cDNA文库。筛选出阳性重组子,测序并分析得到的ESTS序列。结果：成功地构建了双阳型梅花鹿脾脏细胞cDNA文库;并对部分库容cDNA进行了克隆和测序,在这一过程中发现4个与已知基因同源的表达序列标签(ESTS),其中2个EST分别是梅花鹿视网膜母细胞瘤的同源基因和梅花鹿维生素K依赖性蛋白前体cDNA的部分序列。结论：通过构建cDNA文库的方法成功地得到了一批有价值的梅花鹿的基因片段。     

人幽门螺杆菌HspA亚单位的基因克隆及序列分析

目的:获取幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A( HspA)亚单位基因并进行核苷酸序列分析和同源性比较.方法:获取幽门螺杆菌的染色体DNA,PCR技术扩增获取HspA基因,将其定向插入pGEX-4T-1原核表达载体中进行核苷酸序列分析.结果:经酶切鉴定及基因序列证实Hp HspA基因克隆成功,DNA序列与Genbank 公布的序列比较有13个碱基存在差异,同源性为96%;由碱基序列推定编码的氨基酸残基序列没有发生变异,同源性为100%.结论:成功地将Hp HspA基因克隆到了pGEX 4T-1原核表达载体,为HspA的表达和研究奠定了实验基础.     

小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因的克隆和序列分析

目的：克隆小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因的全长编码区cDNA。方法：利用RT-PCR方法,从Balb／c小鼠脾细胞的mRNA中扩增T-bet基因全长cDNA,并将其连接到pGEM-T载体上,进行测序和核酸分析。结果：扩增得到的小鼠T-bet基因cDNA全长1592bp,编码530个氨基酸,包含一个189个氨基酸残基组成的能与T盒DNA结合的结构域;blast结果分析表明,该cDNA与Genbank中发表的序列具有99．8％的同源性。结论：获得小鼠T-bet基因的克隆,为进一步研究转基因免疫干预奠定了基础。     

兔肝细胞生长因子蛋白质结构及功能分析

目的分析兔肝细胞生长因子(HGF)基因序列及其表达的蛋白质结构和功能信息。方法利用计算机软件对兔肝细胞生长因子c DNA序列进行分析和比较,并对编码的蛋白质氨基酸序列进行分析和预测。结果兔肝细胞生长因子是我们首次扩增出的兔HGF基因序列。实验获得了两种全长的兔HGF c DNA序列,命名为兔HGF-1和兔HGF-2。兔HGF-1由2299碱基对组成,编码了762个氨基酸;兔HGF-2由2320碱基对组成,编码了769个氨基酸。兔HGF c DNA序列和氨基酸序列与人HGF和鼠HGF高度同源。以兔HGF-2蛋白为例进行全面的蛋白序列分析。兔HGF-2蛋白包括一段由32个氨基酸组成的信号肽,有多个磷酸化和蛋白酶切位点。兔HGF-2蛋白为分泌型蛋白,稳定蛋白。Grand average of hydropathicity(GRAVY)亲水性评估:-0.606,该蛋白为亲水蛋白。结论兔肝细胞生长因子与人肝细胞生长因子高度同源,兔肝细胞生长因子蛋白作为一种新的蛋白质,为应用其作为人类冠心病基因治疗提供可靠的动物实验依据。     

人Hrs cDNA的克隆与序列分析

以小鼠ＨｒｓｃＤＮＡ为探针从人胎盘ｃＤＮＡ文库中克隆出人ＨｒｓｃＤＮＡ，其全长为２９１０ｂｐ，所编码的蛋白质含７７７个氨基酸。人ＨｒｓｃＤＮＡ与小鼠ＨｒｓｃＤＮＡ间高度保守。推定的氨基酸序列含有锌指样结构域、脯氨酸丰富区及脯氨酸、谷氨酰胺丰富区。     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段的克隆与分析

目的：获得杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段。方法：根据Dunaliella tertiolecta、衣藻、团藻等生物硝酸盐还原酶(nitrate reductase,NR)高度保守序列EGWWFKP、WNVMGMM设计一对简并引物,以含硝酸盐培养基培养的的盐藻cDNA为模板,进行PCR扩增,产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,经筛选后测序,将测序结果推导成氨基酸序列,并与Dunaliella tertiolecta、团藻、衣藻、小球藻等进行同源性分析。结果：在盐藻中所获得的cDNA片段,核苷酸长度为381bp,编码127个氨基酸。推导的氨基酸序列与下列物种的硝酸盐还原酶进行同源性比较：Dunaliellal teriolecta为88．2％同源,团藻为78％,衣藻为67％,小球藻为59％。结论：所克隆的序列为盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段。     

一个新的胎肝发育相关因子cDNA的克隆与序列分析

目的:从胎肝cDNA文库中,分离胎肝发育相关新cDNA。方法:分离纯化胎肝组织RNA,构建cDNA文库、T-A克隆、核酸自动测序及生物信息学分析。结果:分离克隆一个新的cDNA片段,编码71个氨基酸多肽,并且与肝脏生长/分化因子9部分同源。申请加入国际基因库,登录号为:GenbankAF157027。结论:该新cDNA(GenbankAF157027)编码的多肽可能调控肝脏的发育。     

简并引物在克隆盐藻热休克蛋白70基因家族中的应用

目的：利用简并引物扩增盐藻热休克蛋白70(hsp70)家族。方法：根据衣藻、矮牵牛花等真核生物hsp70氨基酸高度保守序列didlgtt，dqgnrttp，payfnds和ATKDAG设计2对简并引物，以盐藻hsp70 cDNA为模板进行巢式PCR扩增，产物经T-A克隆转化至JM109大肠杆菌中，经筛选后测序，将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果：得到2个分别为372bp和354bp编码126及118个氨基酸残基的部分cDNA片段。推导的氨基酸序列与衣藻、矮牵牛花、番茄、果蝇和酵母hsp70和hsp70b比较有高度同源性。结论：所克隆的序列为盐藻hsp70和hsp70b部分cDNA片段。利用简并引物筛选cDNA文库是克隆基因家族重要的方法。     

日本血吸虫精氨酸编码基因CDNA的分离和序列分析

【目的】分离和鉴定日本血吸虫(Schistosomajaponicum,S.j)新基因。【方法】应用免疫学方法筛选S.jcDNA文库获得阳性克隆;通过PCR直接序列测定技术,表达序列标签（EST）同源性检索对阳性克隆插入片段进行鉴定;采用亚克隆技术及生物信息学等技术,对获得的日本血吸虫精氨酸酶编码基因序列进行结构与功能的分析。【结果】获得了一个含1061bp外源插入片段的阳性克隆,其cDNA序列含有一个840bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酸酶家族,与国际蛋白质库中的酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44%,50%,51%,53%和54%。【结论】获得了编码日本血吸虫精氨酸酶编码基因全长cDNA,为日本血吸虫精氨酸酶基因功能的研究奠定了基础。     

AdPPO4基因部分序列的cDNA克隆与序列分析

目的克隆大劣按蚊(An dirus)前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)基因部分序列.方法根据已报道的多种昆虫以及冈比亚按蚊PPO基因编码的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊幼虫总RNA为模板进行RT-PCR扩增,目的片段经TA克隆后测定其核苷酸序列,然后进行序列查询与比对.结果从大劣按蚊幼虫中获得的PPO4基因(AdPPO4)部分序列长597 bp,编码199个氨基酸;AdPPO4与冈比亚按蚊PPO4基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达84%和90%.结论从大劣按蚊幼虫中成功地克隆出了AdPPO4基因的部分序列,与冈比亚按蚊PPO4基因具有很高的同源性.     

杜氏盐藻RbcS基因cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆杜氏盐藻-，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶(RuBisCO)小亚基RbcS cDNA片段。方法：根据莱茵衣藻、团藻、玉米等真核生物的RuBisCO小亚基RbcS氨基酸的高度保守序列ETRSYLPP和MNKLPMFG，设计一对简并引物，采用RT—PCR方法及该简并引物克隆杜氏盐藻RbcS cDNA。PCR产物经T—A克隆与T-vector相连，转化大肠杆菌JM109，随机挑取数个菌落，筛选鉴定，对阳性克隆进行测序分析。将测序结果推导成氦基酸序列进行同源性比较。结果：得到的cDNA长度为209bp，编码69个氨基酸。推导的氦基酸序列与团藻、Chloromonas sp．ANT3、衣藻、伞藻、菠菜、玉米的Rbc S相比较，同源性分刖为85％、84％、82％、76％、70％、69％。结论：所克隆的序列为杜氏盐藻RbcS DNA片段。