结肠癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化状态、mRNA表达变化及意义

目的观察结肠癌组织中RAS相关区域家族1A（RASSF1A）基因启动子甲基化状态、mRNA表达变化,并探讨其意义。方法分别采用甲基化特异性PCR（MSPCR）和RT-PCR技术检测80例结肠癌及癌旁正常结肠组织中RASSF1A基因启动子甲基化、mRNA。结果 80例正常结肠组织中RASSF1A基因启动子未见甲基化,80例结肠癌组织中RASSF1A基因启动子出现甲基化者58例,两者相比,P〈0.05。正常结肠组织均可检测到RASSF1A基因mRNA,结肠癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化者未检测到RASSF1A基因mRNA、未甲基化者可检测到RASSF1A基因mRNA。RASSF1A基因启动子甲基化与结肠癌病理分型、淋巴结转移、远处转移和Dukes分期有关（P均〈0.05）。RASSF1A基因mRNA的表达与结肠癌Dukes分期有关（P〈0.05）。结论结肠癌组织中RASSF1A基因启动子出现甲基化,RASSF1A基因启动子甲基化者RASSF1A基因mRNA表达缺失,这可能与结肠癌的发生发展及转移有关。     

黑色素瘤相关抗原A1在肝癌细胞株中的表达与基因甲基化程度的相关性

目的 探讨人肝癌细胞株中黑色素瘤相关抗原A1(MAGE-A1)表达状况与肝癌细胞基因甲基化的关系。方法 提取10种人肝癌细胞株的总RNA,用逆转录聚合酶链反应对细胞株的MAGE-A1基因的表达进行检测;提取10种人肝癌细胞株的基因组DNA,用限制性酶切和Southern印迹杂交对每种细胞的基因组甲基化程度进行定量分析。另外对基因组DNA行HpaⅡ酶切后,用引物CDS21、EDP4和CDS20、EDP4进行聚合酶链反应扩增,然后用特异性探针杂交来检测肝癌细胞株MAGE-A1启动子的甲基化状态。用特异性序列聚合酶链反应方法检测每一种细胞株的人白细胞抗原-A位点型别。结果 QGY-7703、SMMC-7721、HLE、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405肝癌细胞株的MAGE-A1基因表达阳性,且细胞分化程度均为中低分化;HepG2 2．2．15、HepG2、QGY-7701和Huh7肝癌细胞株的MAGE-A1基因表达阴性,且细胞分化程度均为高中分化。通过定量分析表明,MAGE-A1表达的肝癌细胞株与MAGE-A1不表达的肝癌细胞株比较,前者基因组甲基化程度较低(t=2．896,P=0．02)。肝癌细胞株MAGE-A1基因启动子区甲基化分析结果表明HepG2 2．2．15、HepG2、QGY-7701和Huh7为高甲基化,SMMC-7721、HLE、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405为低甲基化。结论 肝癌细胞株MAGE-A1 mRNA表达与其基因甲基化程度有关。     

肝癌细胞中OY-TES-1基因启动子的甲基化状态

目的:研究肝癌细胞株OY-TES-1启动子的甲基化状态及甲基转移酶抑制剂对其启动子甲基化的影响.方法:运用生物信息学在线软件预测OY-TES-1启动子区域及转录因子结合位点;应用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite-sequencing PCR,BSP)分析目的基因CpG位点的甲基化状态;用甲基转移酶抑制剂5-Aza-...     

原发性肝癌患者CDH1基因启动子甲基化检测的临床意义

目的 探讨原发性肝癌（PHC）患者CDH1基因启动子甲基化的情况，观察它们与临床病理特征之间的关系。方法 100例PHC患者根据肿瘤有无包膜、肿瘤直径、HBsAg是否表达阳性、分化情况、有无肝内转移及分期情况分组。并选择20例健康成年人作正常对照组。分别检测组和健康组血液中的CDH1基因启动子甲基化的情况，并对手术病人检测肝样本中的CDH1基因肩动子甲基化的情况。同时检测PHC组肝样本中的CDHl蛋白表达情况。结果 PHC组CDH1基因启动子甲基化比率高于健康组；血样和肝样中的CDH1基因启动子甲基化与有无包膜、肿瘤直径、HBsAg是否表达阳性、分化情况、有无肝内转移及分期等密切相关；CDH1基因启动子高甲基化的CDHl蛋白表达减少。结论 FHC的转移、增殖可能与CDH1基因启动子甲基化有关，对术后患者定期检测CDH1基因启动子甲基化情况可以判断预后。     

结肠癌中DCC基因启动子甲基化及其临床意义

目的探讨DCC基因启动子甲基化在结肠癌发生发展过程中的作用及其临床意义。方法采用RT-PCR方法检测DCC基因表达,用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测DCC基因启动子甲基化。结果在结直肠癌组织中DCC基因甲基化启动子甲基化频率与浸润深度无关(P0.05);而与肿瘤组织分化程度、临床分期密切相关(P0.05)。DCC基因启动子甲基化频率在低或未分化组、C、D期组均高于其对应的高或中分化组和A、B期组(P0.05)。结论 DCC基因启动子甲基化和DCC蛋白表达在正常组织,结肠癌的癌旁组织和原发癌灶间存在显著的差异,可能与结肠癌的发生发展有关,可作为判断结直肠癌生物学行为的一个指标。     

肝细胞癌中RIZ1基因甲基化的研究

采用甲基化特异PCR法(MSP)检测了38例肝细胞癌(HCC)标本中RIZ1基因启动子在HCC中的甲基化状态,为HCC的发生发展提供新的依据.     

急性白血病ZO-1基因启动子区甲基化状态分析及其临床意义

目的 探讨紧密连接蛋白-1(Zonula occludens-1,ZO-1)基因启动子区甲基化状态在人急性白血病(AL)发生、发展中的作用及作为通用性基因标志物的临床意义.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测白血病细胞系HL60、Molt4、NK92和40例非恶性血液病以及81例AL骨髓ZO-1基因启动子区的甲基化状态.结果 ZO-1基因启动子区在白血病细胞系中呈完全甲基化状态;而在40例非恶性血液病标本中均为非甲基化;81例AL标本中甲基化阳性率为60.49%(49/81),其中难治复发组为92.86%(13/14),高于初诊未治疗组65.85%(27/41)及完全缓解组34.62%(9/26);急性髓细胞白血病组61.54%(32/52)与急性淋巴细胞白血病组58.62%(17/29)比较差异无统计学意义.结论 首次证明ZO-1基因启动子区高甲基化状态在人AL中具有较高的特异性,与疾病发生、发展密切相关,可作为一个新的白血病通用分子标志.     

黑色素瘤抗原基因MAGE-A1在直肠癌组织的表达

[目的]检测黑色素瘤抗原基因MAGE-A1在直肠癌组织中的表达,探索其与直肠癌临床病理的关系及其在直肠癌免疫治疗中的应用价值。[方法]采用RT-PCR法,对66例直肠癌患者的癌组织、癌旁"正常"黏膜组织和手术切缘组织(乙状结肠端)以及3例直肠息肉标本(无瘤)的MAGE-A1的表达情况进行检测,并对RT-PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA测序验证。[结果]66例直肠癌患者的直肠癌组织、癌旁"正常"黏膜组织、手术切缘组织MAGE-A1基因的表达阳性率分别为30.30%(20/66)、12.12%(8/66)、12.12%(8/66),3例直肠息肉标本未见MAGE-A1表达。肿瘤组织MAGE-A1基因表达阳性率均显著高于癌旁"正常"黏膜组织、手术切缘组织(P0.05);而与年龄、性别、组织学类型、Dukes分期及淋巴结转移无关(P0.05)。[结论]基于MAGE-A1基因在直肠癌中的高表达率,MAGE-A1表达蛋白可以作为一种有前途的靶点用于免疫治疗,同时有望成为一种筛查和随访指标。     

结肠癌细胞株p16基因甲基化的研究

目的　研究结肠癌中ｐ１６ 基因的失活方式．方法　采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 法鉴定了结肠癌细胞株ＳＷ４８０ ,Ｃｏｌｏｎ２０５ ,ＨＲ８３４８ ,ＨＴ２９ ,Ｃｏｌｏ３２０ ,ＬＳＩＧＴ９６９５ 及１８ 例正常结肠粘膜组织中ｐ１６ 基因的甲基化情况．结果　在６ 株结肠癌细胞株中有５ 株（８３－３ ％ ） ｐ１６ 基因ＣｐＧ岛呈异常甲基化状态,与之相对,１８ 例正常结肠粘膜组织中仅５ 例（２７－８ ％ ） 表现为异常甲基化．结论　在结肠癌中ｐ１６ 基因因异常甲基化而失活,这为结肠癌的基因治疗提供了新策略、新目标     

IRX1在胰腺癌中的表达及其启动子区甲基化状态

目的 检测胰腺癌的易洛魁族同源盒基因(IRX1)的表达及其启动子区的甲基化状态,探讨两者间的相关性.方法 采用实时PCR法检测12例胰腺癌组织及6株胰腺癌细胞株的IRX1 mRNA 表达.基因序列分析IRX1基因启动子区结构.应用甲基化抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理胰腺癌细胞,采用甲基化特异性PCR(MSP)、非甲基化特异性PCR (USP)及实时PCR检测处理前后IRX1启动子甲基化状态和IRX1 mRNA表达.结果 胰腺癌组织IRX1 mRNA的表达量为0.31±0.11,显著低于癌旁正常胰腺组织的1.05±0.32(P ＜0.01).胰腺癌细胞AsPCl、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表达量分别为0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02,均显著低于人肾上皮293细胞的1.03±0.28(P＜0.05或＜0.01).IRX1基因启动子区富含CpG岛.各胰腺癌细胞株IRX1基因启动子CpG岛对应位点均有甲基化,经5-Aza-dC处理后甲基化状态得以逆转,IRX mRNA的表达也得以恢复.结论 胰腺癌的IRX1 mRNA表达下降,与其IRX1基因启动子区CpG岛高甲基化状态相关.     

RASAL1基因启动子甲基化及RAS活性与结肠癌临床病理的关系

目的:检测RASAL1(ras GTPase-activatinglike protein 1)基因甲基化率及RAS活性在人结肠癌组织中的表达,探讨其与临床病理资料间的关系.方法:以40例结肠癌标本为研究对象,相应的正常组织标本为对照.甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测RASAL1启动子CpG岛甲基化状态,免疫共沉淀法检测RAS活性,分析肿瘤组织中RASAL1基因甲基化率及RAS活性与临床病理参数间的关系.结果:40例肿瘤组织中有26例检测出RASAL1基因甲基化(26/40,67.5%),对照组40例中有12例出现甲基化(12/40,30%),肿瘤组织甲基化率明显高于正常组织(P=0.0017).肿瘤组织中RAS活性的中位数为1.07,正常组织中RAS活性的中位数为0.52,P<0.001,差异有统计学意义.结肠癌组织中RASAL1基因的甲基化率、RAS活性与患者肿瘤分化程度、侵袭深度、淋巴结转移、TNM分期有统计学差异(均P<0.05).结论:RASAL1甲基化状态与RAS活性增加有关,可能在结肠癌的发生发展中起重要作用.抑制RASAL1甲基化及RAS活性,可能成为治疗结肠癌的新靶点.     

胃癌错配修复基因hMLH1突变和启动子甲基化与基因不稳的关系

目的　探讨胃癌hMLH1突变和甲基化异常与微卫星不稳 (MSI)的关系。方法　采用二维DNA电泳和DNA测序技术检测hMLH1突变 ;采用甲基化特异性PCR检测hMLH1启动子区的甲基化状态 ;采用PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳。结果　 6 8例胃癌中检出hMLH1基因突变 3例 ,突变率为 4 .4 %。hMLH1突变与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度和临床病理分期无显著相关。正常胃黏膜未见hMLH1高甲基化。 6 8例胃癌中检出hMLH1高甲基化 11例 ,占 16 .2 % ,均为去甲基化和高甲基化并存。将MSI分为高频率MSI(MSI H ,≥ 2个位点 ) 8例、低频率MSI(MSI L ,仅为 1个位点 ) 9例和MSI阴性 (MSS) 5 1例三组 ,结果 3例hMLH1基因突变均发生于MSI H组 ,而MSI L和MSS组未见有突变者。MSI H组hMLH1高甲基化的检出率显著高于MSI L和MSS组 (P <0 .0 1～ 0 .0 0 1)。结论　hMLH1突变和高甲基化可能参与了MSI病理途径。     

遗传性非息肉病性结直肠癌错配修复基因MLH1启动子甲基化研究

目的了解中国人遗传性非息肉病性结直肠癌中MLH1基因启动子区CpG岛的过度甲基化现象。方法在错配修复基因微小突变检测和大片段缺失检测等实验的基础上,对47例DNA标本进行硫化处理,然后采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测标本中MLH1基因启动子的甲基化情况。结果47例标本中发现6例存在MLH1基因启动子过度甲基化,检出率为12.8%,其中4例表现为完全甲基化,2例表现为部分甲基化。结论MLH1基因启动子过度甲基化现象在遗传性非息肉病性结直肠癌中发生率较高,是HNPCC发病的相关因素之一。过度甲基化现象的研究有助于致癌机制的进一步探讨和揭示。     

BRCA1基因启动子异常甲基化与散发性乳腺癌的关系

目的 探讨散发性乳腺癌BRCA1基因启动子异常甲基化状况及其与散发性乳腺癌关系。方法 用甲基化特异PCR（MSP）法对散发性乳腺癌病人癌组织、癌旁组织及乳腺纤维腺瘤组织进行BRCAl异常甲基化检测。结果 在58例散发性乳腺癌中有17例癌组织检出了BRCAl基因启动子异常甲基化，甲基化频率为29．3％（17／58），相应的癌旁组织及乳腺纤维腺瘤组织均只检出未甲基化的BRCAl。在组织分型中，浸润性导管癌与浸润性小叶癌无显著差异（P〉0．05），二者各自与髓样癌＋黏液腺癌有显著差异（P〈0．05）。有淋巴结转移的BRCA1基因启动子甲基化率高于无淋巴结转移组（P〈0．005）。BRCA1甲基化与散发性乳腺癌的肿瘤分级及病人绝经与否均无显著差异（P〉0．05）。结论 在散发性乳腺癌中，BRCA1基因启动子具有很高的甲基化率，并与散发性乳腺癌的组织分型、恶性转移等方面有一定的关系。     

p16、hMLH1基因甲基化与结肠癌的相关性研究

目的检测正常黏膜、结肠腺瘤、结肠癌中p16、hMLH1基因CpG岛甲基化状态,评价其在结肠癌发生中的作用及临床意义。方法收集四川省人民医院2008年10月～12月结肠组织标本60例,其中结肠癌20例、腺瘤20例、正常组织标本20例。采用特异性甲基化PCR（MSP）方法检测p16、hMLH1基因的CpG岛甲基化状态。结果 MSP方法检测发现p16启动子CpG岛甲基化阳性表达率结肠癌组与腺瘤组、正常组比较有显著性差异（P=0.020、0.020）,而腺瘤组与正常组比较无显著性差异（P〉0.05）。hMLH1启动子CpG岛甲基化阳性表达率结肠癌组与正常组比较有显著性差异（P=0.047）,结肠癌组与腺瘤组、腺瘤组与正常组比较无显著性差异（P〉0.05）。p16、hMLH1基因CpG岛甲基化与Dukes分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度具有相关性（P〈0.05）,与肿瘤部位、性别无相关性（P〉0.05）。结论 p16、hMLH1启动子区CpG岛甲基化是促进结肠癌发生的重要基因事件,且可能与结肠癌Duke分期相关。     

结直肠癌组织NDRG4基因启动子甲基化状态观察及其诊断效能分析

目的 观察结直肠癌组织N-Myc下游调节基因4(NDRG4)基因启动子甲基化状态,分析其对结直肠癌的诊断效能。方法 收集结直肠癌石蜡组织43例份,癌旁组织24例份。采用定量甲基化特异性PCR(qMSP)法检测组织NDRG4基因启动子甲基化状态,计算甲基化率;比较不同性别、年龄、肿瘤生长部位、组织分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期的结直肠癌患者癌组织甲基化率,绘制其诊断结直肠癌的受试者工作特征(ROC)曲线,评价其诊断效能。结果 结直肠癌组织和癌旁组织NDRG4基因启动子甲基化率分别为65.12%(28/43)和4.17%(1/24),P<0.01。不同性别、年龄、肿瘤生长部位、组织分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期的结直肠癌患者的癌组织甲基化率比较均无统计学差异(P均>0.05)。ROC曲线分析结果显示,NDRG4基因启动子甲基化率诊断结直肠癌的曲线下面积为0.823 2(95%CI:0.725 5～0.920 8,P<0.01),敏感度为65.12%(95%CI:49.01～78.54),特异度为95.83%(95%CI:76.88～99.7...     

肺癌组织p16基因启动子区甲基化的研究

DNA甲基化可以引起染色体结构、DNA构型和稳定性及DNA与蛋白质分子相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究发现，基因缺失和启动子区异常甲基化是p16基因失活的主要原因。我们联合应用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR，MSPCR)、逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化方法检测肺癌组织中p16基因的异常改变，以了解p16基因在肺癌发生发展中的作用。     

肺癌患者PTEN基因启动子甲基化和转录表达的研究

目的 探讨张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)启动子CpG岛甲基化状态和基因表达水平与肺癌发生的关系.方法 用甲基化特异性PCR检测PTEN启动子CpG岛甲基化状态,实时定量PCR 检测PTEN mRNA的表达水平.结果 在肺癌组织中PTEN基因启动子甲基化的频率为26.67%(12/45),在肺正常组织中未发生甲基化(χ2=7.448,P＜0.01).正常组织中PTEN mRNA全部表达,肺癌组织中表达缺失率为22.22%(10/45),且表达量低于正常肺组织(t=-14.156,P＜0.001),不同年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度、肿瘤分类中其表达量无显著性差异(P＞0.05);PTEN甲基化与其mRNA表达下降密切相关.结论 肺癌中PTEN基因启动子甲基化频率明显升高,其表达普遍下调或缺失,提示PTEN启动子甲基可在肺癌发生、发展中起一定作用.     

肝癌患者及正常人群中黑色素瘤相关抗原1的基因多态性

目的 研究黑色素瘤相关抗原1(MAGE-1)在中国肝癌患者中的表达，并阐明MAGE-1基因变异是肿瘤细胞内的突变还是单核苷酸多态性(SNP)，以及基因变异在人群中的分布状况。方法 提取19例原发性肝癌(HCC)患者的癌组织、癌旁组织总RNA，用逆转录-多聚合酶链反应(RTPCR)方法检测组织MAGE-1基因mRNA的表达，并通过PCR产物测序分析编码基因是否存在变异；提取HCC患者癌组织、癌旁组织和外周血细胞基因组DNA，以及23例正常献血员外周血细胞基因组DNA，分析MAGE-1编码基因的变异状况并利用软件对变异抗原蛋白的生物学意义进行了初步探讨。结果 癌组织中MAGE-1表达阳性率为47．4％(9／19)，癌旁组织无表达。序列测定显示，MAGE-1 cDNA编码基因存在3种类型：一类是Ⅰ型(GenBank M77481)，发生率为11．1％(1／9)；另一类型(C159T，A272G，G393A)发生率为55．6％(5／9)，称之为TGA型，导致编码的2个氨基酸的改变分别是T32A和R72Q；第三种类型(A272G，C991T，A1125G)发生率为33．3％(3／9)，仅A272G引起一个氨基酸的替换(T32A)，称之为GTG型。经对基因组DNA分析，证实以上3种基因类型不是肝癌组织的基因突变，而是SNP，其在肝癌患者和正常献血员中分布的比例分别为：Ⅰ型占26．3％(5／19)和60．9％(14／23)；TGA型占57．9％(11／19)和47．8％(11／23)，GTG型占21．1％(4／19)和21．7％(5／23)。TGA型和GTG型的序列已被GenBank收录，编号为AF463515和AY148486。在男性研究对象中，SNP型别在是否患有HCC及是否表达MAGE1抗原的患者中的分布差异均无显著性。SNP可能产生多个新的能与人白细胞抗原结合的抗原表位。利用多个模块从头搭建的方法，得到Ⅰ型和TGA型的蛋白三维空间结构模型。结论 MAGE-1在HCC患者的癌组织中表达，发现MAGE-1存在3种高频分布的SNP类型，尝试建立了MAGE-1蛋白的三维空间模型，这为进一步研究不同的MAGEI-1抗原性肽疫苗奠定了基础。