磷酸化NF—κB亚基P65介导化学性缺氧诱导的HaCaT细胞炎症损伤北大核心CSCD

目的探讨核因子-κB（NF—κB）亚基P65磷酸化是否参与化学性缺氧模拟剂氯化钴（CoCl2）诱导的永生化人皮肤角质形成细胞（HaCaT）毒性作用及炎症反应。方法用2mmol／LCoCl2处理HaCaT细胞,建立化学性缺氧诱导HaCaT细胞损伤的体外模型。RNA干扰法下调NF—κB亚基P65的表达。细胞计数试剂盒-8比色法检测细胞存活率;ELISA法检测培养基中IL-6和IL-8的含量;Western印迹法检测总量P65及磷酸化P65的蛋白表达。结果CoCl2处理HaCaT细胞0～4h,可促进NF—κB亚基P65的磷酸化,在0．5h时P65亚基开始磷酸化,1．5h时P65亚基的磷酸化水平达到高峰,约为对照组的6．6倍,而4h基本恢复到正常水平。CoCl2处理HaCaT细胞0～6h,可时间依赖性地降低细胞活力,2．4和6h的细胞存活率与对照组比较,P值分别〈0．05、〈0．01及〈0．01。CoCl2处理6h,还引起IL-6和IL-8的释放显著增加。RNA干扰法下调P65的表达后,CoCl2处理引起的HaCaT细胞毒性作用被明显减弱,即使细胞存活率升高了11％左右,下调P65表达还明显抑制了CoCl2处理引起的IL-6和IL-8释放增多。结论磷酸化NF—KB亚基P65介导CoCl2诱导的HaCaT细胞毒性及炎症反应。     

磷酸化NF-κB亚基P65介导化学性缺氧诱导的HaCaT细胞炎症损伤

目的 探讨核因子-κB(NF-κB)亚基P65磷酸化是否参与化学性缺氧模拟剂氯化钴(CoCl2)诱导的永生化人皮肤角质形成细胞(HaCaT)毒性作用及炎症反应.方法 用2 mmol/L CoCl2处理HaCaT细胞,建立化学性缺氧诱导HaCaT细胞损伤的体外模型.RNA干扰法下调NF-κB亚基P65的表达.细胞计数试剂盒-8比色法检测细胞存活率;ELISA法检测培养基中IL-6和IL-8的含量;Western印迹法检测总量P65及磷酸化P65的蛋白表达.结果 CoCl2处理HaCaT细胞0～4 h,可促进NF-κB亚基P65的磷酸化,在0.5 h时P65亚基开始磷酸化,1.5 h时P65亚基的磷酸化水平达到高峰,约为对照组的6.6倍,而4 h基本恢复到正常水平.CoCl2处理HaCaT细胞0～6 h,可时间依赖性地降低细胞活力,2、4和6 h的细胞存活率与对照组比较,P值分别＜0.05、＜0.01及＜0.01.CoCl2处理6 h,还引起IL-6和IL-8的释放显著增加.RNA干扰法下调P65的表达后,CoCl2处理引起的HaCaT细胞毒性作用被明显减弱,即使细胞存活率升高了11%左右,下调P65表达还明显抑制了CoCl2处理引起的IL-6和Il-8释放增多.结论 磷酸化NF-κB亚基P65介导CoCl2诱导的HaCaT细胞毒性及炎症反应.

Abstract：

Objective To explore whether the phosphorylation of NF-κB P65 subunit is involved in the cytotoxicity to and inflammation in an immortal human keratinocyte cell line HaCaT during cobalt chloride (CoCl2-induced chemical hypoxia. Methods HaCaT cells were treated with CoCl2 of 2 mmol/L to set up a chemical hypoxia-induced cell model of injury. Then, RNA interference was used to down-regulate the expression of P65 in CoCl2-induced HaCaT cells. After additional culture, cell viability was tested by cell counting kit8 (CCK-8), the levels of interleukin 6 (IL-6) and interleukin 8 (IL-8) were detected by ELISA kits, phosphorylated and total P65 protein was measured by Western blot. Results The exposure of HaCaT cells to 2 mmol/L CoCl2 for 0 to 4 hours enhanced the phosphorylation of P65, which began at 0.5 hour, peaked at 1.5 hours, and restored to the normal level at 4 hours, and the level of P65 phosphorylation was about 6.6 times that in the untreated control group. The CoCl2 of 2 mmol/L decreased the cell viability of HaCaT cells in a time dependent manner, and a significant difference was observed in the viability of HaCaT cells between CoCl2-treated and untreated HaCaT cells at 2, 4, and 6 hours (P ＜ 0.05, 0.01, 0.01 ). The release of IL-6 and IL-8 from HaCaT cells was also promoted by CoCl2 treatment. The knockdown of P65 expression with siRNA markedly suppressed the CoCl2-induced cytotoxicity to and increase in the release of IL-6 and IL-8 from HaCaT cells,despite of an increment in cell viability by about 11%. Conclusion The phosphorylated P65 subunit mediates CoCl2-induced cytotoxicity and inflammatory injury to HaCaT cells.     

大气颗粒物PM_(2.5)介导氧化应激对人角质形成细胞HaCaT凋亡的影响

目的 研究大气细颗粒物PM_(2.5)对人角质形成细胞HaCaT的损伤作用及凋亡的影响。方法 收集郑州市区空气中的PM_(2.5)，分离并提取其水溶性及非水溶性成分，以不同的终浓度处理HaCaT细胞。CCK8检测细胞增殖率，确定PM_(2.5)最佳作用浓度和时间。透射电子显微镜（TEM）检测细胞线粒体结构及细胞整体形态的变化。抗氧化剂NAC作用后检测各组细胞内ROS水平、IL-1β和TNF-α的分泌水平，以及细胞凋亡率。结果 在实验浓度和时间范围内，细胞增殖率随PM_(2.5)浓度和时间的增加而降低，具有显著的剂量和时间效应关系。TEM实验结果表明PM_(2.5)作用后，细胞线粒体等超微结构表现出明显的损伤效应。与对照组相比，PM_(2.5)作用后细胞内ROS水平，IL-1β、TNF-α及细胞凋亡率均显著增加（P＜0.05）；与PM_(2.5)组相比，加入NAC后，ROS水平，IL-1β、TNF-α及细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05）。结论 PM_(2.5)能够对HaCaT的造成明显的细胞氧化损伤，诱导炎性因子分泌和细胞凋亡；而NAC 可以在一定程度降低氧化损伤、炎性因子分泌和细胞凋亡。     

氧对5-氨基酮戊酸光动力疗法诱导HaCaT细胞凋亡和死亡的影响

目的 探讨基态氧和单线态氧对5-氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）诱导HaCaT细胞凋亡和死亡的影响。方法 取对数生长期的HaCaT细胞，分别与不同浓度的ALA避光孵育4 h，随后给予相应剂量的He-Ne激光照射，照射后12 h以MTT法检测细胞存活率；PI单染法检测细胞凋亡率；二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）标记法测定细胞内活性氧基（ROS）水平。为了造成光动力反应前后细胞的化学缺氧以及淬灭产生的单线态氧基（1O2），将不同浓度的氯化钴（CoCl2）和叠氮钠（NaN3）分别加入培养基，比较ALA-PDT处理组与未处理组HaCaT细胞凋亡和死亡率以及细胞内ROS水平的变化。结果 MTT结果表明，ALA-PDT诱导HaCaT细胞的凋亡与死亡率与ALA浓度和He-Ne激光照射剂量呈正相关。经400 μmol/L CoCl2处理的细胞，胞内ROS水平显著降低，细胞死亡率未处理组为57.65% ± 2.88%，处理组降至16.68% ± 1.86%，细胞凋亡率则分别为43.80%和15.40%。10 mmol/L NaN3几乎能完全清除ALA-PDT诱导产生的ROS，增强HaCaT细胞对ALA-PDT诱导的细胞死亡或凋亡的抵抗。结论 改变光动力反应前后细胞内的基态氧与单线态氧含量，能调控ALA-PDT诱导的HaCaT细胞凋亡和死亡。     

葡萄籽原花青素对中波紫外线诱导HaCaT细胞氧化损伤的保护作用

目的: 明确葡萄籽原花青素（ GSPE）对 UVB损伤角质形成细胞的保护作用。方法: 体外培养HaCaT细胞,分为正常对照组、UVB组、UVB+GSPE高剂量(200 μg/mL) 、中剂量(100 μg/mL)和低剂量组(50μg/mL)。CCK-8法检测HaCaT细胞增殖能力;Annexin V-FITC/PI染色后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;比色法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,丙二醛(MDA)和LDH水平。DCFH-DA染色法测定细胞内活性氧水平;罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位水平。Western blot检测细胞内Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3蛋白表达。结果: UVB+GSPE组与UVB组比较,细胞SOD和GSH-Px活性、Bcl-2 表达量和线粒体膜电位水平增高,MDA、LDH水平、凋亡细胞数、Bax、Cleaved-caspase-3表达和细胞内活性氧水平明显降低。结论: GSPE对中波紫外线辐射诱导的表皮角质形成细胞凋亡、氧化损伤具有一定的保护作用。     

TNF-α、IFN-γ诱导人角质形成细胞β防御素的表达

目的:检测TNF-α、IFN-γ诱导HaCaT细胞β-防御素的表达。方法:用TNF-α、IFN-γ、TNF-α加IFN-γ干预HaCaT细胞后,RT-RCR方法检测hBD-2 mRNA、hBD-3 mRNA的表达。结果:TNF-α干预组HaCaT细胞中hBD-2 mRNA、hBD-3 mRNA,IFN-γ干预组HaCaT细胞中hBD-3 mRNA表达增高(P0.05),干预12 h时的表达量高于干预24 h时的表达量;TNF-α与IFN-γ联合干预HaCaT细胞12 h时,hBD-2 mRNA、hBD-3 mRNA表达量最高。结论:TNF-α能刺激人角质形成细胞产生hBD-2和hRD-3,而IFN-γ仅能诱导产生hBD-3。     

蒺藜皂苷抑制肿瘤坏死因子α和干扰素γ诱导HaCaT细胞的炎症反应

目的探讨蒺藜皂苷(gross saponins of tribulus terrestris,GSTT)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)刺激后HaCaT细胞的炎症相关因子产生的影响及可能机制。方法采用CCK-8细胞活力测定法检测不同浓度蒺藜皂苷对HaCaT细胞增殖的影响,ELISA法检测蒺藜皂苷对TNF-α和IFN-γ刺激后HaCaT细胞趋化因子产生的影响; Western印迹法对诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase,i NOS)、环氧合酶-2 (Cyclooxygenase-2,COX-2)、丝聚合蛋白(Filaggrin,FLG)、外皮蛋白(Involucrin,IVL)以及NF-κB通路和MAPK通路的相关蛋白进行了检测;免疫荧光法检测了TNF-α和IFN-γ刺激后HaCaT细胞核因子κB(NF-κB)蛋白核转位。结果在所选浓度内,蒺藜皂苷对HaCaT细胞增殖无明显影响,下调了TNF-α和IFN-γ诱导的HaCaT细胞培养上清中胸腺和活化调节趋化因子(TARC),人巨噬细胞来源的趋化因子(MDC),调节激活正常T细胞表达分泌因子(RANTES)和白介素-8(IL-8)的表达。蒺藜皂苷能剂量依赖性抑制TNF-α和IFN-γ诱导的HaCaT细胞i NOS和COX2的表达,促进FLG和IVL蛋白的表达;并降低TNF-α和IFN-γ诱导的HaCaT细胞胞核内p65的水平,抑制p65的核转位,提高胞浆内IκB的水平;蒺藜皂苷能剂量依赖性抑制TNF-α和IFN-γ诱导的HaCaT细胞MAPK通路中p38蛋白和ERK蛋白的磷酸化。结论蒺藜皂苷可能通过调节NF-κB通路和p38/ERK MAPK通路的活化抑制了TNF-α和IFN-γ刺激后HaCaT炎症相关因子产生,促进皮肤屏障功能的恢复。     

南五味子提取物对UVB辐射的防护作用观察

目的观察南五味子提取物(schisandra extract)对中波紫外线(ultraviolet radiation b,UVB)辐射造成的人永生化角质细胞(HaCaT细胞)、人真皮成纤维细胞(Fb细胞)损伤的保护作用并探讨其机制。方法 MTT检测各组细胞存活率;Hoechst 33342染色观察HaCaT细胞形态学凋亡;流式细胞仪测定南五味子提取物对UVB辐射后Fb细胞凋亡率的影响;激光共聚焦观察各组细胞产生的活性氧簇(ROS)及检测其荧光强度;试剂盒测定HaCaT细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力和Fb细胞内外羟脯氨酸(HYP)含量。结果南五味子提取物对HaCaT,Fb细胞生长未显示出抑制作用,但可以抑制UVB辐射引起的细胞凋亡;南五味子提取物显著降低了由UVB辐射产生的ROS的量,升高细胞外GSH-PX,SOD水平并降低细胞内HYP水平。结论南五味子提取物可能通过其抗氧化活性抑制UVB辐射引起的氧化应激、细胞凋亡和细胞内胶原降低,减轻UVB辐射造成的皮肤损伤及光老化。     

大麻素2型受体激动剂JWH133对人永生化角质形成细胞体外增殖以及细胞因子表达影响的研究

目的探讨JWH133对人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)体外增殖以及经肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导后细胞因子表达的影响。方法首先用不同浓度JWH133(15、30、60μmol/L)分别作用于Ha Ca T细胞。采用CCK-8法检测JWH133作用12、24、36 h后对HaCaT细胞体外增殖的影响,流式细胞仪检测JWH133对HaCaT细胞凋亡率的影响。其次采用抗体芯片检测技术分别检测20 ng/ml TNF-α组、20 ng/ml TNF-α+30μmol/L JWH133组中细胞因子表达的变化,并采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行定量分析,以验证抗体芯片检测结果的可靠性。结果 15、30、60μmol/L JWH133作用12、24、36 h后对HaCaT细胞体外增殖均有不同程度的抑制作用。随着时间延长和JWH133浓度的增加,JWH133对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用均逐渐增强(F=187.1、2678.9,P 0.05)。60μmol/L JWH133作用24 h后,凋亡率由(4.34±0.07)%(阴性组)增加至(21.77±0.40)%(JWH133组)(P 0.05)。20 ng/ml TNF-α能够诱导HaCaT细胞不同程度增加白细胞介素19(IL-19)、IL-22、IL-23等细胞因子的高表达,而30μmol/L JWH133处理后可降低上述细胞因子的表达。结论大麻素2型受体激动剂JWH133可抑制HaCaT细胞体外增殖、促进凋亡,且能够抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞中一些重要免疫分子的表达。     

N-乙酰半胱氨酸对PM2.5引起HaCaT细胞损伤的保护作用

目的:研究N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)对PM2.5诱导的HaCaT细胞损伤的影响.方法:HaCaT细胞分为NAC干预组、不同浓度PM2.5组(25、50、100、200、400μg/mL)及空白对照组.DCFH-DA荧光探针法检测HaCaT细胞内活性氧(ROS)的水平,RT-PCR...     

姜黄素对肿瘤坏死因子-α诱导的HaCaT细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨姜黄素对肿瘤坏死因子（TNF）-α诱导的HaCaT细胞增殖及凋亡的影响。方法 MTT法检测不同浓度重组TNF-α（0、1、5、10、25、50、100 ng/ml）、姜黄素20 μmol/L对HaCaT细胞增殖的影响。蛋白印迹实验检测25 ng/ml TNF-α和20 μmol/L姜黄素作用下HaCaT细胞PCNA、 Notch-1 的蛋白表达。使用Annexin-V/PI试剂盒在流式细胞仪上检测25 ng/ml TNF-α和20 μmol/L姜黄素作用下HaCaT细胞早期凋亡情况。结果 TNF-α呈浓度依赖性促进HaCaT细胞增殖,25 ng/ml TNF-α对HaCaT细胞的促增殖基本达到最大,20 μmol/L姜黄素有效抑制25 ng/ml TNF-α对HaCaT细胞的促增殖作用,25 ng/ml TNF-α对HaCaT细胞无明显促凋亡作用,而20 μmol/L姜黄素有效促进HaCaT细胞发生凋亡,并可激发25 ng/ml TNF-α对HaCaT细胞的凋亡诱导作用。 结论 姜黄素可激发TNF-α对HaCaT细胞的促凋亡作用,同时抑制TNF-α对HaCaT细胞促增殖作用。     

本维莫德对HaCaT细胞增殖、炎症因子分泌及皮肤屏障因子产生的影响

【摘要】 目的 研究本维莫德对人角质形成细胞增殖、炎症细胞因子分泌、皮肤屏障蛋白合成以及信号转导与转录激活蛋白1（STAT1）磷酸化的影响。方法 体外培养HaCaT细胞,采用0.1 ~ 1 000 μmol/L本维莫德处理24 h,用CCK8法检测细胞增殖。部分HaCaT细胞分为6组,对照组仅加入DMEM培养基,刺激剂组加入10 μg/L肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素γ（IFN-γ）,本维莫德组加入10 μg/L TNF-α和IFN-γ以及终浓度为1 ~ 10或1 ~ 100 μmol/L本维莫德,AhR拮抗剂组加入10 μg/L TNF-α和IFN-γ、10或100 μmol/L本维莫德以及10 nmol/L StemRegenin1（SR1）,处理24 h后,酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清液中白细胞介素（IL）-4、IL-10、IL-22和胸腺活化调节趋化因子（TARC）的水平,RT-PCR检测HaCaT细胞芳香烃受体（AhR）、细胞色素P450 1A（CYP1A1）、聚丝蛋白、内披蛋白、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）和TARC mRNA的表达水平,Western印迹法检测聚丝蛋白、内披蛋白、TSLP和STAT1及磷酸化STAT1（p-STAT1）的蛋白表达水平,免疫荧光检测本维莫德对HaCaT细胞中AhR核转位的影响。计量资料采用非配对Student t检验和单因素方差分析进行比较,Spearman检验分析各指标间的关系。结果 0.1、1、10、100、1 000 μmol/L本维莫德干预HaCaT细胞24 h后,细胞存活率分别为（90.2 ± 2.4）%、（85.4 ± 11.9）%、（52.8 ± 14.0）%、（39.4 ± 7.9）%、（27.5 ± 3.4）%,各组间差异有统计学意义（F = 162.5,P < 0.001）,50%抑制浓度为48.54 μmol/L。与刺激剂组相比,10和100 μmol/L本维莫德组HaCaT细胞分泌的IL-10水平上升（F = 16.110,P < 0.001）,但100 μmol/L组IL-22（F = 6.884,P < 0.001）和10、100 μmol/L组 TARC水平（F = 7.052,P < 0.001）显著下降。与刺激剂组相比,1 和10 μmol/L本维莫德组CYP1A1 mRNA表达（P = 0.004）和10 μmol/L本维莫德组FLG mRNA表达（P = 0.040）水平显著增高,而10 μmol/L组 TARC mRNA和10 μmol/L组TSLP mRNA表达显著降低（均P < 0.01）,而刺激剂组和本维莫德组间AhR mRNA的表达差异无统计学意义（P = 0.193）。与刺激剂组相比,10 μmol/L本维莫德组聚丝蛋白（P = 0.020）和1、10 μmol/L本维莫德组内披蛋白表达水平（P < 0.001）显著上升,而10 μmol/L TSLP蛋白表达水平显著下降（P < 0.001）,1和10 μmol/L本维莫德组p-STAT1蛋白表达水平显著下降（P < 0.001）。与100 μmol/L 本维莫德组相比,AhR拮抗剂组IL-10分泌水平显著下降（t = 4.794,P = 0.003）,TSLP mRNA的表达显著上升（t = 3.769,P = 0.005）;与10 μmol/L 本维莫德组相比,AhR拮抗剂组 IVL蛋白表达显著下降（t = 5.117,P = 0.002）,TSLP蛋白表达显著上升（t = 3.117,P = 0.043）, p-STAT1蛋白表达无明显变化（t = 1.400,P = 0.719）。免疫荧光染色显示对照组和1 μmol/L本维莫德组中AhR绿色荧光主要表达于HaCaT细胞胞质中,细胞核中基本无荧光表达;而在10 μmol/L和20 μmol/L本维莫德组HaCaT细胞的细胞质和细胞核均可见高密度绿色荧光。结论 本维莫德可通过活化AhR信号通路抑制HaCaT细胞增殖,调节炎症因子分泌,上调皮肤屏障相关因子的产生和抑制STAT1磷酸化。     

白细胞介素22对HaCaT细胞CCL28表达的影响

目的探讨白细胞介素(IL-22)对HaCaT细胞黏膜相关上皮趋化因子(CCL28)表达的影响。方法培养HaCaT细胞,将其分为6组:4个IL-22组(分别用12.5、25、50、100μg/L的IL-22进行干预处理);阻断剂组(50μmol/L PD98059阻断干预,2 h后加入50μg/L IL-22);对照组(用PBS处理)。24 h后,用CCK-8检测细胞的增殖;用实时荧光定量RT-PCR检测CCL28 mRNA的水平变化;用蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法和免疫荧光检测CCL28蛋白水平的变化。结果CCK-8检测显示,上述浓度的IL-22作用于HaCaT细胞24 h后,对细胞的增殖有明显的促进作用,且这种促进作用能被PD98059抑制,差异具有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量RT-PCR检测显示,上述浓度的IL-22作用于HaCaT细胞,细胞中CCL28 mRNA逐渐升高,均较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.01);通路阻断剂组较50μg/L IL-22组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。用蛋白免疫印迹法和酶联免疫法检测到CCL28蛋白水平变化的趋势与实时荧光定量RT-PCR检测到的CCL28 mRNA的水平变化的趋势一致,且差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光检测显示,HaCaT细胞内CCL28蛋白主要表达在细胞质。结论IL-22可剂量依赖促进HaCaT细胞增殖和CCL28的表达,其可能通过MAPK-ERK1/2通路作用。     

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制白细胞介素17诱导的角质形成细胞增殖和凋亡

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对白细胞介素17(IL-17)诱导的角质形成细胞损伤的保护作用及其机制.方法 实验分空白对照组、IL-17组、IL-17+ EGCG组、IL-17+ SP600125组和IL-17+EGCG+茴香霉素组.CCK-8试剂盒检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;ELISA试剂盒检测IL-6、IL-23和IL-8的表达;Western印迹检测JNK和P-JNK的表达.结果 IL-17促进HaCaT细胞增殖,且增殖率与IL-17浓度有关,90 μg/L IL-17组的细胞增殖率最高(P＜0.05).60 μmol/L EGCG显著抑制90 μg/L IL-17诱导的细胞增殖(P＜0.05),促进细胞凋亡(P＜0.05),降低IL-6、IL-23和IL-8的表达(P＜0.05).与IL-17组相比,IL-17+ EGCG组、IL-17+ SP600125组的P-JNK表达显著下调(P＜ 0.05),细胞增殖率降低(P＜0.05),IL-6、IL-23和IL-8的表达减少(P＜0.05);与IL-17+ EGCG组相比,IL-17+ EGCG+茴香霉素组的P-JNK表达显著上调(P＜0.05),细胞增殖率和IL-6、IL-23、IL-8的表达均明显上升(P＜0.05).结论 EGCG对IL-17诱导的HaCaT细胞增殖凋亡、炎症反应等损伤具有保护作用,其保护作用可能与抑制JNK信号通路有关.     

他克莫司对HaCaT细胞核因子-κB和糖皮质激素受体表达的影响

目的 探讨他克莫司对TNF-α刺激的HacaT细胞核因子-κB(NF-κB)表达的影响,以及对HaCaT细胞糖皮质激素受体(GR)α和β表达的影响.方法 采用Western印迹和免疫荧光-激光共聚焦显微镜技术观察:①以TNF-α(10μg/L)单独或TNF-α(10μg/L)与他克莫司(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)同时作用HaCaT细胞,在24h和48h分别观察胞核NF-κB的表达;②以他克莫司(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)作用HaCaT细胞,在12h、24h和36h分别观察GRα和GRβ的表达.结果 未处理组HaCaT细胞的胞核有NF-κB(p65)蛋白的表达,灰度值比值为0.4988±0.03506;TNF-α作用24h和48h后,HaCaT细胞胞核NF-κB(p65)表达随时间延长而增强,灰度值比值分别为0.73±0.0316和0.8925±0.0171,与未处理组相比较.差异均有统计学意义(P<0.05).TNF-α与10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6mol/L他克莫司同时作用组HaCaT细胞胞核NF-κB表达灰度值比值分别为0.6825±0.0263、0.6200±0.0163和0.5575±0.0299,NF-κB表达随他克莫司浓度增加而减弱,后两组与TNF-α单独作用组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).各浓度他克莫司作用24h和48h的NF-κB表达差异均无统计学意义(P>0.05).与未处理组相比,不同浓度他克莫司作用HaCaT细胞后,各时相点GRα和GRβ的表达差异均无统计学意义(P>0.05).结论 他克莫司能以浓度依赖方式抑制TNF-α刺激的角质形成细胞胞核NF-κB的表达,不影响角质形成细胞GRα和GRβ的表达.     

P物质对HaCaT细胞一氧化氮合成的影响

目的 观察P物质、NK1受体拮抗剂和一氧化氮合酶（NOS）抑制剂对体外培养的人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞一氧化氮（NO）分泌和诱生型NOS（iNOS）表达的影响。方法 用不同浓度P物质（10-9 ～ 10-6 mol/L）或联合应用10-8 mol/L P物质和3 × 10-7 mol/L spantide、10-7 mol/L氨基胍、10-6 mol/L 7-硝基吲唑、10-5 mol/L L-NAME处理HaCaT细胞24 h,硝酸还原酶法测定培养上清液中NO含量。HaCaT细胞中加入10-8 mol/L P物质,1 h、24 h、48 h后用RT-PCR检测iNOS mRNA表达。结果 10-9 ～ 10-6 mol/L P物质可诱导HaCaT细胞分泌NO,其中以10-8 mol/L P物质效应最明显。Spantide在各个时间点上（30 min及1、3、6、12、24 h）均可明显抑制P物质诱导的HaCaT细胞NO合成（P < 0.01）,L-NAME组在3个时间点上（30 min、1 h、24 h）、7-硝基吲唑组在30 min、1 h后HaCaT细胞NO水平明显低于P物质组（P < 0.05）,但氨基胍组与P物质组在各个时间点上差异均无统计学意义（P > 0.05）。10-8 mol/L P物质处理HaCaT细胞后24 h、48 h,iNOS mRNA表达量分别为0.199 ± 0.018、0.516 ± 0.030,两个时间点之间差异有统计学意义（P < 0.01）。结论 P物质可通过激活细胞上NK1受体促进HaCaT细胞分泌NO,但iNOS可能不是P物质诱导HaCaT细胞分泌NO的主要来源。     

沙利度胺对HaCaT细胞分泌血管内皮细胞生长因子及肿瘤坏死因子α的影响

目的 探讨沙利度胺对HaCaT细胞增殖及血管内皮细胞生长因子（VEGF）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达的影响。方法 体外培养的HaCaT细胞分为阴性对照组及不同浓度沙利度胺实验组;采用水溶性四氮唑法（WST-1）检测沙利度胺对HaCaT细胞增殖的影响,实时定量PCR法检测HaCaT细胞VEGF及TNF-α mRNA的表达水平,ELISA法检测HaCaT细胞VEGF及TNF-α蛋白的表达水平。采用单因素方差分析进行统计分析。结果 沙利度胺浓度在0.01 ～ 100 nmol/L之间时,可抑制VEGF mRNA（0.439 ～ 0.634,P ＜ 0.01）与蛋白（0.587 ～ 0.923,P ＜ 0.05）的表达;浓度在0.1 ～ 100 nmol/L之间时,可抑制TNF-α mRNA（0.493 ～ 0.587,P ＜ 0.05）与蛋白（0.408 ～ 0.617,P ＜ 0.01）的表达。结论 沙利度胺在一定浓度范围可抑制角质形成细胞增殖及减少VEGF及TNF-α表达。 【关键词】 角蛋白细胞; 沙立度胺; 血管内皮生长因子类; 肿瘤坏死因子α