蛋白酶体抑制剂MG132诱导人巨噬细胞THP-1凋亡

泛素-蛋白酶体途径是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一，广泛参与细胞周期调控、DNA修复、细胞信号转导、细胞凋亡等多种生理过程。为了研究调控泛素一蛋白酶体途径表达对巨噬细胞THP-1凋亡和细胞内载脂蛋白B的蓄积的影响，本实验采用蛋白酶体抑制剂MG132(5／μmol／L)处理THP-1细胞，流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞内载脂蛋白B含量，用半定量逆转录一聚合酶链反应检测细胞内UPP途径相关基因的表达。结果发现：MG132可以诱导THP-1细胞凋亡；实验组细胞内载脂蛋白B蓄积增加；实验组细胞内泛素活化酶、泛素缀合酶和泛素-蛋白连接酶mRNA表达均降低，而26S蛋白酶体mRNA无显著改变。结果提示，蛋白酶体抑制荆MG132能够诱导THP-1细胞凋亡，其机制可能与MG132抑制泛素-蛋白酶体途径中泛素活化酶、泛素缀合酶和泛素一蛋白连接酶活性，使细胞内载脂蛋白B经泛素-蛋白酶体途径降解减少，在细胞内蓄积而使细胞凋亡率增加。     

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡及其对p53、p21和Bcl-2表达的影响

为研究单核细胞源性泡沫细胞凋亡机制 ,以氧化型低密度脂蛋白诱导人髓系白血病细胞U937凋亡 ,观察p5 3、p2 1和Bcl- 2的表达。用流式细胞术和DNA断裂分析检测细胞凋亡 ;用细胞免疫荧光标记结合流式细胞术检测p5 3、p2 1和Bcl- 2蛋白表达 ,反转录聚合酶链反应显示p5 3、p2 1和Bcl- 2mRNA表达水平。结果表明氧化型低密度脂蛋白可致U937细胞凋亡 ,其作用具有浓度效应 ;氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡过程中 ,p5 3、p2 1mRNA和蛋白表达增加 ,Bcl- 2mRNA和蛋白表达减少。提示氧化型低密度脂蛋白可能通过上调p5 3、p2 1基因表达 ,下调Bcl- 2基因 ,导致U937细胞凋亡。     

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡及其对p53、p21和Bcl-2表达的影响

为研究单核细胞源性泡沫细胞凋亡机制,以氧化型低密度脂蛋白诱导人髓系白血病细胞U937凋亡,观察p5 3、p2 1和Bcl- 2的表达。用流式细胞术和DNA断裂分析检测细胞凋亡;用细胞免疫荧光标记结合流式细胞术检测p5 3、p2 1和Bcl- 2蛋白表达,反转录聚合酶链反应显示p5 3、p2 1和Bcl- 2mRNA表达水平。结果表明氧化型低密度脂蛋白可致U937细胞凋亡,其作用具有浓度效应;氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡过程中,p5 3、p2 1mRNA和蛋白表达增加,Bcl- 2mRNA和蛋白表达减少。提示氧化型低密度脂蛋白可能通过上调p5 3、p2 1基因表达,下调Bcl- 2基因,导致U937细胞凋亡。     

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡时细胞间粘附分子-1的表达时序

研究氧化型低密度脂蛋白诱导人单核细胞U937细胞吞噬脂质发生凋亡过程中对细胞间粘附分子－1表达的影响,用胸腺嘧啶核苷将U937细胞阻滞在G1期,流式细胞仪监测同步化处理效果;流式细胞术检测U937细胞泡沫化过程中细胞凋亡和细胞间粘附分子－1的表达;逆转录－聚合酶链反应分析细胞间粘附分子－1 mRNA的表达,结果显示,80mg/L氧化型低密度脂蛋白温育U937细胞48h可形成典型的泡沫细胞,72h可见凋亡细胞增多;氧化型低密度脂蛋白温育U937细胞12h即可检测到细胞间粘附分子－1表达,24h时达到最高值,48h略有降低,72h时则明显降低。结果表明,氧化型低密度脂蛋白可以促进U937细胞细胞间粘附分子－1表达,细胞间粘附分子－1的表达增强有利于巨噬细胞的趋化运动和对脂质的吞噬。     

氧化低密度脂蛋白对U937细胞凋亡的影响及其机制的研究

目的探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对培养的单核巨噬系细胞株U937细胞凋亡的影响,并进一步探讨凋亡产生的机制。方法应用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡;Caspase-3、8、9的测定采用免疫组织化学技术。结果ox-LDL组细胞调亡率增加,并且随着作用时间的延长和浓度的增加,凋亡呈递增后递减变化,U937细胞在用ox-LDL培养后LOX-1和Caspase3、8、9表达都增加。结论ox-LDL可诱导U937细胞凋亡,ox-LDL诱导U937细胞凋亡既有线粒体通路,又包含了死亡受体。     

沥水调脂胶囊对氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡及Bcl-2、BaX、P53和Caspase-3蛋白表达的影响

目的：研究沥水调脂胶囊抑制内皮细胞凋亡的机制。以氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡，观察Bcl-2,Bax,P53和Caspase-3蛋白表达。方法：用流式细胞术检测细胞凋亡并进行周期分析；用细胞免疫荧光标记结合流式细胞术检测Bcl-2,Bax,P53和Caspase-3蛋白表达水平。结果：沥水调脂胶囊对氧化型低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡有抑制作用。在此过程中沥水调脂胶囊上调了Bcl-2蛋白表达水平，对Bax蛋白表达未见明显影响，同时下调了P53和Caspase-3蛋白表达水平。结论：推测沥水调脂胶囊可能是通过上调Bcl-2蛋白表达，下调P53和Caspase-3蛋白表达抑制内皮细胞凋亡的。     

P38 MAPK信号通路在金黄色葡萄球菌诱导U937细胞凋亡中的作用

目的建立金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)诱导人巨噬细胞系U937细胞凋亡模型,探讨p38 MAPK信号转导通路在此凋亡过程中的作用。方法采用Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测金黄色葡萄球菌感染不同时间时U937细胞的凋亡率;利用Western blotting检测p38MAPK的磷酸化水平;预先用不同浓度的SB203580(p38 MAPK途径抑制剂)处理U937细胞,采用Annexin V FITC/PI双染分析感染30min后U937细胞的凋亡情况。结果金黄色葡萄球菌可以诱导U937细胞凋亡,并且随着感染时间的延长,细胞凋亡率也逐渐增高。p38 MAPK在加入金黄色葡萄球菌15min后表达明显增高,30min时达高峰,随后,逐渐降低。总的p38 MAPK水平在整个实验期间内几乎无变化。用SB203580抑制p38 MAPK通路,引起抑制剂浓度依赖性的细胞凋亡率降低。结论金黄色葡萄球菌呈时间依赖性诱导U937细胞凋亡,p38 MAPK信号转导通路的激活在金黄色葡萄球菌诱导的U937细胞凋亡过程中起到了重要的作用。     

外源性Rb基因对U937细胞泡沫化过程中CD36表达的影响

为研究抑癌基因Rb基因在U937细胞泡沫化过程中的表达，应用重组腺病毒载体导入外源性Rb基因。采用逆转录聚合酶链反应和流式细胞术检测氧化型低密度脂蛋白致U937细胞泡沫化过程中清道夫受体CD36和Rb基因的表达和外源性Rb基因导入U937细胞后CD36和Rb基因的表达。结果发现，氧化型低密度脂蛋白致U937细胞泡沫化过程中，Rb mRNA和蛋白的表达随作用时间延长呈下调趋势，CD36 mRNA和蛋白的表达则呈上调趋势；随着外源性Rb导入U937细胞并表达，CD36表达呈下调趋势。结果提示，外源性Rb基因的导入可以下调清道夫受体CD36的表达。     

青蒿琥酯诱导U937细胞凋亡的研究

目的：研究青蒿琥酯体外诱导U937细胞凋亡及其过程中细胞内游离钙的变化。方法：采用光镜、透射电镜技术、DNA片段化电泳、流式细胞术对青蒿琥酯诱导U937细胞凋亡进行了观察，并应用激光共聚焦显微镜技术检测凋亡过程中细胞内游离钙浓度的变化。结果：6．250mg／L的青蒿琥酯可诱导U937细胞凋亡，作用于细胞后30min，Ca^2＋浓度即明显升高，1h达高峰，48h仍维持在较高水平。结论：青蒿琥酯可诱导U937细胞凋亡，细胞胞质内Ca^2＋是青蒿琥酯诱导U937细胞凋亡信号传导过程中重要的信号分子。     

鸦胆子油乳通过caspase-3途径诱导U937细胞凋亡

目的：研究鸦胆子油乳诱导白血病细胞(U937细胞)凋亡及凋亡过程中caspase-3的变化及其意义。方法：MTT法检测鸦胆子油乳对U937细胞增殖的抑制率；通过细胞形态、DNA片段化电泳、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡；应用酶联反应法检测caspase-3活性。结果：在31．25～1000．00mg／L浓度下鸦胆子油乳抑制U937细胞的增殖，IC50值为214mg／L，并呈现剂量-时间-效应关系；500mg／L鸦胆子油乳处理U937细胞，出现典型的细胞凋亡形态特征和DNA梯形带。流式细胞术检测显示125、250、500mg／L鸦胆子油乳诱导U937细胞凋亡；在诱导细胞凋亡过程中Caspase-3活性明显增高，且随作用时间延长，活性增加。结论：鸦胆子油乳在体外能够诱导U937细胞凋亡，诱导细胞凋亡可能是鸦胆子油乳抗白血病作用的机制之一，caspase-3活化参与了鸦胆子油乳诱导U937细胞凋亡的调控。     

氧化型低密度脂蛋白诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡

为研究氧化型低密度脂蛋白引起血管平滑肌细胞凋亡及其凋亡的机制,采用细胞形态学ＤＮＡ末标记法,流式细胞仪,Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｔｔｉｎｇ观察氧化型低密度脂蛋白诱导培养的大鼠血管平滑肌细胞凋亡。结果发现,在氧化型低密度脂蛋白作用下,血管平滑肌细胞阻滞在分裂期的中期,并发生凋亡,ＤＮＡ末端标记法和流式细胞仪检测发现氧化型低密度脂蛋白引起细胞凋亡明显高于天然低密度脂蛋白（前者是后者的１０倍）。电镜下凋亡细胞     

CD36介导氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞泡沫化和凋亡

为探讨清道夫受体ＣＤ３６在氧化型低密度脂蛋白诱导Ｕ９３７细胞泡沫化和凋亡中的作用,用氧化型低密度脂蛋白温育Ｕ９３７细胞,观察Ｕ９３７细胞泡沫化过程中ＣＤ３６的表达时序和泡沫细胞的凋亡;用ＣＤ３６单克隆抗体阻断Ｕ９３７细胞的吞噬作用,观察Ｕ９３７细胞吞噬蓄积胆固醇和细胞凋亡的改变。细胞胆固醇以修饰的酶荧光法测定;用流式细胞术检测异硫氰酸荧光素－抗ＣＤ３６单克隆抗体特异标记的ＣＤ３６和细胞的凋亡情况;用逆转录聚合酶链反应检测ＣＤ３６ｍＲＮＡ的表达。结果发现,８０ｍｇ／Ｌ氧化型低密度脂蛋白与Ｕ９３７细胞温育２４ｈ可增加细胞内总胆固醇,４８ｈ时可形成典型的泡沫细胞;ＣＤ３６表达呈现时序性改变,６ｈ即可检出ＣＤ３６表达增高,２４ｈ达到最高值,４８ｈ表达略有降低,ＣＤ３６ｍＲＮＡ的转录与ＣＤ３６的表达一致。用２００ｍｇ／Ｌ     

LOX-1在氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡中的作用和卡托普利的干预作用

目的探讨ox-LDL受体LOX-1在ox-LDL诱导单核/巨噬细胞凋亡中的角色和卡托普利的干预作用。方法应用流式细胞术检测细胞凋亡,采用免疫组织化学技术和Western Blot测定Caspase3、8、9的表达。结果ox-LDL可诱导U937细胞的凋亡峰出现(12.773±1.413),应用卡托普利和LOX-1的阻断剂角叉菜胶、PIA后凋亡峰明显减少,其百分比分别为(1.02±0.166)(4.94±0.47)(2.62±0.656),同时U937细胞在用ox-LDL培养后代表线粒体通路的Cas-pase9,3和代表死亡受体通路caspases8,3表达都增加,应用卡托普利和LOX-1的阻断剂角叉菜胶、PIA后caspase3、8、9的表达均减少。结论ox-LDL是通过与其受体LOX-1结合发挥损伤作用的。卡托普利可以抑制ox-LDL对U937细胞凋亡的诱导作用,从而对单核巨噬细胞起到保护作用。     

Fas/FasL途径在柔红霉素诱导HL-60及U937细胞凋亡中作用的研究

目的；研究柔红霉素（DNR）诱导白血病细胞凋亡的机制，进一步探讨Fas/FasL 途径在DNR诱导白血病细胞凋亡中的作用。并评价sFAsL与DNR联用的致凋亡效应。方法：将DNR作用于白血病细胞系HL－60，K562，U937细胞，并用流式细胞术（FCM）检测其Fas抗原表达的改变。sFasL,DNR诱导白血病细胞凋亡，以抗Fas单抗（IgG1)阻断Fas/FasL 途径，借助原位末端标记法（TUNEL）和FCM检测白血病细胞凋亡率。结果：DNR处理HL－60，K562，U937细胞18h后，Fas表达阳性率无明显变化（P＞0．05），与sFasL联合作用后显示出协同效应，。IgG1不能阻断DNA致白血病细胞凋亡的作用，但可阻断sFasL致白血病细胞凋亡的作用。结果：DNR致白血病细胞株U937，HL－60凋亡的作用不依赖于Fas/FasL 途径，但sFasL与DNR联合应用可协同增强抗肿瘤效应。     

HSP70及NF-κB在金葡菌致人巨噬细胞系U937细胞凋亡中的作用

目的探讨热休克蛋白70(HSP70)及核因子-κB(NF-κB)在金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)诱导人巨噬细胞系U937细胞凋亡过程中的作用。方法当细胞∶细菌为1∶20时分别培养0min,15min,30min,60min和90min时,用台盼蓝染色检测金葡菌感染不同时间后U937细胞的存活率;用Western blotting方法检测热休克蛋白(HSP70)及NF-κB蛋白的表达。结果U937细胞的存活率呈时间依赖性降低;HSP70的表达随着金葡菌感染时间的延长逐渐升高,而NF-κB的表达随着金葡菌感染时间的延长逐渐降低。结论金葡菌诱导U937细胞凋亡过程可能与HSP70和NF-κB表达的改变有关。     

人单核细胞泡沫化敏感候选基因的筛选

为克隆调控单核细胞源性泡沫细胞形成的相关基因 ,采用抑制消减杂交法筛选U937细胞经氧化型低密度脂蛋白温育形成泡沫细胞后差异表达的基因。经过正向、反向两轮消减杂交和巢式聚合酶链反应扩增 ,获得了富集的差异表达的cDNA片段 ,即表达序列标签 ,克隆化后挑选经鉴定含有插入片段的质粒测序。经Genbank数据库进行同源比较 ,获得 2 0余个差异表达的EST ,其中 2个克隆FRG4和FRG1 4只有片段同源序列而无全长同源序列 ,提示可能来自新基因。Genbank登录号为 :FRG4(BI 50 2 586)和FRG1 4 (BI 50 2 587)。     

核抗原Mina53在人胃癌细胞中的作用及其意义探讨

背景:核抗原Mina53基因为原癌基因Myc的下游直接靶基因之一,在一些消化系统恶性肿瘤中呈高表达,并与肿瘤增殖、侵袭、转移或患者生存期相关。目的:研究Mina53在人胃癌细胞中的作用及其对胃癌发生、发展的意义。方法:选择Mina53表达水平较高的人胃癌细胞株SGC7901和AGS,应用RNA干扰技术下调其Mina53表达,以转染无关序列siRNA的细胞作为对照组。采用CCK-8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,细胞侵袭和迁移实验检测细胞侵袭、迁移能力。结果:与相应对照组相比,Mina53 siRNA转染组SGC7901、AGS细胞增殖受抑(96 h相对增殖率:60%和68%),并发生明显细胞周期G1期阻滞(SGC7901细胞G1/G2:2.76±0.12对1.86±0.06,P<0.05;AGS细胞G1/G2:1.78±0.13对1.34±0.05,P<0.05),细胞凋亡率分别增加9.8%±1.2%和10.6%±1.5%(P<0.05),穿透Transwell小室基质胶细胞数(SGC7901细胞:11.67±0.88对24.33±1.45,P<0.05;AGS细胞:8.00±1.15对20.33±1.73,P<0.05)和穿透Transwell小室微孔膜细胞数(SGC7901细胞:7.00±1.53对14.67±2.03,P<0.05;AGS细胞:8.00±1.16对15.33±1.45,P<0.05)均显著减少。结论:Mina53对人胃癌细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡以及侵袭、迁移能力具有调控作用,可能影响胃癌的生长、浸润和转移,有望作为胃癌基因治疗的靶点。