类风湿关节炎患者外周血单核细胞诱导转分化为破骨样细胞

目的 建立类风湿关节炎(RA)患者外周血单核细胞(PBMCs)转分化的培养体系,并对所培养的破骨样细胞(OLC)进行鉴定.方法 抽取RA患者外周静脉血,密度梯度离心法获得PBMCs,分别接种于玻片和骨磨片.随机分为单核细胞集落刺激因子(M-CSF)组(A组),加入25μg/L M-CSF;协同作用组(B组),分别加入不同浓度的核因子κB受体活化子配体(RANKL),5、10、20、25、50μg/L)和25μg/L M-CSF.培养至4、12和20 d时,取玻片行HE染色和抗酒石酸磷酸酶染色计数OLC,取骨磨片行甲苯胺兰染色检测OLC骨吸收活性.结果 对OLC转分化的影响:各组细胞分别于4、12、20 d染色,显示RANKL呈浓度及时间依赖性诱导OLC形成(P<0.05).对OLC骨吸收活性的影响:RANKL和M-CSF协同诱导骨磨片上吸收陷窝的形成,RANKL呈浓度及时间依赖性增强OLC的吸收活性(P<0.05);单独M-CSF刺激不能形成骨吸收陷窝.结论 RANKL和M-CSF可协同诱导RA患者PBMCs转分化为OLC,该培养方法稳定、有效,具有可重复性.     

OPGL诱导小鼠外周血单核细胞分化为破骨细胞及其破骨活性

目的 :观察在小鼠外周血单核细胞培养中破骨细胞抑制因子配基 (osteoprotegerinligand ,OPGL)诱导单核细胞分化为破骨细胞的作用 ,以及地塞米松对破骨细胞分化和骨吸收活性的影响 .方法 :将外周血单核细胞分组培养 ,在A组中加入巨噬细胞集落刺激因子和OPGL ,B组中再加入地塞米松 .多核巨细胞形成后行抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartratere sistantacidphosphatase,TRAP)及甲苯胺蓝染色 .将象牙骨片上骨吸收面积经计算机图像分析以确定其差异 .结果 :外周血单核细胞培养 7～ 10d ,可以见到大量的多核巨细胞 ,体积巨大 .B组中 ,多核巨细胞出现较A组早 .几乎所有的多核巨细胞表现为TRAP强阳性 ,而多数单核细胞和巨噬细胞为TRAP阴性或弱阳性 .在象牙骨片上有大量的骨吸收陷窝形成 ,A、B两组的骨吸收无明显差异 (P >0 .0 5 ) .结论 :OPGL可以诱导小鼠外周血单核细胞分化为破骨细胞并具有骨吸收活性 .地塞米松可加速OPGL诱导的破骨细胞分化作用 ,但对于破骨细胞的骨吸收活性无影响     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

人外周血CD68^＋单核细胞体外的分选及诱导分化为破骨细胞

OBJECTIVE: To establish a method for obtaining highly purified primary human osteoclast precursors for the biochemical and molecular biological research. METHODS: CD68(+) mono/macrophages were separated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy donors by means of immunomagnetic cell sorting for subsequent analysis with flow cytometry. The isolated cells were incubated on coverslips or bone slices in the presence of dexamethasone(10(-8) mol/L), macrophage colony-stimulating factor (25 microg/L ) and soluble receptor activator of nuclear factor (NF)-kappaB ligand (s-RANKL, 16 microg/L). Calcitonin receptor (CR) immunocytochemistry and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) histochemistry were employed. The bone slices were also studied by scanning electron microscopy (SEM). RESULTS: Fluorescence-activated cytometric analysis showed that 93.06%+/-0.61% n=4 of the selected cells were CD68(+) cells. After 7 days of culture of the CD68(+) cells, VR+, TRAP+ multinucleated giant cells appeared, and resorption lacunae could be observed by SEM. CONCLUSION: Highly purified CD68(+) cells can be obtained from human PBMCs as the osteoclast precursors, and mature osteoclasts can be induced from CD68(+) mono/macrophages by RANKL.     

人外周血CD68+单核细胞体外的分选及诱导分化为破骨细胞

目的 建立高纯度人活性破骨细胞方法,用于对破骨细胞生物化学和分子生物学的研究。方法 用免疫磁珠法在人类外周血单核细胞中分选出CD68⁺细胞,用流式细胞仪分析分选效能,体外在10^-8 mol/L地塞米松及25 μg/L巨噬细胞集落刺激因子的培养条件下用16 μg/L可溶性核因子κB受体活化子配体诱导(s-RANKL)分化,用降钙素受体抗体免疫组化染色及抗酒石酸磷酸酶染色鉴定,扫描电镜观察骨片贴壁细胞及骨吸收陷窝。结果 分选获得CD68⁺单核细胞纯度为(93.06±0.61)%(n=4),经核因子κB受体活化子配体诱导后降钙素受体抗体免疫组化染色阳性,抗酒石酸磷酸酶染色,扫描电镜观察有骨吸收陷窝形成。结论 人外周血单核细胞中CD68⁺细胞是破骨前体细胞,在RANKL在诱导下分化为成熟破骨细胞。     

体外紫云英苷抑制小鼠BMM细胞向破骨分化

目的 研究紫云英苷对小鼠骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage, BMM)向破骨细胞分化的影响。方法 从C57BL/6小鼠的股骨与胫骨骨髓腔中提取小鼠BMM细胞,并使用含核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和梯度浓度的紫云英苷(0、50、100、200μmol/L)的培养基培养5~7天,通过TRAP染色、共聚焦荧光染色与RT-PCR检测BMM细胞向破骨细胞分化的水平。结果 培养5~7天后,TRAP染色与F-actin环检测显示紫云英苷显著抑制了RANKL诱导下小鼠BMM细胞向破骨细胞的分化,且抑制效果与紫云英苷浓度相关,差异有统计学意义(P均<0.01),RT-PCR结果显示紫云英苷显著抑制了小鼠BMM细胞中破骨分化相关基因TRAP、CTSK、NFATc1的表达,差异有统计学意义(P均<0.01)。结论 紫云英苷能够有效抑制RANKL诱导下小鼠BMM细胞向破骨细胞的分化。     

ED-71和1α(OH)D3对破骨样细胞的影响

目的探讨2 β(3-羟丙氧)骨化醇(ED-71)和1α(OH)D 3对破骨细胞的影响.方法取新鲜的人破骨样细胞(OLC)(骨巨细胞)置入含α-MEM培养液的24孔板中.在培养系中分别加入10 -7 ～10 -9 mol/L ED-71与1α(OH)D 3,观察细胞形态学变化,于培养第3 d、6 d计数和拍照.结果 OLC的数目在给药后第3 d,10 -9 、10 -8 mol/L ED-71组与空白组OLC数目间差别均有显著性意义(P<0.05);第6 d,3种浓度的ED-71组与空白组OLC数目间差别均有显著性意义(P<0.05).在给药后第3 d、6 d,10 -9 mol/L 1α(OH)D 3组OLC数目无明显变化,10 -7 mol/L 1α(OH)D 3组与空白组比较OLC数目间差别有显著性意义(P<0.05).结论 10 -9 和10 -8 mol/L ED-71明显抑制 OLC增殖,10 -7 mol/L ED-71和10 -7 mol/L 1α(OH)D 3对OLC的成熟和增殖有明显的促进作用.     

塞隆骨提取物对体外大鼠成骨样细胞ROS17/2.8的影响

目的研究塞隆骨提取物对体外培养大鼠成骨样细胞ROS17/2.8代谢功能的调节作用,从而在细胞水平上阐述塞隆骨防治骨质疏松的作用机制及药效成分的筛选。方法采用超临界萃取法制备塞隆骨的脂、醇、水提液及水煎提取液,用MTT法测定塞隆骨脂、醇、水提液及水煎液对成骨样细胞的增殖作用;测定碱性磷酸酶(ALP)活性,观察上述提取液对细胞分化的影响。结果10mg/mL塞隆骨脂提液和水提液对大鼠成骨样细胞ROS17/2.8有显著的增殖作用(P<0.01);ALP检测结果显示,10mg/mL脂提液能极显著增强成骨样细胞内ALP活性(P<0.01),1.0、0.1mg/mL能提高ALP活性(P<0.05);10mg/mL水提液能使ALP活性升高(P<0.05)。结论塞隆骨脂和水提取液中分别存在有较高活性的促成骨样细胞增殖、分化的物质,可作为虎骨的替代中药。     

两种不同培养方法对破骨细胞ATPase a3基因表达和骨吸收活性的影响

[目的]探讨不同方法培养下的大鼠破骨细胞（osteoclast,OC）骨吸收功能的差异,以及骨吸收关键基因ATPasea3的mR—NA表达水平的差异,为体外实验奠定基础。[方法]机械分离和诱导培养,即从新生24h的大鼠长干骨骨髓腔内壁机械分离成熟OC和1,25（OH）2D3诱导大鼠骨髓细胞形成破骨样细胞（osteoclast like cell,OLC）,对获得的OC进行形态和骨吸收功能观察,并测定OC骨吸收关键基因ATPasea3的mRNA表达水平的差异。[结果]OC和OLC均为抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色阳性的多核巨细胞,与细胞共培养骨片上可形成骨吸收陷窝;诱导法培养出的OLC数目多于机械分离法,但诱导早期陷窝较之小而浅,诱导后期基本接近OC;OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA,在机械分离8h与诱导培养6天的细胞表达量无显著差异,但都远少于培养8天的表达量。[结论]诱导法可以培育出大量的OLC,优于机械分离法,但早期骨吸收功能较弱,OC骨吸收功能与其核数相关。后期的OCL与机械分离OC接近,可以用于各类实验。     

促甲状腺激素对破骨细胞分化的影响

目的 探讨促甲状腺激素(TSH)对小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞诱导分化为破骨样细胞过程的影响.方法 体外培养小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞,以破骨细胞分化因子(RANKL)诱导分化,同时加用不同浓度TSH处理7d,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定并计数阳性细胞数量,采用Real-time PCR方法检测分化标志蛋白TRAP、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及组织蛋白酶K(Cathepsin K)的基因表达.结果 RAW264.7细胞可在RANKL诱导下分化为破骨样细胞,高表达TRAP、MMP-9和Cathepsin K基因,TSH可剂量依赖性抑制细胞分化并下调上述基因的表达.结论 TSH可抑制破骨细胞的分化,对于维持骨量可能具有重要作用.     

聚乳酸材料对成骨样细胞增殖和分化的影响

目的 研究聚乳酸对成骨样细胞增殖和分化的影响。方法 电镜观察未处理和经预处理的聚乳酸膜。分别将未处理（材料组）和经预处理（处理组）的聚乳酸薄膜与成骨样细胞体外共同培养,观察细胞形态学变化、MTT测定细胞的增殖以及测定碱性磷酸酶（ALP）活性。结果 ①电镜结果显示未处理膜与处理后的膜有细微差别。②材料组细胞与对照组相比出现明显的聚集样生长,细胞形态构成以多角形、星形比例为高,材料组MTT及ALP测定结果均低于对照组（P＜0．05）。预处理组与对照组细胞形态学的差异仅在实验开始3d可以观察到;而细胞的增殖及ALP活性与对照组的差异无统计学意义。结论 预处理后的聚乳酸薄膜对成骨样细胞增殖和分化并无抑制作用．在某种程度上．经处理后反而对其有轻微的促进作用。     

不同代数RAW264.7细胞分化为破骨细胞样细胞的能力研究

目的:观察不同代数RAW264.7细胞形成破骨细胞样细胞的能力是否改变.方法:以细胞核因子κB受体激活物的配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)为诱导剂,选用第6、9、13、18、24代RAW264.7细胞在体外诱导6天,固定细胞行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-...     

生长因子网络调节对骨形成作用的研究--Ⅵ.多种生长因子联合应用对人胚成骨样细胞增殖及分化的影响

研究转化生长因子（（ Ｔ Ｇ Ｆβ）、胰岛素样生长因子Ⅱ（ Ｉ Ｇ ＦⅡ）、碱性成纤维细胞生长因子（ｂ Ｆ Ｇ Ｆ）及血小板衍生性生长因子（ Ｐ Ｄ Ｇ Ｆ）等四种生长因子中，三种生长因子交互应用和四种生长因子联合应用对人胚成骨样细胞增殖与分化的影响。在不同的实验期间检测成骨样细胞３ Ｈ胸腺嘧啶脱氧核苷（３ Ｈ Ｔｄ Ｒ）、３ Ｈ脯氨酸（３ Ｈ Ｐｒｏｌｉｎｅ）的掺入量和碱性磷酸酶的含量。结果显示：三种和四种生长因子交互联合应用，对人胚成骨样细胞增殖与分化有明显的促进作用。预示具有协同作用的生长因子联合应用，可提高其促进骨形成的生物学效应，可能成为临床治疗骨疾病和修复骨缺损的一种新途径。     

成骨生长肽羧基端5肽OGP（10-14）及其类似物对大鼠破骨样细胞增殖的影响

目的：应用骨髓细胞诱导体系、骨髓细胞与成骨细胞（OB）共培养体系，分别观察成骨生长肽羧基端5肽OGP（10-14）及其结构类似物G48A对体外培养SD大鼠破骨样细胞（0LC）增殖的影响。方法：采用无血清培养条件，分别观察OGP（10-14）、G48A、RG—DY肽（精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-酪氨酸）对骨髓细胞诱导体系、骨髓细胞和OB共培养体系中OLC形成的影响。结果：骨髓细胞与OB共培养体系组（G36G＋0B组，G48A＋OB组）OLC形成数目较骨髓细胞诱导体系（G36G组，G48A组）有增多趋势。     

尖锐湿疣患者外周血CD14^＋单核细胞Toll样受体的表达

目的探讨CD14+单核细胞Toll样受体(TLRs)的表达在尖锐湿疣发病机制中的作用. 方法采用双色免疫荧光染色流式细胞术检测了34例尖锐湿疣患者外周血CD14+单核细胞表面TLR1、TLR2及TLR4的表达. 结果尖锐湿疣患者外周血CD14+单核细胞TLR4表达水平为(4.8±1.7)%,明显高于对照组的(2.6±1.0)%(P＜0.001);CD14+单核细胞TLR1的表达水平为(11.8±3.8)%,明显低于对照组的(16.4±5.1)%(P＜0.001);TLR2为(90.8±6.6)%,与对照组的(90.4±6.7)%相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论单核细胞表面的TLR4在对病毒识别、增强特异性的信号传导、启动抗病毒的固有免疫反应中起着重要作用.     

细胞凋亡信息分子Fas、FasL和NF-κB在氟化物作用后破骨样细胞凋亡过程中的表达

目的研究氟化物作用后破骨细胞样细胞凋亡过程中细胞凋亡配体Fas、FasLFasLigand和核因子NF-κB的表达变化。方法在培养基中分别加入不同浓度的氟化钠培养破骨样细胞,以免疫组织化学染色方法观察细胞的Fas、FasL和NF-κB表达。结果Fas、FasL在破骨样细胞表达量随培养基中氟化钠浓度增高而增高;NF-κB的表达量随培养基中氟化钠浓度增高而降低,两者均具有剂量依赖关系。结论在氟化钠所致的破骨细胞凋亡过程中,Fas,Fas-L的表达随氟化物浓度增高而加强;而核因子NF-κB的表达随氟化物浓度增高而减弱,两者都具有剂量依赖关系。     

杯苋甾酮抑制破骨分化和促进成骨分化的双向作用治疗骨质疏松症

目的 研究杯苋甾酮对破骨和成骨分化的影响, 探讨其在改善骨质疏松中的作用.方法 以CCK8检测杯苋甾酮对小鼠源性单核巨噬细胞 (BMMs) 及前成骨细胞MC3T3E1的毒性作用;流式检测药物对细胞凋亡的影响.以TRAP染色观察破骨分化;以ALP染色评估成骨分化, 以Real-Time PCR检测TRAP及ALP的表达.15只小鼠分为假手术组、OVX组、治疗组.治疗组给予杯苋甾酮干预, 余2组以生理盐水处理.4周后取胫骨, Micro-CT检测骨质及微观结构变化.结果 杯苋甾酮≤10 mg/L时对细胞无毒性 (P>0.05) , 不影响凋亡 (P>0.05) .其可显著抑制破骨分化 (P<0.05) , 促进成骨分化.杯苋甾酮可抑制TRAP表达 (P<0.05) , 促进ALP表达 (P<0.05) .杯苋甾酮可改善雌激素缺乏导致的骨质疏松.结论 杯苋甾酮通过抑制破骨、促进成骨的双向作用达到改善骨质疏松的作用.     

乙肝患者外周血单核细胞Toll样受体2表达水平变化及其意义

目的探究乙肝患者外周血单核细胞Toll样受体2表达水平变化及其意义。方法将相继收入我院的慢性乙肝患者按病情严重程度进行分级（轻、中、重）。测量分为轻、中、重三级的患者的血单核细胞的TOLL样受体2的平均荧光强度,同时设立健康人为对照。结果30例正常人TLR2测定结果平均值为20.5±2.1（MFI）,30例轻度乙型慢性肝炎患者测定结果的平均值为26.4±2.7(MFI),两组平均免疫荧光值对比t=11.05, P<0.05,差异显著。三组乙型慢性肝炎中,轻度组、中度组、重度组的平均免疫荧光强度分别为26.4±2.7、30.8±1.9、49.9±15.8。轻度组和中度组、中度组和重度组对比,t值为7.30、6.57,且P<0.05。差异有统计学意义(P<0.05)。结论乙肝患者外周血单核细胞Toll样受体2表达水平随着慢性乙肝患者的病情严重程度增加而增加,且慢性乙肝患者的外周血细胞单个核细胞与正常健康人相比有显著增加。说明Toll样受体2和慢性乙型肝炎的发展有相关性,并且很可能参与了其发病的过程。     

IRAK-4基因沉默对人成骨样细胞凋亡的影响

【目的】研究siRNA沉默白细胞介素-1受体相关激酶-4(IRAK-4)基因对人成骨样细胞株MG63凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响。【方法】 以Lipofectamine 2000为载体将IRAK-4-siRNA转染入MG63细胞(CON组:不加入任何转染试剂;SC组:以scrambled siRNA序列进行转染;KD组:以特异性IRAK-4-siRNA序列进行转染),应用流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡水平,western blotting检测Bcl-2、Bax基因的表达。【结果】 与对照组相比,靶基因沉默组(KD组)细胞的IRAK-4 mRNA及蛋白表达水平显著降低;转染48h后,KD组细胞增殖变缓,凋亡增加,Bcl-2蛋白的表达明显下调且Bcl-2/BaxSC>Bcl-2/BaxKD; Spearman等级相关分析显示MG63细胞凋亡比例与Bcl-2/Bax的比值间有显著的相关性。 【结论】 siRNA沉默IRAK-4基因能够诱导人成骨样细胞株MG63凋亡,且靶细胞凋亡水平与Bcl-2、Bax基因表达水平的比值相关.