Gateway技术构建人RhoD慢病毒表达载体及转染人黑素瘤A375细胞株

目的构建人RhoD基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装和鉴定,转染人黑素瘤细胞A375,使其过表达RhoD蛋白,为后续研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基础。方法 Gateway技术构建携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的RhoD慢病毒载体,经PCR及基因测序鉴定后,与辅助质粒p LV/helper-SL3,pLV/helper-SL4及p LV/helper-SL5混合采用脂质体法制备DNA-Lipofectamine 2 000复合物,并共同转染293FT细胞进行慢病毒包装,产生相应慢病毒颗粒,通过定量PCR方法测定病毒滴度。包装好的慢病毒转染人黑素瘤A375细胞,荧光显微镜下观察荧光表达情况,流式细胞仪检测转染效率;实验分为A375(未处理对照组)、A375-EGFP(不含目的基因的空病毒对照组)和A375-RhoD(含RhoD基因的病毒组)三组,采用实时荧光定量PCR(QPCR)及免疫印记法(western blotting,WB)验证RhoD在A375-RhoD组细胞中的过表达。结果通过PCR、基因测序证实,慢病毒表达载体pLV[Exp]-EGFP/NeoCMVh RhoD构建成功。与辅助质粒共转染293FT细胞包装出具高效感染力的慢病毒,经测定病毒滴度为(5.13±2)×10~8TU/m L。转染A375细胞后可见明显的绿色荧光表达,流式检测转染效率大于80%;A375-RhoD组RhoD mRNA及蛋白水平均较A375-EGFP组和A375组细胞中明显增高。结论成功构建RhoD慢病毒表达载体,包装出具高效感染力的慢病毒颗粒并成功转染人黑素瘤A375细胞,为进一步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供实验基础。     

TAP1、TAP2和HLA-1在恶性黑素瘤组织中的表达

目的:检测抗原处理相关转运蛋白(transporters associated with antigen processing,TAP)和HLA-I类分子在恶性黑素瘤组织中的表达.方法:应用免疫组织化学方法检测77例恶性黑素瘤组织TAP1、TAP2和HLA-I类分子的表达,并进行半定量分析,以20例色素痣组织作为对照研究.结果:在77例恶性黑素瘤组织中,TAP1、TAP2和HLA-I类分子的阳性表达率分别为23.38%、11.69%和63.64%,HLA-I类分子的表达与TAP1和TAP2成正相关;而TAP1、TAP2和HLA-I类分子几乎在所有的色素痣组织中都为阳性表达.结论:在恶性黑素瘤组织中TAP1、TAP2和HLA-I类分子的表达水平下降,可能与人恶性黑素瘤细胞的免疫逃逸表型有关.TAP1和TAP2的表达下降可能是导致HLA-I类分子表达下降的重要原因.     

反义寡核苷酸抑制人恶性黑素瘤A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白的表达

目的 研究乙酰肝素酶反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白表达的影响.方法 分空白组、无关序列(N-ODN)组和反义(ASODN)组,以脂质体包埋后分别转染人恶性黑素瘤细胞株A375,采用原位杂交、免疫组化法检测乙酰肝素酶mRNA及其蛋白表达的变化.结果 转染24 h后,ASODN组A375细胞乙酰肝素酶mRNA表达较对照组、N-ODN组均显著下调(P均<0.01);转染48 h后,与对照组、N-ODN组相比,ASODN组A375细胞的乙酰肝素酶蛋白水平均显著下降(P均<0.01).结论 乙酰肝素酶ASODN可下调A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白的表达.     

RNA干扰技术抑制人恶性黑素瘤细胞A375中淋巴样增强因子mRNA及蛋白表达

目的 利用RNA干扰技术,以淋巴样增强因子(LEF-1)为靶基因,设计、构建重组体,研究其对人恶性黑素瘤细胞A375中LFF-1表达的抑制作用。方法 设计、合成针对LEF-1 mRNA序列的有小发夹结构的正义和反义寡核苷酸,退火后与表达载体Psilencer3.1-H1 neo相连接,经鉴定正确后转染人恶性黑素瘤细胞A375,以G418筛选,获得稳定转染细胞株,分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)和免疫细胞化学方法检测转染细胞中LEF-1 mRNA及蛋白表达水平的改变。结果 成功构建了靶向人LEF-1基因的siRNA表达载体,获得稳定转染细胞株,转染细胞LEF-1 mRNA及蛋白水平明显下调。结论 靶向LEF-1的RNA干扰重组体可抑制人恶性黑素瘤细胞A375中LEF-1表达。     

干细胞因子及受体c-kit对A375细胞增殖和凋亡影响的体外研究

目的利用基因工程方法建立稳定表达干细胞因子受体(SCF/c-kit)的恶性黑素瘤A375细胞株,再给予外源性SCF/c-kit,观察其对A375细胞增殖、凋亡的影响。方法通过脂质体转染技术构建稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株(hc-kit/A375),给予A375细胞和hc-kit/A375细胞外源性SCF,将所有的细胞分为A375组、A375-SCF组、hc-kit/A375组和hc-kit/A375-SCF组。应用MTT法及流式细胞仪分析细胞的增殖和凋亡,并应用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化方法检测肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF),基质金属蛋白酶(MMP)-9及肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达。结果①通过脂质体介导能将c-kit-pcDNA3.1neo重组质粒成功转染入黑素瘤细胞,建立稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株hc-kit/A375,hc-kit/A375细胞中c-kit表达明显增加。②给予外源性SCF后,细胞的生长受到抑制,以培养后第5天尤为显著;细胞的凋亡率明显增加,S期比例降低,且hc-kit/A375-SCF组尤明显。③转染后细胞及加入SCF干预组VEGF、MMP-9分泌减少,而TNF-α的分泌增加。结论通过脂质体转染和G418筛选成功构建稳定表达c-kit的A375细胞株;通过增加A375细胞中SCF/c-kit的表达能改变肿瘤细胞对VEGF、MMP-9、TNF-α的分泌,抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡。     

PKCI-1/HINT1表达质粒的构建及其对黑素瘤A375细胞凋亡及自噬影响的初步研究

目的 构建人PKCI-1/HINT1基因的真核表达质粒,研究其在人黑素瘤A375细胞株中的表达并检测其对A375细胞凋亡及自噬的影响.方法 以人黑素瘤细胞A375的总RNA为模板,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增PKCI-1/HINT1基因序列,将PKCI-1/HINT1基因克隆到真核表达载体PCDNA3.1(+)中,构建PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1重组体.将PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1表达载体瞬时转染黑素瘤A375细胞,RT-PCR及Western印迹检测PKCI-1/HINT1在细胞内的表达,并以PCDNA3.1(+)空载体转染细胞作为相应对照组.噻唑蓝(MTT)检测PKCI-1/HINT1转染后细胞的增殖变化,Hoechest 33258染色检测细胞凋亡,采用绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(GFP-LC3)标记结合激光共聚焦显微镜法检测PKCI-1/HINT1对细胞自噬的的影响,并通过Western印迹检测PKCI-1/HINT1对细胞内caspase 3及自噬相关蛋白beclin1蛋白表达的影响.结果 PCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1真核表达载体经酶切及测序鉴定构建成功,并能够在细胞内有效表达.MTT检测发现PKCI-1/HINT1能够明显抑制A375细胞的增殖,与PCDNA3.1(+)对照组相比,在48 h,72 h及96 hPCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1组活细胞数分别减少17.0％,25.6％、29.4％,差异有统计学意义(均P＜0.05).Hoechest 33258染色显示PKCI-1/HINT1可促进A375细胞内凋亡小体形成.激光共聚焦显微镜发现PKCI-1/HINT1的过表达可使A375细胞内GFP-LC3B的点状聚集增加.Western印迹发现,PKCI-1/HINT1可促进细胞内caspase 3及beclin1蛋白表达.结论 成功构建真核表达载体PCDNA3.1 (+)-PKCI-1/HINT1并在细胞内有效表达PKCI-1/HINT1.PKCI-1/HINT1的高表达可以抑制A375细胞增殖,促进其凋亡,同时可引发A375细胞的自噬过程.     

皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的影响

目的探讨皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达以及其对促血管新生因子VEGF-A和VEGFR-1的影响。方法 Northern blotting检测原代人黑素瘤细胞、黑素瘤细胞株A375和原代人表皮黑素细胞miRNA-34c表达。构建miRNA-34c基因过表达与基因敲低的黑素瘤细胞株A375细胞系即高表达miRNA-34c组和低表达miRNA-34c组,以空载体转染黑素瘤细胞株A375作为空载体对照组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性。qRT-PCR和Western blotting分别检测各组VEGF-A、VEGFR-1 mRNA和蛋白表达。结果与原代人表皮黑素细胞相比,黑素瘤细胞株A375和原代人黑素瘤细胞中miRNA-34c的表达降低(P<0.05)。高表达miRNA-34c组、低表达miRNA-34c组和空载体对照组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)。高表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体对照组降低(P<0.05)。低表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体组升高(P<0.05)。结论 miRNA-34c在皮肤黑素瘤中呈现特异性下调,miRNA-34c可能通过对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的下调参与皮肤黑素瘤的发生与发展。     

RNAi沉默c-Met基因对黑素瘤A375细胞生物学行为的影响

目的探讨c-MetshRNA表达载体对人黑素瘤A375细胞增殖、侵袭能力的影响。方法以pGenesil-1质粒为载体,以c-Met为靶基因,构建shRNA表达载体,并将其转染至体外培养的人黑素瘤A375细胞中。倒置相差显微镜下观察经干扰后瘤细胞的形态学变化;采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法分别检测转染细胞c-Met基因和蛋白的表达水平;四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测转染后细胞的生长活力;Transwell小室法测定转染细胞体外侵袭能力。结果构建了pGenesil-1-c-MetshRNA重组质粒,并成功转染A375细胞。转染后A375细胞缩小,变圆。RT-PCR显示转染后c-Met mRNA的表达显著降低,以48h为著,下降近64%;Western blot证实转染后蛋白的表达下降近65%;MTT法显示细胞的活力降低为(68.25±4.4)%;Transwell小室测定转染细胞体外侵袭能力明显下降。结论 pGenesil-1-c-MetshRNA重组质粒明显下调c-Met在黑素瘤细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞增殖及其侵袭能力。     

c-myc反义寡核苷酸对人恶性黑素瘤细胞c-myc mRNA表达及其蛋白水平的影响

目的研究c-myc反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤细胞c-myc mRNA表达及c-myc蛋白水平的影响。方法设空白和混杂链(SODN)对照,人工合成c-myc ASODN,以30μmol/L ASODN转染人恶性黑素瘤细胞株A375,分别用原位杂交、免疫组化SABC法检测c-myc mRNA的表达及其蛋白水平。结果转染24 h后,ASODN组细胞c-myc mRNA较空白对照组、SODN组均显著下调(P均<0.01);转染48 h后,与空白对照组、SODN组相比,ASODN组细胞的c-myc蛋白水平均显著下降(P均<0.01)。结论c-myc ASODN可下调A375细胞c-myc mRNA的表达和c-myc蛋白水平。     

黑素瘤MIA启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统选择性杀伤黑素瘤细胞

目的:探讨黑素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory activity,MIA)启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统,对黑素瘤细胞A375的选择性杀伤作用。方法:构建腺病毒穿梭质粒pAdrMIA-CD/TK,在293细胞内包装、扩增、纯化后,体外转染人表皮黑素细胞HeMa-LP、黑素瘤细胞A375和人宫颈癌细胞HeLa,RT-PCR检测基因CD和TK片段,加入前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或丙氧鸟苷(GCV),用MTT法测定该体系对细胞株的杀伤效应。结果:制备的病毒滴度为1×1011pfu/L,用100m.o.i.重组腺病毒感染细胞后,发现目的基因CD和TK片段可在黑素瘤细胞中表达,转染目的基因的黑素瘤细胞A375对5-FC和GCV具有一定的敏感性,细胞存活率较对照组显著下降(P<0.05),联合应用两种药物对A375细胞的杀伤作用较单用一种显著增强(P<0.05)。对人表皮黑素细胞HEMa-LP和人宫颈癌细胞HeLa无显著杀伤作用。结论:构建的黑素瘤MIA启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统,在体外可选择性杀伤黑素瘤细胞A375。     

Restoration of the expression of transports associated with antigen processing in human malignant melanoma increases tumor-specific immunity

The transporter associated with antigen processing (TAP) is essential for peptide delivery from the cytosol into the lumen of the endoplasmic reticulum (ER), where these peptides are loaded on HLA I molecules. Our previous study found that expressions of TAP were reduced in human malignant melanoma (MM) lesions and associated with histopathologic characteristics. In this study, we further investigate expressions of TAP and HLA class I antigen in three human MM cell lines. pEGFP-TAP1/TAP2/TAP1+TAP2 were used to restore the expressions of TAP in the antigen presentation pathway-deficient MM cell line A375. TAP1- and TAP1+TAP2-transfected A375 increased TAP1, TAP2, and HLA class I antigen expression and antigen presentation. TAP1- and TAP1+TAP2-transfected A375 exhibited a dramatic increase in Melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) compared with TAP2-transfected A375 or empty vector. These CTLs were capable of killing TAP1- and TAP1+TAP2-transfected A375. TAP1+TAP2-transfected A375 generated the highest frequency of Melan-A-specific IL-12 and interferon (IFN)-gamma-producing CD8+ T cells compared with TAP1, TAP2, and empty vector. Therefore, TAP expression restores both antigen presentation and immunogenicity in A375 melanoma cells and concomitantly increases IL-12 and IFN-gamma production in tumor antigen-specific CTLs; TAP should be considered as a part of the immunotherapies for MM.     

犬小孢子菌丝氨酸水解酶家族1蛋白的亚细胞定位分析

【摘要】 目的 对丝氨酸水解酶家族1（FSH1）蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析。方法 以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为模板，PCR扩增FSH1基因及EGFP基因；同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA，将扩增的EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体；将扩增的FSH1基因及EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体Ptrcp-FSH1-EGFP-Ttrcp。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法，用重组质粒转化犬小孢子菌，使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子（Ptrpc）和终止子（Ttrpc）调控下在犬小孢子菌中整合型表达，利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果 成功构建根癌农杆菌转化系统及犬小孢子菌EGFP表达载体；融合基因FSH1-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜显示FSH1-EGFP融合蛋白的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中。结论 FSH1-EGFP融合蛋白成功定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中，为进一步明确犬小孢子菌FSH1基因的功能及致病机制奠定了基础。     

抗原处理相关转运体和MHC-Ⅰ类分子在黑素瘤细胞株的表达

目的 检测抗原处理相关转运体（TAP）及主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅰ类分子在恶性黑素瘤细胞系中的表达。方法 采用Western印迹法、RT-PCR和流式细胞仪分别检测TAP蛋白、mRNA和MHC-Ⅰ类分子在3株恶性黑素瘤细胞系（A375、A875、KZ28）中的表达,并与正常黑素细胞做对照。结果 与正常黑素细胞相比,TAP mRNA表达在A375、A875、KZ28细胞系中均显著降低,t值分别为5.89,4.45和4.57,P值均 < 0.01;TAP 蛋白的表达均明显降低,t值分别为5.46,4.32和4.67,P值均 < 0.01。在A375细胞中TAP mRNA和蛋白下降最显著。MHC-Ⅰ类分子也具有相同的趋势,t值分别为6.16,5.22和5.61,P值均 < 0.01。结论 TAP蛋白及其mRNA在A375、A875、KZ28细胞系中表达显著降低,可能为恶性黑素瘤细胞逃逸机体免疫监视的一条途径。     

Expression of transporters associated with antigen processing and human leucocyte antigen class I in malignant melanoma and its association with prognostic factors

BACKGROUND: Low expression of transporters associated with antigen processing (TAP) and human leucocyte antigen (HLA) class I, due to defects in the antigen presentation pathway, is frequently found in human tumours, including malignant melanoma (MM). This immune evasion renders many tumours unrecognizable by the host immune surveillance system and appears to play a role in the clinical course of the tumour, probably because it provides tumour cells with a mechanism to escape cytotoxic T-lymphocyte recognition and destruction. However, the histopathological significance of TAP and HLA class I antigen defects in MM remains unclear. OBJECTIVE: To study the expression of TAP and HLA class I antigen in MM and the relationship between them. To investigate the correlation between histopathological characteristics and expression of these molecules in MM. METHODS: Tissue sections from 77 patients with MM and 20 with naevi were examined using immunohistochemistry and morphological quantitative analysis for protein expression of TAP1, TAP2 and HLA class I antigen. RESULTS: Positive TAP1, TAP2 and HLA class I antigen immunostaining was observed in 23%, 12% and 64% of MM lesions, respectively, and the expression of HLA class I was positively correlated with that of TAP1 and TAP2. However, expression of these molecules was positive in all of the pigmented naevi lesions. Reduced TAP1 and TAP2 protein expression in melanoma lesions was significantly associated with invasive growth, Clark's level and tumour-infiltrating lymphocytes. Reduced HLA class I antigen protein expression was only associated with tumour-infiltrating lymphocytes. CONCLUSIONS: Our data suggest that reduced TAP1, TAP2 and HLA class I antigen protein expression in MM may contribute to the immune escape phenotype of human melanoma cells, and the main cause of reduced HLA class I expression may be the decreased TAP1 and TAP2 levels.     

乙酰肝素酶-siRNA表达载体的构建及其抑制黑素瘤细胞株体外侵袭能力的观察

目的 构建针对人乙酰肝素酶（HPSE）基因的小干扰RNA（siRNA）及其表达载体，观察其对A375细胞HPSE基因的干扰作用及其对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用。方法 设计并构建了重组质粒pRNATU6.1/HPSE-siRNA，转染A375细胞，用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别测定HPSE基因RNA和蛋白水平的表达变化，Matrigel侵袭实验观察A375细胞体外侵袭能力的改变。结果 将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段正确克隆到pRNATU6.1载体；转染A375细胞，与对照组比较，HPSE-siRNA组HPSE基因和蛋白的表达均明显降低。转染后肿瘤细胞的体外侵袭能力与对照组相比受到明显抑制。结论 成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体，HPSE-siRNA转染A375细胞可以显著降低细胞HPSE基因和蛋白的表达。     

Rab7表达载体的构建及功能鉴定

目的：构建人Rab7与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达载体，研究其对黑素代谢的影响。方法：分离人外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以特异性引物扩增Rab7片段，酶切后连接至EGFP-C1载体并转化至感受态大肠杆菌中，测序分析以确定表达载体构建正确。将构建成功的重组质粒转染A375细胞，检测细胞黑素合成酶的表达水平和黑素含量的变化情况。 结果：EGFP-Rab7重组质粒经测序鉴定构建正确。重组质粒转染A375细胞后，细胞中的酪氨酸酶（TYR）和酪氨酸酶相关蛋白1（TYPR1）表达水平和细胞黑素含量高于空载质粒组。结论：本研究成功构建了EGFP-Rab7融合表达载体，其可增加细胞中的黑素合成酶表达水平和细胞黑素含量。     

pU-VEGF-siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定针对VEGF的发卡样siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA。方法人工合成一对互补并编码相应短发夹状VEGF-siRNA的寡核苷酸链,将其插入到pS ilencerTM2.1-U6neo载体中,经测序鉴定所构建的重组载体是否正确;采用电转染方法将构建的重组载体导入人恶性黑素瘤细胞系A375和人结(直)肠癌细胞系LOVO细胞中,用G418筛选得到稳定表达VEGF-siRNA的细胞;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、ELISA法分别检测转染细胞VEGFmRNA和蛋白的表达变化。结果经测序证明pU-VEGF-siRNA序列正确;G418筛选得到稳定表达VEGF-siRNA的细胞;转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375和LOVO细胞VEGF mRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(P<0.01)。结论测序结果表明发卡样的VEGF-siRNA真核表达载体构建成功,转染A375和LOVO细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭VEGF的表达,为进一步研究pU-VEGF-siRNA载体在恶性黑素瘤治疗中的作用提供了实验基础。     

过表达RhoD对人黑素瘤A375细胞骨架和迁移侵袭的影响

目的：探讨RhoD对人黑素瘤细胞株A375细胞骨架、迁移和侵袭能力等的影响及作用机制。方法实验分为A375?RhoD组和A375?增强型绿色荧光蛋白（EGFP）组，分别用携带RhoD的慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体转染。罗丹明标记鬼笔环肽染色观察细胞骨架，Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力，流式细胞仪检测细胞周期，Western印迹法检测丝切蛋白、磷酸化丝切蛋白、Diaph2和RhoD的表达。结果与A375?EGFP组细胞相比，A375?RhoD组细胞体积增大，应力纤维变细，软弱无力，黏着斑增多；丝状伪足形成增加；皱褶缘和板状伪足无明显变化。Transwell迁移实验显示，A375?EGFP组和A375?RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为152.67±11.23和72.67±5.03，两组间差异有统计学意义（t =11.25，P <0.05）。Transwell人工基底膜侵袭试验显示，A375?EGFP组和A375?RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为78.33±12.34和9.00±1，两组间差异有统计学意义（t=9.70，P<0.05）。A375?EGFP和A375?RhoD两组间G1期、S期和G2期细胞所占百分比差异均无统计学意义（P>0.05）。Western印迹结果显示，A375?RhoD组细胞可在RhoD的刺激下激活下游信号效应分子Diaph2，促进其表达，而A375?EGFP组未能激活，两组间丝切蛋白和磷酸化丝切蛋白表达差异不显著。结论 RhoD过表达可能通过下游效应分子Diaph2调节细胞骨架进而抑制A375细胞的迁移和侵袭能力。     

血管内皮生长因子-siRNA对恶性黑素瘤细胞生长的抑制作用

目的 探讨血管内皮生长因子siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响。方法 构建针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA将其表达载体经电穿孔转染A375细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫酶联吸附实验(ELISA)方法 检测转染后的A375细胞VEGF的mRNA和蛋白表达,应用细胞计数比较转染组和对照组A375细胞增殖能力,将含转染组和对照组A375细胞的上清液分别培养人静脉内皮细胞(ECV-304),观察其生长情况,并用流式细胞仪观察转染pU-VEGF-siRNA载体对A375细胞凋亡的影响。结果 转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375细胞的VEGFmRNA和蛋白表达均较对照组明显下降,并且其生长缓慢,其细胞周期出现亚二倍凋亡峰。用转染pU-VEGF-siRNA的A375细胞上清液培养的ECV-304细胞增殖力较对照组下降。结论 通过RNA干扰技术阻断VEGF的表达,可抑制A375和ECV-304细胞增殖,诱导A375细胞凋亡。