HBV启动子对肝细胞具有特异性转录活性的研究

目的：探讨HBV转录调控核心序列在肝细胞中转录的活性。方法：构建HBV增强子和启动子调控的荧光素酶报告栽体，用脂质体转染法将其转染肝细胞和非肝细胞，双荧光素酶报告基因试验检测其在不同细胞中的转录活性。结果：HBV启动子在2、2.15细胞中转录活性最高，在其他肝细胞中的转录活性显著高于非肝细胞。结论：由HBV启动子构建的载体可能是一种新颖的有前景的靶向性肝癌细胞基因治疗栽体。     

PTEN对脂多糖攻击RAW264.7细胞核因子-κB转录活性的影响及其意义

目的探讨PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）全县对脂多糖（LPS）攻击RAW264．7细胞核因子-κB转录活性的影响。方法NF-κB-LUC质粒与PTEN质粒或其突变质粒分别共转染RAW264．7细胞,通过检测NF-κB反应性荧光素酶报告基因表达,观察PTEN在LPS攻击巨噬细胞时对NF-κB转录激活的影响。结果野生型PTEN过表达可促进LPS诱导的NF-κB活性增强,而突变型PTEN则没有明显作用。结论PTEN可正性调控LPS诱导的NF-κB转录因子的激活,从而有可能在内毒素所诱导的炎症反应中发挥重要的调控作用。     

不同基因型HBx对乙型肝炎病毒复制的影响

目的探讨A、B、C和D四个基因型乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis Bvirus Xprotein,HBx）对乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus,HBV）复制的影响。方法构建含A、B、C和D四种基因型HBx的真核表达载体和提前终止HBx表达的突变型单倍体HBV表达系统,共转染至人肝肿瘤细胞系HepG2细胞,利用荧光素酶报告系统检测不同基因型HBx对HBV核心启动子的激活作用,利用酶联免疫法（ELISA）检测培养上清中HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的表达情况,利用特异性引物PCR方法检测细胞中HBV前基因组RNA（pgRNA）和总RNA（pgRNA,2.2kb和0.8kbRNA）的转录情况。结果 A、B、C和D四种基因型HBx的表达均可显著激活HBV核心启动子活性,但不同基因型HBx的激活作用不同。除C基因型外,A、B和D三种基因型HBx均可显著增强HBsAg和HBeAg的胞外分泌水平。检测HBV复制中间产物发现,C基因型HBx对HBVpgRNA和总RNA转录水平的影响显著低于A、B和D基因型。结论不同基因型HBx对HBV复制的影响不同,为进一步研究HBV基因型与HBV复制能力以及临床病理表现的关系打下基础。     

人IP-10启动子的克隆和转录活性的检测

目的 克隆干扰素诱导蛋白10（IP-10）5’非编码区（NCR）片段，检测克隆的IP-10启动子驱动的荧光素酶报告基因在LPS激活的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的转录活性。方法 提取人外周血淋巴细胞基因组DNA，以其为模板，利用巢式PCR扩增人IP-10启动子片段，测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3；将重组质粒pGL3／IP-10P导入HUVEC细胞，检测LPS刺激下荧光素酶活性。结果 正确克隆出人IP-10启动子（-2028～-1）片段，成功构建了pGL3／IP-10P报告基因表达载体；证实了LPS可诱导HUVEC细胞中IP-10的高表达。结论 成功克隆出人的IP-10启动子片段，并利用荧光素报告基因证实了在HUVEC细胞中LPS可诱导IP-10高转录表达，为深入研究LPS诱导IP-10转录表达的调控机制提供了基础。     

PM2．5通过诱导AP-1活化介导支气管上皮细胞中VEGF的诱导表达和炎症反应

目的：探讨细颗粒物（particulate matter 2．5, PM2．5）可否通过诱导转录因子激活蛋白1（AP-1）活化介导支气管上皮细胞（bronchial epithelial cell, Beas-2B）中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的诱导表达及炎症反应。方法体外培养Beas-2B细胞,采用双荧光素酶报告基因法检测细胞中AP-1的诱导活化水平和VEGF基因启动子的转录活化水平;Western印迹法检测AP-1的2个组成亚基c-Jun、ATF2的诱导活化水平及VEGF的蛋白表达水平。结果 PM2．5可显著上调Beas-2B细胞中转录因子AP-1的转录激活活性;同时诱导AP-1组成亚基c-Jun和ATF2活化。 Beas-2B细胞中转染c-Jun或ATF2 siRNA后,可抑制AP-1的转录激活活性,同时VEGF的转录活化和蛋白表达也显著下调。结论 PM2．5通过活化AP-1可诱导支气管上皮细胞中VEGF表达及炎症反应。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增HBV X基因,克隆至真核表达载体pVR1012中,构建HBV X基因重组表达载体pVR102-X;以该质粒转染HepG2细胞,酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞X蛋白的瞬时表达,与报告质粒pSV-lacZ共转染H G2爱细胞,用试剂盒法检测β-半乳糖苷酶表达活性。结果质粒pVR102-X在HepG2细胞瞬时表达X蛋白,共转染实验中pVR102-X组β-半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的3．2倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表,并能够反式激活SV40病毒早期启动子。     

树鼩水动力转染方法的建立及在HBV模型探索中的应用

目的建立一种水动力注射将外源基因导入树鼩肝脏的方法,并用此方法建立HBV树鼩模型。方法用萤火虫荧光素酶（firefly luciferase,Fluc）和β-半乳糖苷酶（β-galactosidase,β-Gal）作为报告基因,通过树鼩大隐静脉将报告基因用水动力注射方法导入树鼩肝脏,活体成像和β-Gal染色观察水动力转染效果。将pHBV1.2质粒用水动力注射方法转入树鼩肝脏,检测树鼩血清中ALT、实时荧光定量检测血清中HBV DNA,ELISA检测血清中HBsAg、HBsAb。结果通过大隐静脉水动力注射,报告基因能够在肝脏特异性表达,转染HBV1.2质粒后树鼩血清中能够检测到相关阳性指标。结论大隐静脉水动力注射法能够作为树鼩肝脏外源基因导入的一种方法,并用此方法初步探索了树鼩的HBV模型。     

PM2．5通过活化 NF－κB 途径诱导支气管上皮细胞中血管内皮生长因子的表达

目的：探讨细颗粒物（particulate matter 2．5,PM2．5）诱导支气管上皮细胞（bronchial epithelial cell,Beas－2B）表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的分子机制。方法 PM2．5粉末溶解于DMEM培养基中,倍比稀释成不同浓度（0、12．5、25、50、100μg／ml）的溶液,超声30 min后加入血清及双抗（链霉素和青霉素）,使终浓度为2％血清的体系,刺激人支气管上皮细胞;双荧光素酶报告基因分析系统检测核因子－κB （nuclear factor－kappa B,NF－κB）活化水平和vegf基因启动子的转录活化水平;Western印迹检测NF－κB组成亚基p65磷酸化水平、阻遏蛋白IκBα及VEGF蛋白表达水平。结果 PM2．5呈剂量依赖性诱导Beas－2B细胞VEGF表达;PM2．5诱导Beas－2B细胞中NF－κB活化,在浓度为100μg／ml活化强度最高,阻遏蛋白IκBα降解和p65亚基磷酸化水平升高;抑制NF－κB p65亚基表达后Beas－2B细胞VEGF蛋白表达水平下调,vegf基因启动子的转录活化水平下降。结论 PM2．5通过活化NF－κB途径诱导支气管上皮细胞中VEGF表达。     

IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2表达及其分子机制

目的观察白介素-1β（IL-1β）诱导人气道上皮细胞人13防御素2（hBD-2）的表达及抑制因子I-κBα蛋白、核转录因子KB（NF-κB）活性的变化，探讨人气道上皮hBI〉2表达的分子机制。方法用IL-1β和（或）NF-κB抑制剂PDTC处理人原代气道上皮细胞，RT-PCR法检测hBD-2mRNA的表达，Western blot检测胞浆I-κBa蛋白，凝胶迁移实验（EMSA）检测NF-κB活性的变化。结果加入IL-1β 1μg／L刺激0．5h，可见I-κBa活性降低；刺激1．5h可见hBD-2 mRNA表达。NF-κB抑制剂PDTC可抑制hBD-2 mRNA的表达，EMSA显示NF-κB的异型二聚体p65-p50参与了hBD-2表达的转录。结论一定剂量的IL-1β可诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达，NF-κB p65／pS0异型二聚体参与了IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达的转录调控。     

核因子κB降低小鼠胚胎成纤维细胞中Lmp2基因转录

目的 研究在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中,核因子κB(NF-κB)对Lmp2基因转录的影响.方法 利用NF-κB荧光素酶报告基因检测MEF和c-abl/arg缺失株(DKO)中内源性NF-κB活性;构建包含Lmp2启动子序列和NF-κB结合序列突变体的荧光素酶报告基因,通过双荧光素酶报告系统,研究NF-κB对Lmp2启动子转录活性的调控,并应用定量PCR、Western印迹比较Lmp2基因在MEF和DKO细胞中表达水平.结果 DKO细胞中内源性NF-κB活性上调;DKO细胞中Lmp2基因启动子的转录活性发生下调,并且NF-κB结合序列突变后,其转录活性升高;定量PCR和Western印迹结果表明,DKO细胞中Lmp2基因mRNA和蛋白表达水平比较MEF细胞均发生下调.结论 MEF中内源性NF-κB可负调控Lmp2基因转录,并降低其蛋白表达水平.     

重组腺病毒肝细胞生长因子对乙型肝炎病毒感染滋养层细胞的抑制作用

目的：探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）体外感染滋养层细胞（JEGⅢ）的治疗作用。方法：在转染与不转染rAd-HGF两种情况下,HBV阳性血清感染JEGⅢ。用GIMSA染色、透射电镜及荧光定量PCR三种方法观察感染后细胞形态学及培养物中HBV-DNA含量的变化。结果：形态学观察转染rAd-HGF组细胞病变较未转染组有明显减轻,且未转染组胞质内可见HBV颗粒。荧光定量PCR显示未转染Ad-HGF组培养上清中HBV-DNA含量较转染组明显增高（P〈0.05）。结论：HGF可有效抑制HBV感染滋养层细胞。     

乙肝病毒前S1抗原与乙肝病毒血清标志物联合检测的临床意义

目的探讨乙肝病毒前S1抗原（PreS1-Ag）与乙肝病毒血清标志物（HBV-M）联合检测在临床应用中的意义。方法用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定328例乙型肝炎患者血清中PreS1-Ag和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）5项HBV血清标志物。结果 PreS1-Ag在HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、HBcAb（＋）组和HBsAg（＋）、HBeAg（＋）组的阳性率显著升高,分别为87.3%和80.0%;在HBsAg（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb（＋）组和HBsAg（＋）、HBcAb（＋）组及HBsAg（＋）组的PreS1-Ag阳性率分别为47.5%、63.9%和25.0%;PreS1-Ag在HBeAg（＋）组的阳性率为86.2%,明显高于在HBeAg（-）组的52.1%（χ2=21.33,P〈0.01）;328例乙型肝炎患者中,PreS1-Ag阳性率为61.9%,HBeAg阳性率为28.7%（χ2=73.098,P〈0.01）。结论 PreS1-Ag能较好地反映HBV的复制情况,且对HBV感染的早期诊断和判断治疗效果具有重要的临床意义。     

乙型病毒性肝炎不同血清学模式前S1抗原、乙型肝炎病毒-DNA和肝功能指标的关系

目的检测乙型肝炎病毒（HBV）感染者不同血清学模式前S1抗原（pre-S1-Ag）、HBV～DNA和乙型肝炎抗原、抗体含量,结合血清肝功能（丙氨酸转氨酶ALT、天冬氨酸转氨酶AST）分析病毒性肝炎临床诊断、病情判断和预后。方法用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测94例HBV感染者血清中pre-S1-Ag和乙型肝炎抗原、抗体,用荧光定量一聚合酶联反应（FQ-PCR）方法检测HBV-DNA含量,用全自动生化分析仪检测血清AI,T和AST指标。结果HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、HBcAb（＋）模式的pre-S1-Ag检出率为79．4％,HBV—DNA检出率为97．1％,肝功能异常的为94．1％;HBsAg（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb（＋）模式的Pre-S1Ag检出率为52．4％,HBV—DNA检出率为83．3％,肝功能异常的为88．1％;在HBsAg（＋）和HBcAb（＋）模式中pre-S1-Ag检出率为33．3％,HBV—DNA检出率为66．7％,肝功能异常的为33．3％。结论HBV-DNA检测在反映乙型肝炎病毒复制情况的检出率明显高于HBVpre—S1-Ag,但是HBVpre-S1-Ag检测成本低廉,与HBV—DNA的符合度较高,是对乙型肝炎“两对半”和HBV—DNA测定的重要补充和加强。乙型肝炎抗原、抗体及HBV-DNA联合pre-S1-Ag检测可以提高HBV的检出率,更能真实地反映出HBV在体内的复制情况,为乙型肝炎患者的诊断、治疗和预后判断提供依据。     

EGFP-HBVP22e融合蛋白在HepG2中的表达

目的 利用pEGFP-C2真核表达载体,建立稳定表达乙型肝炎病毒(HBV)P22e的HepG2细胞系.方法 以含1.2拷贝HBV基因(adr亚型)的p3.8Ⅱ质粒为模板,PCR获得HBVP22e cDNA片段,分离插入通用T载体pMD18-T中鉴定,然后装入真核表达型载体pEGFP-C2中,HBVP22e与EGFP基因融合,脂质体转染HepG2细胞株,荧光显微镜下观察EGFP-HBVP22e融合蛋白的胞内表达,Western blot检测阳性克隆细胞EGFP-HBVP22e的表达.结果 成功构建了真核表达载体pEGFP-C2HBVP22e,并转染HepG2细胞,经多次传代培养鉴定,获得稳定表达EGFP-HBVP22e融合蛋白的HepG2细胞系.结论 该细胞系的建立为进一步研究HBVP22e的生物学功能与乙型肝炎发病机制的关系奠定了基础.     

肝特异性假病毒转运系统的构建

目的:探索一种针对慢性乙型肝炎的特异性长效基因治疗手段.方法:改造乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)为基因治疗载体,敲除其所有的开放阅读框(open reading frames,ORFs),同时保留包装信号序列,并且插入增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报告基因.同时构建辅助细胞系,为上述病毒载体(假病毒)提供包装所需要的病毒蛋白.以该假病毒载体转染辅助细胞系,以酶联免疫方法检测细胞培养上清中乙型肝炎病毒抗原,并在荧光显微镜下观察EGFP的表达,用透射电镜观察培养上清中的病毒颗粒,同时用实时定量PCR的方法对分泌到细胞培养上清中的假病毒进行了定量检测.结果与结论:以假病毒载体转染辅助细胞后,电镜观察到培养上清中乙肝病毒的丹氏粒(Dane particle).实时定量PCR分析结果显示,细胞分泌到培养上清的假病毒含量达103拷贝/μl.ELISA结果显示该上清中同时表达了HBV表面抗原和e抗原,通过荧光显微镜观察发现外源基因绿色荧光蛋白获得有效表达.     

乙肝疫苗预防相关性肝移植后乙肝复发的临床观察

目的观察乙型肝炎（简称：乙肝）相关性肝移植术后接种乙肝疫苗预防乙肝复发的临床指标,探讨影响疫苗应答的相关因素。方法观察了9例应用乙型肝炎基因重组疫苗主动免疫的乙肝相关肝移植术后患者,分别在术后0、1、2、6个月接种,每次60μg,检测血清抗-HBs的滴度。结果9例中,2例出现完全应答,停用乙型肝炎免疫球蛋白（hepatitisBim—munoglobulin,HBIG）;3例部分应答,HBIG减量,4例无应答。结论乙肝疫苗是预防乙肝相关性肝移植后乙肝复发的策略之一。接种时抗体滴度可能会增加疫苗的应答率。     

丙型肝炎病毒NS4B调控肝细胞增殖的相关机制研究

目的研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B（HCV-NS4B）对肝细胞IGF-Ⅱ、P16表达的影响,探讨HCV-NS4B对肝细胞增殖的影响及相关机制。方法转染载体PCXN2或PCXN2-NS4B至LO2肝细胞中,以正常LO2肝细胞为空白对照利用MTT法绘制空白载体PCXN2组及PCXN2-NS4B组细胞生长曲线,流式细胞仪检测各组细胞周期;利用放射免疫法测定各组的IGF-Ⅱ水平,RT-PCR检测P16的表达情况。结果 （1）PCXN2-NS4B质粒转染入LO2细胞并有稳定表达。（2）PCXN2-NS4B组与PCXN2组比较,细胞生长速度增加。（3）PCXN2组G0/G1期细胞比例高于PCXN2-NS4B组,而S期及G2/M细胞比例低于后者（P〈0.05或P〈0.01）。（4）空白对照组、PCXN2两组IGF-Ⅱ水平差异无统计学意义（P〉0.05）,但均显著低于PCXN2-NS4B组（P〈0.01）。（5）空白对照组、PCXN2两组P16表达差异无统计学意义,但均显著高于PCXN2-NS4B组（P〈0.01）。结论 PCXN2-NS4B质粒转染入肝细胞后有稳定表达,HCV-NS4B可能通过促进IGF-Ⅱ的表达及抑制P16表达而促进肝细胞异常增殖。     

乙型肝炎病毒基因组中前-前-S-编码基因启动子序列的确定及转录活性的鉴定

为了解前-前-S编码区ORF上游是否具有启动子活性，选取其起始密码子ATG上游277bp的DNA序列，将其克隆至报告基因表达载体pCAT3中，构建pCAT3-前-前-S-promoter表达载体，以该质粒转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果发现，质粒pCAT3-前-前-S-pmrnoter能够激活CAT的表达，吸光度(A值)是pCAT3-basic的10倍，说明pCAT3-前-前-S-promoter具有启动子活性，为在HBV基因组DNA序列中界定、研究新的前-前-SORF提供了直接的实验依据。