化痰通瘀解毒方水提取物通过Wnt/β-catenin信号通路抑制人胃癌细胞株MKN-45上皮-间质转化及侵袭迁移

目的:观察化痰通瘀解毒方对人胃癌细胞MKN-45侵袭迁移能力和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transformation,EMT)的影响,并探讨其与Wnt/β-catenin信号通路的相关性。方法:以转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1) 10 ng/m L诱导MKN-45细胞构建EMT模型;采用Transwell小室实验和划痕愈合实验检测细胞的侵袭、迁移能力;采用Western Blot法检测EMT标志蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平。结果:TGF-β1能够明显增强MKN-45细胞侵袭、迁移能力,诱导MKN-45细胞发生EMT:E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达上调;同时,TGF-β1能诱导MKN-45细胞Wnt1和β-catenin蛋白表达上调。化痰通瘀解毒方(10、20、40μg/m L)均可显著抑制TGF-β1诱导的MKN-45细胞侵袭迁移及EMT:E-cadherin蛋白表达上调,N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达下调;同时,化痰通瘀解毒方(10、20、40μg/m L)还可下调Wnt1和β-catenin蛋白表达,且上述结果中化痰通瘀解毒方在10、20、40μg/m L剂量组间存在剂量依赖性; Wnt/β-catenin信号通路特异性抑制剂XAV939与化痰通瘀解毒方40μg/m L均可明显抑制TGF-β1诱导的MKN-45细胞EMT和侵袭迁移,且XAV939可协同化痰通瘀解毒方40μg/m L抑制TGF-β1诱导的EMT和侵袭迁移。结论:化痰通瘀解毒方能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制TGF-β1诱导的EMT,进而降低MKN-45细胞侵袭迁移能力。     

肺岩宁下调转录因子Snail表达抑制人肺腺癌A549细胞EMT发生及侵袭转移

目的 研究肺岩宁抑制人肺腺癌A549细胞侵袭转移的分子机制。方法 体外培养A549细胞,细胞计数试剂盒（Cell counting kit 8,CCK-8）检测不同浓度的肺岩宁对A549细胞生长增殖的影响;细胞形态学观察和免疫印迹实验（Western blot）检测转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)对A549细胞上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transformation,EMT）发生的影响;Western blot、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）实验检测TGF-β1诱导前后,肺岩宁对A549细胞EMT标志蛋白及mRNA表达变化;划痕实验、Transwell实验检测TGF-β1诱导前后,肺岩宁对A549细胞侵袭和迁移能力的影响变化;构建稳定过表达Snail的A549细胞株,Western blot、RT-qPCR实验检测稳定过表达锌指转录因子（Snail）后,肺岩宁对A549细胞EMT标志蛋...     

扶正祛邪方对肺癌A549细胞发生上皮间质转化的抑制作用研究

目的:研究中药复方扶正祛邪方对肺癌A549细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的抑制作用及机制研究。方法:采用MTT方法观察扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用;Western blot方法观察A549细胞EMT过程中上皮细胞、间质细胞标志物E-cadherin、N-cadherin的表达,以及信号分子P-Smad2/3的表达;RT-PCR检测扶正祛邪方对I型胶原诱导人腺癌A549细胞EMT过程中TGF-β3mRNA的影响。结果:(1)MTT结果显示:扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖。(2)Western blot结果显示:与模型组相比,扶正祛邪方上调E-cadherin蛋白表达,下调N-cadherin、P-Smad2/3的蛋白表达(P<0.05);RT-PCR结果显示:扶正祛邪方下调TGF-β3mRNA的表达,呈浓度依赖性。结论:(1)扶正祛邪方对A549细胞有直接的抑制作用;(2)扶正祛邪方对TGF-β1诱导人腺癌A549细胞EMT有抑制作用,其机制与抑制I型胶原诱导TGF-β3mRNA表达,进而抑制Smad2/3的磷酸化,上调E-cadherin蛋白表达,下调N-cadherin蛋白表达有关。     

肺岩宁方调控TGF-β介导的骨转移相关PTHrP/RANKL信号通路抗肺癌侵袭转移

目的:探讨肺岩宁方通过调控转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)介导的骨转移相关甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)/NF-κB受体活化因子配体(receptor or activator of NF-κB ligand,RANKL)信号通路抗肺癌细胞侵袭转移的作用机制。方法:体外培养A549肺癌细胞,用不同终浓度肺岩宁方进行处理,未加肺岩宁方为空白组。分别采用cell counting kit-8(CCK-8)检测肺岩宁方对A549细胞增殖抑制作用,计算半数浓度抑制率(IC50);采用转移小室(transwell)侵袭实验、划痕实验检测肺岩宁方对A549细胞体外侵袭及迁移的抑制作用;以及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TGF-β,PTHrP,RANKL蛋白表达。结果:肺岩宁方作用于A549肺癌细胞48 h后,与空白组相比,肺岩宁方(12.5,25,50 mg·L~(-1))组穿膜细胞明显减少(P0.05,P0.01);肺岩宁方(12.5,25,50 mg·L~(-1))组的划痕距离较空白组明显降低(P0.05,P0.01);且肺岩宁方(25,50 mg·L~(-1))组作用于A549细胞后,TGF-β蛋白表达明显下调(P0.05),其对应下游靶基因PTHrP及RANKL蛋白也发生明显表达下调(P0.05)。结论:肺岩宁方可抑制A549肺癌细胞的侵袭迁移能力,直接下调TGF-β基因及其下游靶基因PTHrP,RANKL蛋白表达,且具有浓度相关性。本研究证实了肺岩宁方通过调控TGF-β介导的骨转移相关PTHrP/RANKL信号通路,以达到抗肺癌侵袭转移的作用机制,这为肺癌临床靶向治疗提供了一定的实验依据,也显示了肺岩宁方作为抗肺癌侵袭转移药物广泛的应用前景。     

臭牡丹总黄酮通过调控Wnt/β-catenin通路影响A549细胞上皮间质转化研究

目的探讨臭牡丹总黄酮对人肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其机制。方法将pcDNA3.1+空载体与S45位点突变的β-链蛋白(S45A-β-catenin)真核过表达载体转染A549细胞,给予臭牡丹总黄酮干预。MTT法检测细胞的相对存活率,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室侵袭实验检测细胞的侵袭能力,Western blotting法检测各组细胞β-catenin、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、转录因子Snail 2(Slug)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、p-GSK-3β的表达水平。结果转染S45A-β-catenin质粒后,A549细胞增殖、迁移、侵袭能力均明显增强,β-catenin、vimentin蛋白表达水平显著上调,E-cadherin、GSK-3β、P-GSK-3β蛋白的表达水平显著下调。臭牡丹总黄酮可抑制A549细胞的增殖、迁移与侵袭能力,对转染S45A-β-catenin质粒组的细胞作用尤为明显。对转染空载质粒的A549细胞,可上调E-cadherin、GSK-3β、P-GSK-3β表达,下调β-catenin、vimentin表达;对转染S45A-β-catenin质粒的A549细胞,可下调β-catenin、vimentin表达。结论抑制细胞中β-catenin的高表达并调控下游的一系列因子,从而影响Wnt/β-catenin通路诱导的上皮间质转化(EMT)现象可能是臭牡丹总黄酮抑制肺癌侵袭、转移的重要作用机制之一。     

益肺解毒汤对人肺腺癌A549细胞侵袭迁移的影响及相关机制

目的:观察益肺解毒汤对肺癌A549细胞侵袭转移的影响,并探讨该方对细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法:常规培养肺癌A549细胞,Co Cl2化学模拟肺癌A549细胞缺氧微环境,设空白组,以150μmol·L~(-1)Co Cl2,150μmol·L~(-1)Co Cl2+15 g·L~(-1)益肺解毒汤,15 g·L~(-1)益肺解毒汤处理细胞,镜下观察细胞形态学改变,transwell实验观察细胞侵袭能力;细胞划痕实验测细胞迁移能力;蛋白免疫印迹法(Western blot)测定A549细胞上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中上皮细胞、间质细胞标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达,转录因子Snail蛋白表达,信号分子β-链蛋白(β-catenin)、磷酸化糖原合成酶激酶-3(p-gsk-3β)表达。结果:缺氧可诱导A549细胞发生形态改变,益肺解毒汤可抑制缺氧诱导的形态改变。与空白组比较,Co Cl2组细胞侵袭和迁移能力增强(P0.05);与Co Cl2组比较,Co Cl2+益肺解毒汤组的细胞侵袭能力明显减弱(P0.01),迁移能力亦减弱(P0.05)。与空白组比较,Co Cl2组细胞EMT相关蛋白,E-cadherin表达下调,Vimentin,Snail表达上调(P0.05),说明缺氧使细胞发生了EMT;与Co Cl2组比较,Co Cl2+益肺解毒汤组可上调Ecadherin,p-gsk-3β,下调Vimentin,Snail,β-catenin蛋白表达(P0.05)。结论:益肺解毒汤能抑制缺氧诱导的A549细胞的形态变化、侵袭及迁移能力,还能抑制缺氧诱导的EMT的发生,其机制可能与Wnt/β-catenin通路有关。     

扶正祛邪方对肺癌A549细胞EMT的抑制作用及机制研究

目的:研究中药复方扶正祛邪方对肺癌A549细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的抑制作用及机制研究。方法:采用MTT方法观察扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用;采用Transwell方法观察扶正祛邪方对人腺癌A549细胞侵袭的抑制作用;Western blot方法观察A549细胞EMT过程中上皮细胞、间质细胞标志物E-cadherin、Vimentin、FN的表达,转录因子Snail的蛋白表达,以及信号分子PSmad2/3的表达。结果:1MTT结果显示:扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖。2Transwell侵袭实验结果显示:不同浓度的扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的穿膜能力有抑制作用(P0.05)。3Western blot结果显示:与模型组相比,扶正祛邪方上调E-cadherin蛋白表达,下调Vimentin、FN、P-Smad2/3蛋白表达(P0.05);结论:1扶正祛邪方对A549细胞有直接的抑制作用;2扶正祛邪方对TGF-β1诱导人腺癌A549细胞EMT有抑制作用,其机制与抑制Smad2/3的磷酸化,进而减少Snail蛋白的表达有关。     

肺岩宁方调控EMT逆转非小细胞肺癌顺铂耐药

目的 观察肺岩宁方（肺岩宁）对非小细胞肺癌顺铂耐药的影响，并探究其可能存在的机制。方法 细胞增殖与活性检测（CCK-8）法观察顺铂（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg?L^-1）对A549和A549/DDP（顺铂耐药）细胞细胞增殖能力的影响，肺岩宁（0、100、200、300、400、500、600 mg?L^-1）对A549/DDP细胞增殖能力影响；免疫荧光染色、蛋白免疫印迹法（WB）观察A549和A549/DDP组上皮间质转化（EMT）相关蛋白表达；将A549/DDP细胞分为空白组、肺岩宁组（200 mg?L^-1）、顺铂组（6.0 mg?L^-1）和联合用药组［肺岩宁（200 mg?L^-1）+顺铂（6.0 mg?L^-1）］，并进行相应处理，侵袭小室（transwell）实验比较各组侵袭能力；WB检测各组EMT相关蛋白表达；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和免疫荧光染色分别检测各组耐药因子mRNA和蛋白表达。结果 与A549组比较，A549/DDP组对顺铂耐药性显著增高（P<0.01）；E-钙黏蛋白（E-cadherin）蛋白表达降低，波形蛋白（Vimentin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、锌指转录因子（Snail）蛋白表达升高（P<0.05，P<0.01）。经肺岩宁、顺铂处理后，与空白组比较，肺岩宁可浓度依赖性抑制A549/DDP细胞增殖（P<0.01）；肺岩宁组、顺铂组、联合用药组侵袭能力降低（P<0.01）；与顺铂组比较，联合用药组侵袭能力显著降低（P<0.01）。与空白组比较，肺岩宁组E-cadherin蛋白表达升高，N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达降低（P<0.01），顺铂组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低，Snail蛋白表达升高（P<0.05，P<0.01）；联合用药组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达降低（P<0.01）；与顺铂组比较，联合用药组E-cadherin蛋白表达升高，N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达降低（P<0.01）。与空白组比较，肺岩宁组肺耐药相关蛋白（LRP）、多药耐药因子1（MDR1）蛋白和mRNA表达降低，拓扑异构酶Ⅱα （TOPO Ⅱα）蛋白和mRNA表达升高（P<0.01）；顺铂组LRP、MDR1、TOPO Ⅱα蛋白和mRNA表达升高（P<0.01）；联合用药组LRP蛋白和mRNA表达无明显改变，MDR1、TOPO Ⅱα蛋白和mRNA表达升高（P<0.01）；与顺铂组比较，肺岩宁组、联合用药组LRP、MDR1蛋白和mRNA表达降低，TOPO Ⅱα蛋白和mRNA表达升高（P<0.01）；与肺岩宁组比较，联合用药组LRP、MDR1、TOPO Ⅱα蛋白和mRNA表达升高（P<0.01）。结论 肺岩宁方能够逆转非小细胞肺癌顺铂耐药，其机制可能与调控EMT进程相关。     

益气除痰方干预TGF-β信号途径逆转A549细胞上皮间质转化研究

目的:观察益气除痰方是否能通过干预TGF-β信号途径,逆转肺癌A549细胞上皮间质转化(EMT)。方法:通过暴露于TGF-β_1环境中,诱导肺腺癌细胞株A549发生EMT,并以益气除痰方含药血清进行干预,相差显微镜下观察各组细胞形态变化;划痕实验、Transwell实验检测各组细胞迁移及侵袭能力;Western-blot检测各组细胞EMT相关蛋白及TGF-β信号通路蛋白Smad2/3的表达。结果:镜下可见经TGF-β_1孵育的A549细胞呈现明显的间质细胞形态,益气除痰方含药血清作用24 h后细胞A549细胞出现凋亡且间质化程度较低;划痕实验结果显示:与空白血清组比较,TGF-β_1+空白血清组A549细胞迁移及侵袭能力显著升高,益气除痰方可降低TGF-β_1所升高的细胞迁移及侵袭能力;Western-blot检测显示TGF-β_1可以激活Smad2/3通路下调E-cadherin的表达,上调Vimentin的表达,而益气除痰方含药血清可抑制该过程。结论:益气除痰方可能通过干预TGF-β/Smad信号通路上调E-cadherin表达,下调Vimentin表达,从而逆转肺癌A549细胞上皮间质转化,抑制肿瘤细胞的侵袭迁移。     

保肺饮对肺癌细胞EMT的作用及机制研究

目的:探讨保肺饮调控HGF逆转A549细胞EMT的作用及机制。方法:体外培养A549细胞,运用Western Blot方法检测保肺饮作用于A549细胞后对HGF、E-cadherin、vimentin蛋白表达的影响。结果:Western Blot结果显示不同剂量保肺饮作用下细胞E-cadherin表达增加,HGF、vimentin的表达降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论:保肺饮能通过下调HGF的表达逆转A549细胞EMT进程。