siRNA干扰对SKBr3细胞株HER2表达的影响

目的 探讨siRNA干扰对人乳腺癌细胞株SKBr3表皮生长因子受体2(HER2)表达的影响.方法 构建2个针对HER2基因表达短发夹状siRNA的真核表达载体(psiRNA-HER2),并转染人乳腺癌细胞株SKBr3,采用RT-PCR法和流式细胞仪检测转染后48h HER2 mRNA和蛋白表达,从中筛选出基因沉默效果好的靶位点.同时构建针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的短发夹状siRNA的真核表达载体psiRNA-GFP作为阳性对照.结果 psiRNA-HER2-1、psiRNA-HER2-2转染后均能抑制人乳腺癌细胞株SKBr3 HER2 mRNA和蛋白表达,抑制率分别为32.0%和65.5%.荧光显微镜下见psiRNA-GFP转染后明显抑制GFP的表达.结论 HER2 siRNA真核表达载体可在人乳腺癌细胞株SKBr3中产生RNA干扰效应,不同的siRNA下调mRNA和蛋白表达的效率不同.作为基因沉默的一个重要工具,siRNA干扰有望成为治疗乳腺癌的一种新方法.     

人IL—15cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建人白细胞介素－１５（ＩＬ－１５）ｃＤＮＡ真核表达载体,以期在哺乳类细胞中获得高效、稳定表达。方法 从外周血粘附性单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ,并与ｐｃＤＮＡ３．１质粒的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ位点定向连接,构建受控于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３１－ＩＬ－１５。结果 经ＰＣＲ扩增鉴定和ＤＮＡ序列分析,证明ＩＬ－１５已经正确插入克隆载体且序列正确。     

小分子干扰RNA干扰蛋白激酶Cα相互作用蛋白1基因对结肠腺癌HT-29细胞增殖凋亡及侵袭的影响

目的研究小分子干扰RNA(siRNA)干扰蛋白激酶Cα相互作用蛋白(PICK)1基因对人结肠腺癌HT-29细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。方法设计合成针对PICK1基因的siRNA序列,分为实验组(PICK1-siRNA)、阴性对照组(Negative-siRNA)及对照组。阳离子脂质体(Lipofectamine~(TM) 2000)介导转染至HT-29细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测HT-29细胞增殖活性的改变;蛋白印迹法检测转染前后PICK1蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果转染24 h后,PICK1-siRNA组PICK1蛋白的相对表达量低于Negative-siRNA组和对照组(P<0.05)。MTT结果显示,PICK1-siRNA组HT-29细胞的增殖活性受到明显的抑制作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。与Negative-siRNA组和对照组相比,PICK1-siRNA组HT-29细胞凋亡比例显著增高,侵袭能力显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论干扰PICK1基因表达可有效抑制HT-29细胞增殖,诱导凋亡,降低侵袭相关蛋白的表达,可作为结肠癌治疗的潜在靶点。     

真核表达载体pEGFP-C3-MASH-1的构建

目的构建含小鼠MASH1基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MASH1，为进一步研究MASH1在间充质干细胞神经分化中的作用打下基础。方法应用RT-PCR方法从小鼠13．5d胚胎组织中扩增出两端带有HindⅢ和EcoRI酶切位点的MASH1cDNA编码片段，经回收、纯化、酶切后，依次连接到质粒pGEM-T和pEGFP-C3上。结果酶切及测序结果表明：重组质粒PEGFP-C3含有MASH-Ⅰ片段，方向及大小正确。结论成功构建了小鼠真核表达载体PEGFP-C3-MASH-Ⅰ。     

肺癌相关基因LSCC-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建含有肺癌相关基因LSCC-3全长ORF片段的真核表达载体,并验证其在细胞内的表达。方法PCR方法获取LSCC-3基因全长ORF片段,构建含有上述片段的真核表达载体（含3’端绿色荧光蛋白尾）并验证、纯化;将该真核表达载体转染人肺腺癌PAa细胞系,在倒置荧光显微镜下对LSCC-3基因的表达进行观察和验证。结果成功将LSCC-3基因全长ORF片段装入真核表达载体pLPS-3’EGFP（pLPS-LSCC-3-3’EGFP）并转染人肺腺癌PAa细胞系,在倒置荧光显微镜下观察到了核外细胞浆内LSCC-3基因蛋白表达产物的存在。结论成功构建了LSCC-3真核表达载体pLPS-LSCC-3-3’EGFP,该载体可在肺癌细胞胞浆内顺利表达。     

人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体构建及鉴定

目的构建并鉴定靶向人ERRα基因的小分子干扰RNA的慢病毒载体。方法针对ERRαmRNA设计了4条si RNA,并构建pGCSIL-GFP-siERRα慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定。用pGCSIL-GFP-siERRα、pHelp-er1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒干扰RNA及含有ERRα过表达载体共转染293T细胞,Western-blot检测ERRα表达,观察蛋白表达抑制效果。结果 PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达2×109TU/ml。转染细胞中ERRα蛋白表达显著降低。结论成功构建高表达、高效率的人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体,为进一步研究ERRα在细胞核内转导中的作用机制和靶向ERRα治疗奠定基础。     

人白细胞介素10 cDNA的克隆及其真核表达载体的构建

<正>白细胞介素10(interlekin-10,IL-10)是已知的细胞因子网络中为数不多的一种抑制性细胞因子,主要由Ⅱ型辅助T细胞分泌产生,具有重要的免疫调节功能和抗炎作用,其生物学效应在重症感染、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的发生、发展和转归过程中发挥着重要的调节作用,已有的研究资料显示IL-10有望成为临床相关疾病治疗的新选择。本文旨在利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞中克隆人IL-10的cDNA并构建其真核表达质粒,为进一步研究IL-10基因在细胞内的表达特征及其影响因素和探讨临床     

ASAP3真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建ASAP3的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肝癌细胞株HepG2克隆ASAP3基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明ASAP3基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论:成功构建ASAP3的真核表达载体p ASAP3。     

小鼠NMDA受体NR2B亚基短发夹RNA干扰真核表达载体的构建与鉴定

目的设计并构建小鼠N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体2B亚基(NR2B)短发卡RNA干扰真核表达载体并鉴定。方法根据NMDA受体NR2B mRNA编码序列设计并合成针对NR2B的特异性RNA干涉片段,将其克隆入pYr-1.1质粒载体,构建NR2B短发夹RNA(shRNA)真核表达载体pYr-1.1-GRIN2B-shRNA,并对其进行酶切和测序鉴定。结果酶切和测序结果均证明NMDA受体NR2B shRNA已经插入质粒载体pYr-1.1。结论 NMDA受体NR2B shRNA真核表达载体pYr-1.1-GRIN2B-shRNA构建成功。     

RNA干扰ezrin基因真核生物表达载体的构建及鉴定

目的 构建用于RNA干扰(RNAi)的小发夹RNAshRNA表达载体并检测其对ezrin基因的沉默效果.方法 以ezrin为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,设计和构建重组体,根据GeneBank数据库提供的ezrin核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,设计2条小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链,克隆到空载体pGenesil-1中,转化DH5a菌株,提取质粒,予以酶切和测序鉴定;重组质粒转染786-0肾癌细胞株,运用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明成功地构建重组质粒shRNA-ezrinl、shRNA-ezrin2;荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,肾癌细胞中shRNA-ezrinl、shRNA-ezrin2 mRNA相对表达量分别为(0.3376±0.0166)及(0.4661±0.0266),shRNA-ezrinl与shRNA-ezrin2相对表达量差异有统计学意义(P＜0.01),根据基相对表达量算出shRNA-ezrinl,shRNA-ezrin2 ezrin-mRNA的表达量抑制率分别为66.33％及53.29％.转染重组质粒后显著抑制786-0细胞中ezrin mRNA和蛋白表达,其中shRNA-ezrinl的抑制效率最高.结论 成功构建ezrin基因的shRNA表达载体,并筛选出抑制率较高的重组质粒载体shRNA-ezrinl,为进一步研究ezrin基因沉默对肾癌786-0细胞株生物学行为的影响奠定基础.     

天然内生抗菌多肽elafin真核表达载体的构建及在真核细胞的表达

采用RT-PCR法提取天然内生抗菌多肽elafin的基因，通过测序确认后亚克隆构建真核表达载体pEGFP-N1-elafin，再转染至肺上皮细胞A549，荧光显微镜观察pEGFP-N1-elafin在细胞中表达及定位，采用Northern杂交、ELISA检测法分别从转录及蛋白质水平分析表达情况，最后通过酶切电泳鉴定证实真核表达载体pEGFP-N1-elafin构建成功，其转染细胞中有elafin的基因表达，且细胞上清液中elafin含量证实其主要是分泌性表达。Elafin基因cDNA真核表达载体的成功构建以及主要呈分泌性表达的特点显示了极具意义的潜在应用价值。     

Livin shRNA慢病毒载体的成功构建及鉴定

目的构建携带livin基因短片段发卡RNA（livin shRNA）的慢病毒载体。方法针对已经筛选确定的干扰人livin基因的有效靶序列,设计、合成靶序列的寡聚脱氧核苷酸DNA序列（OligoDNA）,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的携带U6启动子和绿色荧光蛋白的pGCL—GFP载体连接产生短片段发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果PCR鉴定与DNA测序证实合成的含livin shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论成功构建人livin shRNA慢病毒载体。     

DSB修复基因hKu70反义RNA真核表达载体构建

目的 构建人DNA双链断裂（DSB）修复基因hKu70反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，为以后的hKu70基因功能和毒理学研究提供实验材料。方法 提取人胚肺成纤维细胞（HLF）总RNA，逆转录酶-多聚酶链式反应（RT-PCR）扩增hKu70基因cDNA保守序列，经与pGEM-T载体连接，筛选，克隆，抽提质粒和双酶切后，将纯化的hKu70基因cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中，筛选，克隆，抽提质粒，从而构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K。结果 经RT-PCR获得467bp含限制性内切酶位点的DNA片段，T载体克隆后经双酶切，测序，确定该片段为hKu70基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，并双酶切，测序确证。结论 成功构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，为建立该基因低表达细胞株，DNA双链断裂修复缺陷和有关毒理学研究提供工具。     

大鼠CRH基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建针对大鼠促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定。方法针对CRH基因设计4个RNAi靶点并分别构建入慢病毒骨架载体,测序鉴定。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T工具细胞后,用Western blot进行外源筛靶以确定有效靶序列。有效RNAi病毒质粒与辅助质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度。结果 Western blot外源筛靶显示3个靶点能有效敲减目的基因的表达。测定浓缩病毒悬液的滴度为1．5×109 T U／ml。结论成功构建了CRH基因的RNAi慢病毒载体,可用于CRH在应激反应中作用的研究。     

Construction and identification of lentiviral RNA interference vector of rat leptin receptor gene

Leptin resistance is a main mechanism of acquired childhood obesity, and the suppression of long form of leptin receptor (OBRb) gene expression in dietinduced obese rats indicates that the down-regulation of OBRb gene expression plays a pivotal role in the mechanism of leptin resistance. The aim of the present study was to construct the lentiviral RNA interference (RNAi) vector of rat OBRb gene and evaluate the effects of siRNA on silencing OBRb gene expression. The target sequence of siRNA-OBRb was designed, and the complementary DNA containing both sense and antisense oligonucleotides was synthesized. After phosphorylation and annealing, these double-stranded DNA was cloned to pRNA-lentivector-VGFP to construct pRNA-Lenti-OBRb-VGFP recombinants with U6-containing promoter, target sequence and Poly III terminator. Then, the products were con.rmed by electrophoresis and sequencing analysis, and the effects of RNAi on reducing gene expression were further con.rmed by real-time polymerase chain reaction in transfected rat glioma cells expressing OBRb. The target sequence of siRNA-OBRb was successfully cloned to pRNA-lentivector-VGFP, and the RNAi protocol speci.cally reduced the expression of OBRb mRNA by approximately 80% compared with controls in transfected rat glioma cells. The successful construction of rat lentivirus vectors expressing OBRb-specific shRNA may be useful for further investigation in vivo.     

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的　设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法　运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果　RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论　成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。     

RNA干扰技术抑制乳腺癌表皮生长因子受体的表达

目的 探讨采用化学合成小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰（RNAi）技术是否能有效抑制乳腺癌细胞株MDA-MB231、MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞表皮生长因子受体（EGFR）表达,以及抑制EGFR基因表达后乳腺癌细胞生物学特性的改变,以期为肿瘤治疗提供新的思路和实验依据.方法 （1）建立检测EGFR数量的方法,测定MDA-MB231、MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞株EGFR的表达.（2）观察dsRNA-EGFR/Lipofectamine 2000对EGFR表达的抑制作用.（3）采用流式细胞仪测定细胞周期,采用ELISA法观察抑制EGFR表达后,MDA-MB231,MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞生物学特性的改变.结果 MDA-MB231、MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞株存在EGFR高表达.转染dsRNA-EGFR后可将MDA-MB231、MDA-MB-453S细胞对5-Fu的敏感性提高约4倍.细胞周期分析结果表明dsRNA-EGFR组G0-G1期细胞百分数较对照组增加了17.48%,进入S期的细胞百分数较对照组减少了19.20%.转染dsRNA-EGFR后可将ZR-75-30、ZR-75细胞对5-Fu的敏感性提高约7倍.结论 （1）乳腺癌细胞株存在EGFR高表达.（2）dsRNA-EGFR可序列特异性下调乳腺癌细胞EGFR基因水平,显著降低EGFR蛋白表达.（3）dsRNA-EGFR通过抑制EGFR表达可显著抑制细胞增生和细胞迁移,降低配体EGF的含量,将更多的细胞阻滞在G0-G1期,增加细胞对5-Fu的敏感性,有效逆转乳腺癌细胞的恶性表型,从而为乳腺癌基因治疗提供了新策略.     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

Id1 miRNA表达载体构建与转染乳腺癌细胞

目的构建正义、反义Id1真核表达载体,并成功转染乳腺癌MDA．MB-231细胞系,筛选稳定表达细胞株。方法设计针对Id1基因的mRNA效的干扰序列。将干扰序列插入pcDNA6．2-GW／EmGFP-miR表达载体,构建Id1 miRNA真核表达载体,脂质体转染法转染乳腺癌MDA-MB-231细胞系,杀稻瘟霉素筛选稳定表达的细胞株。结果Id1 mRNA真核表达载体的构建后,经酶切及测序鉴定正确后。转染乳腺癌MDA-MB231细胞系。经过2周杀稻瘟霉素筛选,获得稳定表达的细胞系。经RT-PCR鉴定,转染Id1 mRNA真核表达载体的细胞系M1表达水平低于对照组。未转染组与阴性对照转染组无明显差异。     

CYP2C19基因多态性真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建细胞色素P450CYP2C19*1、*2、*3真核表达载体,并分别转染人肝癌细胞(HepG2),建立高表达目的基因的稳定转染细胞系。方法:应用化学合成法合成CYP2C19*1(野生型)序列,再以此为模板,体外定点突变PCR法构建*2、*3(突变型)。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.l(-),经菌落PCR、酶切以及测序鉴定后,脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测CYP2C19*1、*2、*3 mRNA以及蛋白的表达。结果:成功构建了pcDNA3.1(-)-CYP2C19*1、*2、*3表达质粒,并建立了相应稳定转染细胞系。进一步的RT-PCR和Western Blot检测结果表明,目的基因均得到了稳定的表达。结论:人CYP2C19*1、*2、*3稳定表达细胞系为研究创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。