不同年龄兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性分析

目的观察不同年龄兔骨髓间充质干细胞(BMSC)在体外分离、培养、扩增的过程,并对其生长特性进行初步比较分析,为BMSC的临床应用提供技术方法和依据。方法选取出生1月、18月、36月的健康中国白兔,分成新生、成年、老年3组,采用密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合,分离培养BMSC,用噻唑蓝(MTT)法观察其增殖及生长特征,用流式细胞仪检测细胞表面标志。结果各组BMSC均贴壁生长,呈成纤维细胞样BMSC典型形态,贴壁率的观察和生长曲线显示,在相同的培养条件下,新生兔细胞增殖最快,细胞可扩增能力最强,而老年兔细胞增殖最慢,细胞可扩增能力最弱,成年兔细胞介于两者之间。结论利用密度梯度离心法结合贴壁培养法可以从不同年龄兔中获得高纯度的BMSC,干细胞的活性和增殖能力随着年龄的增加而降低。     

成人骨髓间充质干细胞体外向视网膜细胞的诱导分化

目的研究取材于成人骨髓的间充质干细胞在一定诱导条件下向视网膜神经细胞的分化。方法成人骨髓经密度梯度离心得到的细胞,根据其高黏附特性体外培养获得间充质干细胞。利用流式细胞仪分析其细胞表型,在体外诱导使其向视网膜神经细胞分化并用免疫荧光法进行鉴定。结果从骨髓中分离培养的细胞具有成纤维细胞样形态,贴壁生长,表型相对均一,表面标志为CD90、CD44、CD147阳性;而CD34、CD38、CD45、CD14、HLA-DR阴性。体外诱导后可以得到表达nestin(神经干细胞标志物)、GFAP(神经胶质细胞标志物)和Rhodopsin(视网膜光感受器细胞标志物)阳性的细胞。结论从人骨髓中分离培养得到的间充质干细胞具有向视网膜神经细胞分化的潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与培养

目的 建立体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞传代培养.倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征,测定细胞生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物,取第3代细胞分别加入成骨、成脂诱导剂并采用碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.传至第3代细胞纯度可达97%以上,其细胞表型CD29、CD44、CD105、CD166呈阳性表达,CD34、CD80、CD86呈阴性表达.经成骨诱导后细胞碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色呈阳性,成脂诱导后细胞油红O染色呈现阳性.结论 应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠bMSCs,培养的细胞扩增迅速、生物学特性稳定,是一种较为理想的体外分离扩增bMSCs的培养体系.     

鹿茸精诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的:探讨鹿茸精体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法:通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外扩增培养。鹿茸精定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。鹿茸精诱导3小时后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论:鹿茸精可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离和培养方法。方法取SD大鼠骨髓冲洗液,去掉经自然沉淀的血凝块、骨组织、肌肉组织、筋膜组织等沉淀物,离心收集大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,通过显微镜观察大鼠骨髓间充质干细胞的生物学形状。结果原代培养的呈梭形、多边形或星形,这3种细胞中梭形细胞最多,传代后仍具有较强的增殖能力,经过2~3次传代培养,细胞融合生长时,呈放射状或旋涡状生长。结论骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓网状间质的非造血干细胞,在不同的诱导条件下,可向心肌细胞、神经细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等中胚层细胞分化。     

HSV-1体外感染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:在体外原代培养大鼠骨髓间充质干细胞,观察单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染骨髓间充质干细胞情况。方法:分离骨髓间充质干细胞,并对其作鉴定。用HSV-1感染骨髓间充质干细胞,提取总DNA,PCR法扩增骨髓间充质干细胞内的HSV-1特异性片段。结果:骨髓间充质干细胞经14d诱导后,碱性磷酸酶含量增高,形成钙结节,表现出成骨细胞特性。HSV-1感染骨髓间充质干细胞,细胞出现典型的病变,PCR法成功扩增出骨髓间充质干细胞内的HSV-1特异性片段。结论:大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。HSV-1可以在体外感染骨髓间充质干细胞。     

组织工程心脏瓣膜体外构建的初步研究

目的:初步体外构建组织工程人工心脏瓣膜。方法:种子细胞选用胸骨骨髓,抽取后分离出人骨髓间充质干细胞,体外培养,扩增待用。脱细胞瓣膜支架的构建应用破膜剂曲拉通-脱氧胆酸钠对新鲜猪主动脉瓣膜36片(实验组)进行处理48h后,与对照组未经处理的猪主动脉瓣膜(36片)进行对比,在光镜和电镜下观察脱细胞效果。将人骨髓间充质干细胞接种于脱细胞瓣膜支架上静态培养7d,观察细胞-支架复合体生长状况。结果:曲拉通-脱氧胆酸钠法脱细胞彻底,保持原有纤维结构。种植的人骨髓间充质干细胞7d后可生长于瓣膜支架的表面。结论:曲拉通-脱氧胆酸钠法是一种较为理想的猪瓣膜脱细胞方法;人骨髓间充质干细胞能在脱细胞猪瓣膜支架上较好地黏附和生长,从而初步构建组织工程人工心脏瓣膜。     

人骨髓来源间充质干细胞的体外分离方法及鉴定

目的探讨人骨髓来源间充质干细胞的体外分离方法及鉴定。方法密度梯度离心从人骨髓分离单个核细胞,接种培养3h后频繁换液,培养至第14d时用0.25%胰酶室温作用2min移种后继续培养至第21d。采用流式细胞术检测收获细胞的表型分子。收获细胞在特定条件下诱导培养至第14d,分别采用茜素红染色、甲苯胺蓝染色和油红染色进行鉴定。结果第21d时均一的长梭状成纤维样细胞铺满瓶底,它们高表达CD105、CD73、CD90并低表达CD45、CD34和CD14,能够被诱导分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。结论密度梯度离心法结合贴壁筛选可以成功地从人骨髓分离获得间充质干细胞,接种初期频繁换液体及后期控制胰酶作用时间可以有效减少造血系细胞混杂。     

人脐血源性间充质干细胞的体外培养及生物学鉴定

目的 建立体外培养、扩增人脐带血间充质干细胞(MSCs)的方法．初步鉴定其生物学特性。方法 无菌条件下取正常足月剖宫产的脐带血,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞．以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细咆层,测定MSCs的生长曲线．用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果 来源于脐血的单个核细胞存体外用合适的培养基培养,细胞贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞。间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达MSCs相关的抗原CD29、CD44、CD105。但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。这与源于骨髓的MSCs一致。结论 脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够为实验和临床的应用提供一种新的间充质干细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养、扩增与鉴定

目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性.方法:采用密度梯度离心法和贴壁筛选法纯化MSCs,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果:原代MSCs呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状排列.传代后大都均匀分布生长,细胞生长迅速,倍增时间约45.5 h.流式细胞术鉴定表明,培养的第3代和第5代MSCs CD44、CD29阳性,CD45和CD34阴性.结论:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法可成功分离和培养大鼠的骨髓MSCs,MSCs可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

MSCs分离培养及定向分化为血管内皮细胞的研究

目的建立分离和培养大鼠骨髓源间充质干细胞（MSCs）的方法及定向分化为血管内皮细胞诱导条件的优化。方法淋巴细胞分离液（比重1．077g／m1）密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC），在含10％胎牛血清L—DMEM培养基中培养，并传代扩增MSCs；选取状态较稳定的第4代细胞，分别用含10％胎牛血清和2％胎牛血清的诱导液（终浓度为10ng／mlVEGF、2ng／mlbFGF的DMEM培养液）继续培养，于第7、14天用流式细胞术分析CD34的表达情况，免疫组化法观察FVⅢ的表达情况。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs，细胞呈均一的成纤维细胞样，流式细胞术分析MSCs结果显示，CD34阳性率为1．01％、CD29阳性率为97．32％；诱导14d后免疫组织化学法检测FVⅢ的表达，10％和2％胎牛血清诱导体系细胞的阳性率分别为12．21％和91．43％。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs；就诱导效果而言，2％胎牛血清诱导体系明显好于10％胎牛血清诱导体系，说明低浓度的胎牛血清更有利于MSCs向血管内皮细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的比较研究

目的 比较Ficoll密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)与全骨髓培养法之间的差异,以期建立一种简便、实用的基于临床移植需要的MSCs分离方法.方法 分别应用上述两种方法分离MSCs,比较用两种方法的细胞形态、MSCs细胞得率及以及细胞表面标志的差异.结果 两种方法均能有效培养出骨髓MSCs,且获得的第二代MSCs细胞形态无明显差异,细胞形态均一,为长梭形或三角形.5 ml骨髓细胞分离培养后,Ficoll密度梯度离心法获得的MSCs细胞总数显著小于全骨髓培养法(t=.639,P＜0.01).Ficoll密度梯度离心法与全骨髓培养法获得的第二代MSC8 CD29、CD105、CD105、CD34阳性表达率的差异无统计学意义(t分别为0.809、0.659、0.277、0.191,P均＞0.05),但前者的HLA-DR阳性表达率明显低于后者,差异具有统计学意义(t=2.347,P＜0.05).结论 与Ficoll密度梯度离心法相比较,全骨髓培养法分离MSCs具有培养时间较短,细胞得率较多的优点,虽纯度相对较低,但仍是一种较好的MSCs分离方法.     

川续断皂苷Ⅵ诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的研究

目的探讨川续断皂苷Ⅵ(akebia saponin D)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的影响。方法用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,选择合适的培养基,传代扩增。采用不同浓度的川续断皂苷Ⅵ对大鼠MSCs定向诱导分化,MTT法观察各组对MSCs的增殖作用并绘制细胞生长曲线;观察MSCs诱导分化过程中成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaliphosphatase,ALP)活性;采用ELISA法检测MSCs诱导分化过程中骨钙素(Osteo-calcin,OC)的含量;RT-PCR方法检测MSCs诱导分化过程中核心结合因子α-1(Cbfα1)mRNA表达。结果细胞生长曲线显示各组MSCs数量均随时间延长而增加,中、高浓度的川续断皂苷Ⅵ能明显提高MSCs分化为成骨细胞的ALP活性和骨钙素的含量,且使Cbfα1 mRNA的表达升高。结论川续断皂苷Ⅵ具有促进大鼠体外MSCs向成骨细胞增殖和分化的作用,这一作用可能与其升高Cbfα1 mRNA的表达有关。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性

目的探讨人骨髓来源MSCs的分离、培养和生物学特性,为骨组织工程提供种子细胞。方法从捐赠者髂骨穿刺收取骨髓细胞,采用密度梯度离心和贴壁培养法进行培养和纯化BMSCs,取生长良好的P3或P4代BMSCs进行检测：①MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析;②流式细胞仪检测BMSCs细胞表面抗原标记和细胞增殖周期;③免疫荧光分析细胞骨架;④细胞染色体核型分析;⑤成骨细胞诱导分化及检测。结果①利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法分离人BMSCs,经传代后细胞形态呈梭形,均匀一致。②MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析结果显示BMSCs在传代后经历潜伏期、对数生长期和平台期。③流式细胞仪检测显示所获得的BMSCs表面抗原标记高度一致。④BMSCs细胞周期检测结果为G0＋G1期91.3%、G2期4.1%和S期4.6%。⑤微管微丝免疫荧光染色结果显示,培养的BMSCs具有良好的细胞骨架系统。⑥第7代的BMSCs染色体检测结果显示,被测标本有正常染色体数目（2n=46,XY）,且未见染色体异常。⑦成骨诱导后,Von kossa和茜素红染色均呈阳性。结论从人骨髓中能分离出高度一致的BMSCs,这些细胞具有正常细胞骨架结构以及正常的人类染色体数目和形态,具有向成骨细胞分化能力,可作为骨组织工程的种子细胞。     

五羟色胺对人骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的探讨五羟色胺（serotonin,5-HT）对人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBM-MSCs）体外增殖的影响。方法从捐赠者髂骨穿刺抽取骨髓细胞,采用密度梯度离心和贴壁培养法进行培养和纯化hBM-MSCs,取生长良好的P3或P4代hBM-MSCs,通过用含不同浓度5-HT的条件培养基分组对hBM-MSCs进行干预,观察24、48及72h,MTS检测评估细胞增殖情况,流式细胞仪检测hBM-MSCs凋亡率。结果 （1）MTS检测结果显示随着观察时间延长,5-HT浓度增加,细胞存活率逐渐降低。在无血清情况下,存活率最低可达59.5%（P〈0.05）。（2）流式细胞仪检测结果显示5-HT作用hBM-MSCs 48h后,随着浓度增加,细胞凋亡率升高。在5-HT为1000μM时,凋亡率为21.42%。结论 5-HT对体外培养的hBM-MSCs具有凋亡作用,在无血清情况下,凋亡作用愈明显。     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞的生长特性。方法在无菌条件下,取大鼠骨髓,采用密度离心法和全骨髓贴壁法联合培养并结合传代获取、纯化细胞,倒置显微镜观察其形态,流式细胞术检测其表面抗原CD29、CD90及CD34的表达。CCK-8法测定第1、3代细胞的增殖情况,并绘制其生长曲线。结果经全骨髓贴壁法和密度梯度离心联合培养,所得到的原代细胞形态呈椭圆形、圆形、三角形,接近融合状态时可呈现均一的长梭形,排列规则。传至第8代时,细胞的增殖能力减弱,其形态宽大畸形,呈树枝状。经流式细胞仪检测,所分离的细胞CD29的表达率为94.97%,CD90的表达率为88.50%,CD34的表达率为2.23%。CCK-8法显示第3代细胞有较强的增殖能力。结论体外培养的大鼠BMSCs是骨组织工程的优良种子细胞。     

骨髓间充质干细胞旁分泌HGF体外调控肝星状细胞

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）与肝星状细胞（HSCs）体外共培养体系中,BMSCs旁分泌肝细 胞生长因子（HGF）对 HSCs 增殖、凋亡、活化的影响。方法 全骨髓贴壁法分离、培养、纯化大鼠 BMSCs,另培养 HSCs。6 孔板半透膜建立上下两层细胞非直接接触共培养体系,实验设 H 组（HSCs 单独培养）、H-H 组（HSCs 与 HSCs共培养）、M-H组（BMSCs与HSCs共培养）、M-H-C组（BMSCs与HSCs共培养并加c-met抑制剂）,各组细胞培 养48 h后,流式细胞仪鉴定BMSCs,检测HSCs凋亡率,MTT法检测HSCs的增殖,免疫荧光共聚焦定量检测HSCs中 α-肌动蛋白（α-SMA）的表达量,ELISA法检测共培养体系上清液中HGF的浓度。结果 MSCs高表达阳性表面分子 CD29、CD90,低表达造血细胞表面标记CD45;BMSCs能明显抑制HSCs的增殖、活化并促进其凋亡,且M-H组上清液 中HGF的浓度明显高于其他组。结论 BMSCs与HSCs共培养过程中,BMSCs通过旁分泌HGF促进HSCs的凋亡,抑 制HSCs的增殖、活化。     

A simple method for enrichment of polychromatic erythroblasts from rat bone marrow, and their proliferation and maturation in vitro

To evaluate the effects of a variety of chemical, biological and physiological stimuli on erythropoiesis, in vitro assays using erythroid progenitor cells from humans or laboratory animals are well-known methods. On the other hand, little has been reported on in vitro assays using mature erythroblasts such as polychromatic erythroblasts. In the present study, we established a convenient method for enrichment of polychromatic erythroblasts from rat bone marrow and confirmed their development in vitro. To establish a method for the enrichment of polychromatic erythroblasts, bone marrow cells from 3- and 10-week-old rats were separated by discontinuous density gradient centrifugation using Percoll. As a result, polychromatic erythroblasts were most highly enriched in the bone marrow fraction from 3-week old rats at the density interface between 1.040 and 1.058 g/ml. The enriched polychromatic erythroblasts were then cultured in growth medium supplemented with 20% fetal bovine serum in the presence or absence of erythropoietin for 48 hr. During the culture period, cell proliferation and maturation to orthochromatic erythroblasts were observed, and intracellular heme contents were also increased. In particular, the culture in the presence of erythropoietin revealed higher proliferation of erythroid cells, and therefore might be more appropriate for in vitro experiments on the effects of various stimuli on late-stage erythropoiesis.     

正常人骨髓间充质干细胞体外对K562细胞生长及分化抗原表达的影响

目的 探索正常人骨髓间充质干细胞(MSCs)对K562细胞增殖及表面分化抗原表达的影响.方法 分别将K562细胞悬浮培养及与MSCs黏附培养,绘制K562细胞生长曲线;用流式细胞术检测K562细胞周期及表面分化抗原的表达.结果 与悬浮培养比较,与MSCs黏附培养的K562细胞增殖受抑,G0/G1期细胞增加(P<0.05),G2/M期细胞增加(P<0.05),而S期细胞减少(P<0.05);但悬浮培养与黏附培养在细胞分化抗原的表达上没有明显的影响.结论 K562细胞与MSCs黏附培养可以抑制K562细胞的生长,但对其分化没有明显的影响.