转基因水牛人FSHβ基因突变的研究

目的:检测转基因水牛人FSHβcDNA序列基因。方法:分离提取转基因水牛外周血DNA,PCR扩增,T-A克隆测序,DNAclub软件分析。结果:水牛基因组整合人FSHβcDNA序列并发生一位点缺失C44(无意义链)或G347(有意义链),突变位于人FSHβ-Seatbelt结构域。结论:转基因水牛整合人FSHβcDNA序列发生点缺失,导致阅读框架发生移码,其功能有待进一步研究。     

乳腺定位表达载体在小鼠乳腺中的活性检测

目的 检测乳腺定位表达载体在动物乳腺中的表达活力。方法与结果 将乳腺定位表达载体乳清酸蛋白－人组织型纤溶酶原激活剂（ＷＡＰ－ｔＰＡ）通过乳腺导管直接注入妊娠后期小鼠的乳腺中,待小鼠产子、泌乳后,检测出小鼠乳汁中ｔＰＡ的表达量为８０ｍｇ／ｍｌ。结论 此方法可作为从动物整体水平上检测乳腺定位表达载体表达效力的一种简便而有效的方法。     

人β细胞素基因原核表达载体的构建

目的构建人BTC基因的原核表达载体。方法以人胰岛细胞瘤CDNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCK）扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列，克隆入原核细胞表达载体PET32a（＋）中，经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果PCK扩增的特异性片段长度为240bp，以此构建的重组质粒PET32a（＋）-BTC，经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后显示5．9kb和250bp左右的两条片段，测序结果与Genbank中的人BTC基因eDNA（Genbank序列号NM_001729）序列一致。证明人BTC基因已成功克隆到了原核细胞表达载体PET32a（＋）中。结论成功构建了PET32a（＋）-BTC重组原核表达载体。     

mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达

目的：克隆小鼠卵泡刺激素受体（FSHR）基因N-端部分片段（28—90aa）（mFSHRn）;预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性;构建原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中表达。方法：提取小鼠睾丸组织总RNA,利用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）技术反转录成cDNA,按照GeneBank中小鼠FSHRN．端序列设计引物,扩增基因片段并插入pET32a载体,测序鉴定后做生物信息学分析;质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态菌株诱导表达蛋白。结果：扩增片段长度为186bp,测序结果与预期结果完全一致,生物信息学分析其编码蛋白具有良好的抗原性;重组原核表达质粒经鉴定获得正确重组子并诱导表达。结论：mFSHRn蛋白可作为良好的候选避孕疫苗,成功构建了pET32a—mFHSRn原核表达重组质粒,获得可表达mFHSRn的大肠杆菌菌株,为后续的相关研究奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I（cTnI）基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnI的cDNA片段，设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体，并导入宿主菌BL21（DE3）中，采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因，重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致，测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

人pcsk9基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的构建人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)的原核表达载体,优化pcsk9诱导表达条件。方法聚合酶链式反应扩增人工合成的pcsk9 cDNA序列。扩增产物经双酶切、连接,构建pET-28b-pcsk9表达载体;将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)的感受态细胞中,分别在不同条件下对其进行诱导,获得pET-28b-pcsk9的最佳诱导表达条件。结果成功构建了pET-28b-pcsk9重组表达载体,其最佳表达条件为菌液光密度值取0.6,诱导温度取30℃,诱导剂终浓度取1.0 mmol/L,诱导时间取8 h。结论该重组表达载体构建成功,在大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中可有效地表达,对诱导所用的温度和时间相对比较敏感。     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法 以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmi...     

乳腺定位表达载体在小鼠乳腺中的活性检测

目的 检测乳腺定位表达载体在动物乳腺中的表达活力。方法与结果 将乳腺定位表达载体乳清酸蛋白(人组织型纤溶酶原激活剂（WAP-tPA）通过乳腺导管直接注入妊娠后期小鼠的乳腺中,待小鼠产子、泌乳后,检测出小鼠乳汁中tPA的表达量为80 ng/ml。结论 此方法可以作为从动物整体水平上检测乳腺定位表达载体表达效力的一种简便而有效的方法。     

人心肌肌钙蛋白I基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnⅠ的cDNA片段,设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体,并导入宿主菌BL21(DE3)中,采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因,重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致,测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

人血管生成素-1基因的克隆及表达载体的构建

【目的】克隆人血管生成素-1基因，并构建原核、真核表达载体。【方法】提取人骨髓中的总RNA，反转录成eDNA，利用巢式PCR技术扩出人血管生成素-1基因片段，并克隆到PQE-31、B7载体中。【结果】克隆了正确的人血管生成素-1基因，构建了PQE31 Ang-1、B7Ang-1载体。【结论】人血管生成素-1基因的克隆及表达载体的构建，为进一步研究其功能、活性和应用奠定了基础。     

人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体的构建

目的 构建带信号肽和不带信号肽的人血小板衍生生长因子B(PDGF-B)链基因酵母表达载体，探讨该基因在酵母中的表达效率和活性。方法 利用逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)从人血管内皮细胞总RNA中扩增出PDGF-B的cDNA，克隆入pGEM-T载体，进行序列测定。进而克隆至酵母表达质粒pMETB和pMETαA并进行重组子双酶切鉴定。结果 扩增获得了含信号肽(578bp)和不含信号肽(340bp)的编码PDGF-B链基因；构建了PDGF-B的酵母表达载体pMETB-PDGFB1，pMETαA-PDGFB2。测序结果显示，重组载体中目的基因序列与GENE BANK公布的序列一致。结论 人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体构建成功，为进一步在酵母中的高效表达奠定基础。     

人GRP78基因真核表达载体的构建及鉴定

目的利用PCR技术克隆人GRP78基因编码基因（约2000bp）。方法将PCR产物连接到pcDNA3.1（＋）载体上,酶切鉴定后测序分析。结果序列分析表明,扩增片段与GenBank里登陆的序列同源性为100%。并以pcDNA3.1（＋）表达载体为框架结构,尝试构建真核表达载体。结论测序分析结果表明序列同源性为100%。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

人resistin基因原核表达载体构建和表达

【目的】构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达，为开展对resistin的研究打下实验基础。【方法】酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA，RT-PCR法扩增出resistin基因cDNA，经测序后，PCR产物亚克隆入 T载体，用EcoR I和Kpn I分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS，然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接，用核酸内切酶EcoR I、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒。重组表达质粒转化大肠杆菌JM109，经1mmol／LIPTG在32℃诱导表达2h，裂解细菌，进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达。【结果】RT-PCR扩增产物分子大小为327bp，序列分析表明为人resistin基因完整编码区。PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后，从细菌质粒中酶切回收了目的片段。重组表达质粒经EcoR I和Kpn I双酶切后能产生出327bp、4980bp大小的两个片段，序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区，基因编码无移位，PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39．5kD的融合蛋白。【结论】成功构建了人resistin基因原核表达载体，且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白，为下一步研究打下了实验基础。     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

ZAK-β蛋白激酶基因真核表达载体的构建

目的 将人源ZAK-β基因定向克隆入MSCV-IRES-GFP质粒,构建真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β.方法 以肺癌A549细胞的cDNA为模板,通过PCR得到ZAK-β特异性基因产物,克隆入真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,获得重组真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β,测序验证.结果 扩增了ZAK-β基因,经双酶切、测序鉴定证实目的基因克隆到真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,测序结果与预测完全一致.结论 成功构建了ZAK-β逆转录病毒表达载体,为进一步研究ZAK蛋白激酶的功能奠定了基础.     

人胰岛素原C肽基因高效表达载体的构建

目的：构建一种快速、高效的人胰岛素原C肽基因的表达载体，为有效地提高重组C肽的产量奠定了基础。方法：以人胰岛素原C肽的基因序列为基础，运用DNA重组技术构建出含5个拷贝的头到尾连接的C肽基因片段的高效表达载体。结果：通过酶切鉴定和DNA测序分析证实，实验成功地构建了人胰岛素原C肽基因的表达载体pMAL—C2E—C5.结论：人胰岛素原C肽基因表达载体pMAL—C2E—C5的成功构建，为进一步研究在大肠杆菌中表达人C肽融合蛋白，继而获得高产的单体C肽奠定了基础。     

人β防御素-2基因的合成及其真核表达载体的构建

目的 合成人β防御素-2(Human β-defensin-2，hBD-2)基因并构建其真核表达载体，为hBD-2基因的转染和表达奠定基础。方法 根据GenBank中的hBD-2结构基因序列，设计合成了3条长度为82bp的长寡聚核苷酸引物(H1、H2、H3)，用PCR延伸扩增的方法进行全长为211bp的基因合成；PCR产物经双酶切后，克隆人真核表达载体pLXSN并导入细菌扩增。结果 PCR产物和重组载体经凝胶电泳及测序分析，证实合成的基因与原序列一致，并成功克隆到真核表达载体pLXSN上。结论 用PCR延伸扩增法合成基因，能方便快捷地获得目的基因片段，提高了基因合成的准确性，为基因的转染和表达提供了帮助。