小鼠钟基因Period2(Per2)抑制乳腺癌细胞生长的研究

目的 研究小鼠节律基因Period2（Per2）对小鼠乳腺癌细胞（EMT6）的生长抑制及诱导凋亡的作用。方法 将pcDNA3．1（＋）-Per2转导入EMT6细胞内,同时设立转染空质粒pcDNA3．1（＋）入细胞的对照组。以RT-PCR、Western blot、流式细胞技术来检测Per2基因和蛋白的表达;采用MTT、细胞生长曲线、细胞平板集落形成实验检测Per2过表达后对小鼠乳腺癌细胞的生长抑制作用;通过流式细胞技术、DNA梯形带、hochst33258荧光染色和电镜技术检测nr2过表达后对小鼠乳腺癌细胞凋亡的影响。结果 小鼠节律基因nr2过表达抑制EMT6细胞的生长和增殖,诱导细胞凋亡率增加。结论 本研究发现小鼠节律基因Per2可能通过使EMT6细胞阻滞于G1期,并诱导细胞凋亡来实现对该肿瘤细胞的生长抑制作用。     

神经生长因子和脑源性神经营养因子在氧化应激诱导细胞凋亡中的作用

目的 探讨神经生长因子（NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）在氧化应激诱导细胞凋亡的作用。方法 脂质体介导入NGF和BDNF基因转染鼠成纤维细胞NIH3T3,使目的基因在细胞中表达,过氧化氢（H2O2）处理转染细胞,吖啶橙荧光染色法和流式细胞检测细胞凋亡。结果 50μmol/LH2O2能诱导NIH3T3细胞凋亡,处理后24h凋亡率为16．7％,而NIH3T3细胞分别经NGF、BDNF和NGF／BDNF转染表达目的基因后,能对抗H2O2诱导的细胞凋亡,其24h凋亡率分别为8．21％、9．51％和6．26％。结论 氧化应激能诱导细胞凋亡,NGF和BDNF能抑制氧化应激诱导的细胞凋亡,两者具有协同作用。     

泛素代谢系统相关基因FBG2在胃癌细胞系中功能意义的研究

目的初步探讨泛素代谢系统相关基因FBG2对于胃癌细胞生长、增殖、凋亡等生物学特性及成瘤、浸润转移能力等恶性表型的影响。方法将FBG2基因插入载体pcDNA3．1构建pc-FBG2真核表达载体。以脂质体介导转染MKN45胃癌细胞并以G418压力筛选法筛出稳定表达的克隆,对稳定表达株进行鉴定,然后使用流式细胞仪、生长曲线法、平板克隆形成实验法、细胞迁徙实验法等分析稳定表达株相关生物学特性与恶性表型的变化,每种检测实验均设立pc-FBG2稳定转染细胞组、pcDNA3．1稳定转染细胞组和空白MKN45细胞组。结果与转染pcDNA3．1空载体及空白MKN45胃癌细胞相比,转染pc-FBG2载体的稳定表达细胞株生长有所加快,开始计数后第4、5、6、7天平均细胞计数显著增高（P〈0．05）,细胞周期检测显示pc-FBG2转染组G2／M期比例显著高于其他两组（P〈0．05）,而S期比例显著低于其他两组（P〈0．05）。细胞凋亡检测显示pc-FBG2转染组凋亡比例与其他两组相比无显著差异（P〉0．05）,平板克隆形成实验结果显示pc-FBG2转染组平均克隆形成率显著高于其他两组（P〈0．05）,细胞迁徙实验结果显示pc-FBG2转染组穿膜率与其他两组相比无显著差异（P〉0．05）。结论FBG2基因在一定程度上可促进细胞生长及有丝分裂,对维持细胞恶性表型具有一定意义,但对细胞凋亡及浸润转移能力可能影响较小。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(－）中，构建HCV NS3基因真核表达载体pcDNA3.1(－）-NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系epG2细胞，免疫印迹方法（Western blotting)检测转染细胞中HCV NS3蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示，质粒pcDNA3.1(－）-NS3在HepG2细胞瞬时表达HCV NS3蛋白，共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的4．6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS3蛋白反式激活的靶基因，为深入阐明HCV NS3蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论基础。     

KDR启动子驱动双自杀基因诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨KDR启动子驱动双自杀基因体系对胃癌细胞凋亡的诱导作用。方法以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SCG7901细胞株和不表达KDR的HepG2细胞株,并给予不同浓度的前药GCV和（或）5-FC,观察该体系对SCG7901细胞的杀伤效应。分别应用透射电镜、Hoechest33258／PI染色、流式细胞仪观察细胞超微结构、细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果携带双自杀基因（CDglyTK）和报告基因（GFP）的重组腺病毒载体转染后,95％以上SCG7901和HepG2细胞中有GFP表达。表达KDR的SCG7901细胞对前药具有较高的敏感性,不表达KDR的HepG2细胞对前药不敏感（P〈0．01）。两种前药联合应用优于任一前药单独应用的疗效（P〈0．01）。流式细胞术检测表明该体系可抑制SCG7901细胞DNA的合成,表现为s期细胞比例增高及G2期细胞减少。同时,Hoechest33258／PI染色和电镜下可见SCG7901有凋亡改变。结论KDR启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,并且该体系可以诱导胃癌细胞凋亡。     

AMPKα信号途径参与吡格列酮对人肝癌细胞的凋亡诱导作用

目的观察吡格列酮干预对体外培养的HepG2细胞凋亡和细胞周期的影响,并探讨其药理作用机制。方法以不同浓度的吡格列酮干预体外培养HepG2细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期以及激活的胱天蛋白酶（Caspase）3蛋白表达,RT-PCR检测PPARγmRNA的表达,Western印迹检测PPARγ蛋白、磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPKα）蛋白和磷酸化AMPKα（p-AMPKα）蛋白的表达;并将PPARγ小干扰RNA（pGCsi-PPARγ）表达质粒转染HepG2细胞,观察PPARγ基因沉默后吡格列酮对细胞凋亡作用的影响。结果不同浓度的吡格列酮干预HepG2细胞后,诱导细胞的凋亡,在此过程中G0/G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少,并呈一定的剂量依赖关系;但在上述过程中,PPARγmRNA和蛋白的表达没有显著变化;吡格列酮在高浓度（20μmol/L）时对pGCsi-PPARγ表达质粒转染的HepG2细胞仍表现出凋亡诱导作用。不同浓度的吡格列酮干预后未见激活的caspase 3表达峰,对NF-κB的DNA结合活性也无明显影响,但其在高浓度（20μmol/L）时明显增加对照组和pGCsi-PPARγ转染组p-AMPKα的表达,而总AMPKα则无明显变化。结论吡格列酮能够干扰细胞周期、诱导其凋亡,这种作用不是完全通过PPARγ依赖途径实现的,AMPKα信号途径参与上述过程。     

HBx基因的真核表达及其对肝癌细胞系HepG2细胞表型的影响

目的为了探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系,构建HBV X基因(hep-atitis B virus X gene,HBx)真核表达载体及其肝癌(HCC)细胞系HepG2瞬转模型,并检测HBx对HepG2细胞表型的影响。方法以pCMV-HBx为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pcDNA3.1-Flag真核表达载体中,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx,转染至HepG2细胞;Western印迹法检测细胞中HBx蛋白的表达水平;5-溴尿苷(5-溴脱氧尿嘧啶核苷,5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)标记法检测转染HBx后细胞DNA合成变化;细胞周期检测试剂盒(CycleTESTTMPLUS DNA Reagent Kit)检测转染HBx后细胞周期的变化;AnnexinⅤ-APC/7-AAD法检测转染HBx后细胞凋亡情况。结果重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx经双酶切和测序证明构建正确,转染该载体的HepG2细胞可检测到HBx蛋白的表达;与转染空质粒pcDNA3.1-Flag的细胞相比,细胞增殖能力增强,而细胞凋亡比率下降。结论成功构建了HBx基因真核表达载体,并研究了HBx对细胞表型的影响,为进一步探索HBx参与HBV引发HCC的分子机制奠定了基础。     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45生长特性的影响。方法 将从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,按正向、反向克隆人真核表达载体pcDNA3．1（＋）。测序正确的重组子pcDNA3．1-a（含GCRG213正向克隆）、pcDNA3．1-b（含GCRG213反向克隆）和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,采用半定量RT-PCR及Western blot方法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞的增殖状态,Annexin VFITC／PI双标记法检测凋亡细胞。结果经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。与对应的空载体比较,转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中mRNA的表达上调35．4%,蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中mRNA的表达下调32．1％,蛋白的表达下调50．3％。转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞生长增殖速度加快,凋亡率下降,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞生长增殖速度减慢,凋亡率增加。结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞凋亡,可能是恶性肿瘤癌变的促进因素之一。     

siRNA抑制STAT3基因对HepG2细胞辐射敏感性的影响

目的 研究瞬时转染的siRNA抑制STAT3基因表达对人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的影响。方法 以人肝癌HepG2细胞作为研究对象，脂质体包裹化学合成的siRNA进行转染。采用实时RT-PCR和Westernblotting法分别从mRNA水平和蛋白水平检测STAT3基因的表达及编码蛋白磷酸化活化的改变，用CCK-8法和Hoechst33258DNA染色法检测辐射敏感性的变化。结果STAT3特异性的siRNA转染后HepG2细胞中STAT3基因mRNA拷贝数、STAT3蛋白表达和磷酸化水平均明显降低。mRNA水平的抑制效率可达70％。siRNA转染联合60Coγ射线照射后HepG2细胞增殖活力显著低于对照组（P〈0．05）。结论 针对人STAT3基因的siRNA能够抑制HepG2细胞STAT3基因的表达，降低STAT3蛋白活化水平，进而产生辐射增敏作用。     

节律基因mPeriod2对Lewis肺癌细胞生长的影响

目的 研究节律基因mPeriod2(mPer2)对肿瘤细胞的生长抑制及诱导分化凋亡的作用。方法 体外培养Lewis肺癌细胞,使用脂质体包裹法将真核表达质粒pcDNA3．1为基础的mPer2表达质粒(pcDNA3．1-mPer2)转导入Lewis肺癌细胞内;以免疫组化及流式细胞技术检测mPer2表达;通过流式细胞技术检测稳定转染的mPer2阳性表达的Lewis肺癌细胞的生长及凋亡。结果 mPer2表达质粒(pcDNA3．1-mPer2)转染的Lewis肺癌细胞表达PERIOD2蛋白;与对照组比较,其增殖指数下降及凋亡率增加。结论 节律基因mPer2可以抑制肿瘤细胞的生长,增加肿瘤细胞的凋亡率。     

三氧化二砷对人肝癌细胞凋亡及Bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响

目的研究三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）诱导HepG2细胞凋亡及其机制。方法采用MTT法、形态学观察及流式细胞术方法检测As2O3对HepG2细胞的生长抑制、凋亡作用的影响,用Western blot检测As2O3处理后HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3的表达。结果As2O3对HepG2细胞有明显的抑制增殖作用,且呈浓度和时间依赖性,细胞呈典型的凋亡形态学改变,As2O3呈时间依赖性诱导HepG2细胞凋亡。As2O3处理不同时间后,Bcl-2蛋白表达水平下调,caspase-3蛋白表达水平升高。结论As2O3具有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用,其机制可能与其下调Bcl-2蛋白的表达,促进caspase-3活化有关。     

赖氨酸对甲基苯丙胺神经毒性的保护作用

 目的 评价赖氨酸对甲基苯丙胺所致神经细胞氧化损伤和凋亡的保护作用.方法 选取大鼠神经胶质细胞的C6细胞株体外培养后,随机分为对照组、甲基苯丙胺(2 mM、3 mM、4 mM)组、赖氨酸组、甲基苯丙胺+赖氨酸组.通过研究C6细胞的过氧化氢酶(CAT)活性,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性,凋亡和凋亡相关蛋白(caspase-3、Bcl-2)的表达,以评价赖氨酸的作用.结果 赖氨酸可以部分逆转甲基苯丙胺所致的C6细胞形态的改变,显著提高CAT和GPx的活性,可以逆转甲基苯丙胺诱导的凋亡蛋白Bcl-2的表达.结论 赖氨酸对甲基苯丙胺所致的C6细胞的神经毒性具有保护作用,其机制是抑制氧化应激而不是通过活化GABA受体起作用的.     

miR-1抑制SDF-1表达和分泌调控HMSC-bm向肝癌细胞迁移

目的 明确肿瘤抑制性micro RNA-1（miR-1）能否通过抑制SDF-1的表达和分泌,调控骨髓间充质干细胞（HMSC-bm）向肿瘤组织的转移.方法 （1）分别利用miR-1表达质粒pSuper-miR-1和miR-1反义寡核苷酸,在肝癌细胞系HepG2中过表达或下调miR-1,Western blot和酶联免疫吸附实验分别检测肝癌细胞蛋白裂解物和培养上清液中SDF-1的表达和分泌水平;（2）构建融合SDF-1 3UTR的pGL3重组萤光素酶报告基因载体,将其与pSuper-miR-1共转染HEK293细胞,利用双萤光报告基因检测系统检测重组萤光素酶的表达情况.（3）利用pSuper-miR-1或miR-1反义寡核苷酸转染接种于Transwell下层小室的HepG2细胞过表达miR-1或下调miR-1水平,检测TransweH上层小室HMSC-bm向下层小室HepG2肝癌细胞的迁移情况.结果 （1）在肝癌细胞,HepG2过表达miR-1能够显著抑制SDF-1蛋白表达和分泌,而下调miR-1水平则能够诱导SDF-1的表达和分泌.（2） miR-1能够抑制携带SDF-1 3UTR的pGL3重组萤光素酶报告基因活性.（3）在Transwell下层小室的HepG2细胞中过表达miR-1后,上层小室中HMSC-bm向下层小室迁移细胞数量显著减少,而下调下层小室HepG2细胞中miR-1表达水平,则明显增加HMSC-bm向HepG2肝癌细胞的迁移.结论 miR-1能够直接抑制肝癌细胞SDF-1的表达和分泌,并藉此降低肝癌细胞对HMSC-bm的趋化作用.     

伊马替尼和十字孢碱对非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响

目的探讨伊马替尼（STI571）、十字孢碱（STS）对非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响。方法经STI571和STS处理后,通过Western印迹检测A549细胞内凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,AIF）的变化,然后利用膜联蛋白（annexin）Ⅴ-FITC PI凋亡试剂盒,借助流式细胞仪,检测A549细胞凋亡;利用Hoechst染色检测A549细胞凋亡现象并通过免疫荧光技术检测细胞内AIF和线粒体的变化。结果 Western印迹检测结果显示,STI571和STS处理能够提高AIF在A549细胞内以相对分子质量为57×103的形式表达;流式细胞仪检测结果显示,STS处理组膜联蛋白ⅤFITC染色的细胞数随着STS处理时间的增加呈现先增后降的趋势,溴化乙锭PI染色的细胞数随着处理时间增加到20 h呈现增多的趋势;STI571处理组膜联蛋白ⅤFITC的染色结果和溴化乙锭的染色结果与对照组相比,变化均不显著;STI571与STS共同作用组膜联蛋白ⅤFITC染色细胞数少于STS单独处理组结果,溴化乙锭染色的细胞数明显多于STS单独处理组;Hoechst染色结果显示,STS处理组和STI571、STS共同处理组细胞核内染色质发生凝集;间接免疫荧光结果显示,AIF发生聚集且细胞内线粒体染色亮度减弱。结论 STS和STI571处理能够引起细胞内AIF分布形式上的变化,STS可引起A549细胞发生细胞凋亡,STI571处理不能引起细胞发生凋亡,但能引起细胞内AIF发生聚集并对STS引起的细胞凋亡有促进作用。     

干扰素λ诱导人食管癌YES5和T.Tn细胞抗增殖机制的研究

目的探查干扰素λ诱导人食管癌YES5和T.Tn细胞抗增殖的机制。方法流式细胞术检测细胞周期,膜联蛋白Ⅴ（annexinⅤ）和PI双染检测凋亡,Western印迹检测凋亡蛋白的表达。结果干扰素λ诱导人食管癌YES5和T.Tn细胞的亚G1期（sub-G1）升高,干扰素λ处理细胞与膜联蛋白Ⅴ的结合增加,干扰素λ可诱导细胞内半胱天冬酶（caspase）3的剪切,caspase抑制剂可减少干扰素λ诱导的sub-G1期升高。结论干扰素λ可诱导人食管癌YES5和T.Tn细胞发生凋亡。     

丁酸钠对肝癌Hep G_2细胞株Bcl-2表达的影响

目的：研究丁酸钠（NaB）引起HepG2细胞凋亡的作用及其分子机制。方法：用不同浓度丁酸钠处理HepG2细胞后，用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Bcl-2mRNA的表达丰度；Hochest3342核染色后观察HepG2细胞核凋亡形态的变化；原位切口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。结果：丁酸钠在mRNA水平明显抑制Bcl-2基因的转录；荧光显微镜下可见丁酸钠处理后细胞核出现高度凝聚、边缘化，并可见凋亡小体出现；TUNEL法证明出现细胞凋亡。结论：丁酸钠通过下调Bcl-2的转录和表达，诱导肝癌HepG2细胞的凋亡。     

维生素 D 对足细胞钙敏感受体表达的影响简

目的观察活性维生素D（VitD）对足细胞钙敏感受体（CaSR）表达的影响,探讨其对足细胞保护作用的可能机制。方法体外分化培养的小鼠永生化足细胞随机分为：（1）正常对照组;（2）脂多糖（LPS）＋足细胞组;（3）LPS＋VitD＋足细胞组。AnnexinV-FITC／PI标记流式细胞测定足细胞的凋亡百分率,骨架蛋白F-肌动蛋白免疫荧光染色及半定量分析,Fura-2／AM负载检测细胞内Ca2＋浓度变化,Westernblot分别检测足细胞CaSR、p-ERKl／2蛋白的表达。结果LPS诱导足细胞凋亡,足细胞应力纤维及F-肌动蛋白减少,足细胞内的ca2＋浓度增加,CaSR、p-ERKl／2蛋白表达亦增加：而VitD明显减少LPS引起的足细胞凋亡,降低足细胞内的ca2＋浓度,部分恢复应力纤维及F-肌动蛋白结构,下调CaSR、p-ERKl／2蛋白的表达水平。结论VitD可能通过抑制CaSR-P-ERKl／2信号通路引起的细胞内ca2＋水平增加,拮抗LPS引起的足细胞凋亡,对足细胞有保护作用。     

Spred的结构及生物学特性

Spred家族是一组Sprouty相关的酪氨酸激酶结合蛋白,它对多种生长因子诱导的Ras-ERK信号途径有负调控作用。Spred家族各成员在染色体上定位和体内表达均不相同,但都具有保守的结构域：C端Sprouty相关结合域（SPR）、中央c-Kit结合域（KBD）和N端Enabled／VAsP同源结构域（EVH-1）。Spred调节细胞发育、运动以及增殖等生命活动,参与肿瘤的转移、造血调控、过敏反应以及骨的形成等病理生理学过程。本文主要综述Spred家族的结构及功能特点以及对细胞增殖信号途径的调节作用。