口腔癌相关成纤维细胞的体外生物学行为研究

目的探讨口腔鳞癌中癌相关成纤维细胞(carcinoma associated fibroblasts,CAFs)的体外生物学行为。方法组织块贴壁法培养CAFs及牙龈正常成纤维细胞(normal fibrolasts,NFs);通过形态观察,免疫组化染色,细胞增殖活性、贴壁率、迁移能力等测定,比较两种细胞的生物学行为差异。结果与NFs相比,CAFs特征性表达成纤维激活蛋白(fibroblast activation protein,FAP)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2,MMP-2),具有更高的增殖活性、贴壁率及迁移能力(P<0.05)。结论口腔癌CAFs特征性表达相关蛋白,体外增殖、粘附、迁移能力均高于NFs。     

人口腔癌相关成纤维细胞的分离培养及鉴定

目的：分离培养及鉴定口腔癌相关成纤维细胞（ CAFs）,为探究CAFs可能在肿瘤微环境促进口腔癌细胞的侵袭转移中发挥重要作用奠定基础。方法：用组织块培养法和酶消化法分离培养、纯化原代口腔癌相关成纤维细胞CAFs和口腔黏膜正常成纤维细胞（ NFs）;细胞免疫荧光技术及免疫蛋白印迹法对口腔CAFs和NFs进行鉴定。结果：口腔CAFs和NFs分离培养成功,口腔CAFs呈长梭形,达到一定密度时呈多层生长,排列紊乱;NFs呈多胞质突的扁平星状,无重叠生长现象,排列有一定方向性。上皮标志物细胞角蛋白18（ CK18）免疫荧光染色在口腔CAFs和NFs均呈阴性,间质标志物波形蛋白（ Vimentin）染色均呈阳性。α?平滑肌动蛋白（α?SMA）、成纤维细胞特异性蛋白?1（FSP?1）,成纤维细胞激活蛋白（FAP）、血小板衍生生长因子受体α（ PDGFR?α）在CAFs染色呈阳性,而在NFs中染色呈阴性。结蛋白（ Desmin）在CAFs和NFs中染色均呈阳性。蛋白表达水平上,相对于NFs,CAFs中α?SMA、PDGFR?α蛋白表达呈升高趋势,FSP?1呈下降趋势,而FAP、Desmin在 NFs和CAFs中表达无明显差异。结论：CAFs与NFs相比,在形态结构、生长方式、蛋白表达等方面均有明显差异。     

肿瘤相关成纤维细胞对头颈部鳞状细胞癌肿瘤浸润免疫细胞的调控作用及机制探讨

目的 ：探讨在头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）中肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）对肿瘤浸润免疫细胞的调控作用。方法 ：通过TCGA数据库及临床肿瘤样本,获取与HNSCC相关的lncRNA MIR99AHG的表达谱及相关临床数据。对CAFs及正常成纤维细胞（normal fibroblasts,NFs）进行原代培养及鉴定。qRT-PCR检测与CAFs或NFs共培养的舌鳞癌细胞中lncRNA MIR99AHG的表达情况。对HNSCC中lncRNA MIR99AHG与肿瘤浸润免疫细胞的相关性进行分析。采用Graph Pad 8.0.2对数据进行统计学分析。结果：lncRNA MIR99AHG在HNSCC中低表达,且基因高表达与预后呈正相关。Western免疫印迹显示,CAFs中α-SMA高表达。qRT-PCR显示,相比阴性对照组,与CAFs共培养的舌鳞癌细胞中lncRNA MIR99AHG的表达显著降低。lncRNA MIR99AHG与T细胞、CD8+T细胞、B...     

TGF-β1过表达介导的放疗诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的体外研究

目的:探讨体外培养的皮肤成纤维细胞在直线加速器照射后向肌成纤维细胞的转分化。方法:消化法体外培养F344大鼠皮肤成纤维细胞,传代后,在直线加速器下进行照射处理,照射剂量分别为0、2、4、8Gy。应用实时定量PCR检测照射后1、3、5、7d TGF-β1基因表达,应用Western印迹检测TGF-β1和α-SMA蛋白的表达。采用SPSS10.0软件包对数据进行统计学分析。结果:通过酶消化法成功培养成纤维细胞,照射后,TGF-β1基因和蛋白表达随照射剂量增加而上调,随照射后时间增加而下调。照射后第1d,8Gy剂量组TGF-β1表达量最高(P<0.05)。α-SMA蛋白的表达趋势与TGF-β1一致。结论:成纤维细胞照射后转变为肌成纤维细胞并高表达α-SMA,TGF-β1是成纤维细胞照射后早期表达的指标。     

癌相关成纤维细胞对人舌鳞状细胞癌上皮-间质转化的影响

目的:探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)对舌鳞癌细胞侵袭、转移的作用及可能机制。方法:应用胶原酶消化法原代分离舌癌相关成纤维细胞及对应正常成纤维细胞(NFs),采用Western免疫印迹、ELISA、激光共聚焦和实时定量PCR分别检测vimentin、cytokeratin、α-SAM和SDF1蛋白质及mRNA水平表达差异。以舌鳞状细胞癌SCC9为研究对象,建立共培养体系,采用Western免疫印迹、激光共聚焦和实时定量PCR检测SCC9中上皮-间质转化标志蛋白E-cadherin、vimentin和fibronectin及其mRNA水平的变化,Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:胶原酶消化法成功获取CAFs及对应NFs,CAFS和NFs均表达vimentin,不表达cytokeratin。其中,CAFs高表达α-SAM并分泌SDF1(P<0.01)。与SCC9共培养2周后,SCC9呈梭形改变,E-cadherin表达降低,vimentin和fibronectin升高(P<0.01),同时其迁移能力增强。结论:胶原酶消化法能成功获取原代CAFs。CAFs可通过诱导SCC9上皮-间质转化进而促进其侵袭、转移。     

白细胞介素-1β对人牙周膜成纤维细胞中MCP-1表达影响的研究

目的:探讨白细胞介素-1β(IL-1β)对人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs)中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达水平的影响。方法:体外分离培养的人牙周膜成纤维细胞随机分为实验组和对照组,实验组细胞以不同浓度IL-1β(1、5、10、25 ng/mL)作用24 h;对照组细胞则不加IL-1β作用。分别采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测人牙周膜成纤维细胞中MCP-1 mRNA的表达;采用免疫荧光技术观察MCP-1的表达情况;采用Western blot方法检测其蛋白表达变化。结果:对照组hPDLFs中可见微弱的MCP-1表达;实验组hPDLFs经IL-1β刺激后,MCP-1在mRNA和蛋白水平表达都增强,这种调节作用在10 ng/mL IL-1β的作用浓度时最明显(P<0.05)。结论:在IL-1β介导环境下,hPDLFs中MCP-1的表达增高,而MCP-1表达增高可能是引起外周血单核细胞向局部炎症牙周组织募集的机制之一。     

牙周膜肌成纤维细胞的体外培养及其标志物的表达时效

目的：探讨人牙周膜肌成纤维细胞（MFB）体外培养及其标志物表达的时效性。方法???体外培养人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）,72?h内以5μg?L-1终质量浓度的转化生长因子（TGF）-β1诱导hPDLF向MFB转化,免疫细胞化学和免疫组织化学染色检测MFB标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达情况。分别进行12、24、48、72、96和120?h的MFB观察,采用流式细胞术观察MFB长时间培养的细胞活性,采用免疫细胞化学观察MFB长时间培养后的α-SMA表达情况。结果??经TGF-β1诱导后α-SMA呈阳性;诱导至120?h,α-SMA仍呈阳性,72?h内其表达稳定。结论5μg?L-1终质量浓度的TGF-β1成功诱导人牙周膜细胞向MFB转化。MFB体外培养具有时效性,培养0~72?h,其状态稳定。     

TGF-β1对炎症状态下人牙周膜成纤维细胞的调控作用

目的 探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对在牙龈卟啉单胞菌来源脂多糖（lipopolysaccharide from Porphyromonas gingivalis,Pg-LPS）刺激模拟炎症状态下的人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs）的调控作用。方法 获取hPDLFs并进行免疫组化鉴定,通过qRT-PCR与CCK-8确定Pg-LPS的刺激浓度。将hPDLFs分成4组：空白对照组,单纯100μg/mL Pg-LPS;低浓度组,1 ng/mL TGF-β1+100μg/mL Pg-LPS;中浓度组,10 ng/mL TGF-β1+100μg/mL Pg-LPS;高浓度组100 ng/mL TGF-β1+100μg/mL Pg-LPS。CCK-8检测细胞增殖情况;划痕实验与Transwell小室实验检测hPDLFs细胞迁移能力;流式细胞术检测hPDLFs的细胞周期;qRT-PCR检测hPDLFs的转录因子叉头盒p3(forkhead/winged h...     

口腔癌相关成纤维细胞对人工基底膜的降解作用及其机制

目的观察口腔癌相关成纤维细胞（CAFs）降解人工基底膜matrigel的能力,并探讨其可能的作用机制。方法matrigel凝胶与CAFs和NFs共同培养24、48、72 h后,收集培养上清液,按照羟脯氨酸检测试剂盒说明测定羟脯氨酸含量;用考马斯亮兰微孔板法行微量蛋白定量;用明胶酶谱分析对基质金属蛋白酶- 2（MMP- 2）、基质金属蛋白酶- 9（MMP- 9）含量进行测定。结果在各时间段,口腔CAFs上清超滤液中羟脯氨酸含量、上清液总蛋白浓度及MMP- 2酶原含量明显高于NFs,且CAFs组表达大量MMP- 2活性酶。口腔CAFs和NFs皆不表达MMP- 9。结论CAFs具有较强的降解细胞外基质的能力,提示其与肿瘤- 宿主微环境中基质重建及肿瘤侵袭有关。     

口腔癌相关成纤维细胞的生长增殖特性研究

目的 :对口腔癌相关成纤维细胞 (CAFs)的生长增殖特性进行研究。方法 :复苏前期实验中冻存的第3代纯化舌CAFs及同部位的正常成纤维细胞 (NFs) ,在保证培养条件、接种细胞量、观察时间基本一致的情况下 ,比较二者的生长曲线、群体倍增时间、有丝分裂指数曲线 ,并用MTT法测定细胞的增殖活力。结果 :从总体上比较 ,CAFs的生长速度、分裂增殖能力及存活能力均较NFs明显增强 ( p <0 .0 5 )。CAFs和NFs的细胞群体倍增时间分别为 60 .19h和 76.61h。结论 :口腔CAFs的生长增殖特性发生了变化 ,推测可能是对肿瘤 --宿主界面微生态环境进行调控的机制之一     

转化生长因子β促进面突外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化

目的　探讨转化生长因子β(TGF-β)对面突外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化的影响。方法　 60 pmol/LTGF-β作用于面突外胚间充质干细胞,分别于1 d、2 d后进行抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体免 疫组化图象分析检测,2 d后定量RT-PCR检测α-SMA mRNA的表达。结果　免疫组化显示,TGF-β诱导组表达α- SMA的细胞数约为95%,而未加分化抑制剂的自然分化组表达α-SMA的细胞数约为65%。图象分析显示,1 d、2 d TGF-β诱导组抗α-SMA着色平均灰度值小于未加分化抑制剂的自然分化组。定量RT-PCR显示TGF-β诱导组α-SMA mRNA量大于自然分化组。有分化抑制剂的对照组细胞不表达α-SMA。结论　TGF-β诱导组细胞表达α-SMA强于 自然分化组。TGF-β可以促进外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化。     

TGF-β3作用下人牙髓细胞内Smad2、Smad3蛋白表达水平的变化

目的：探讨TGF—B3对人牙髓细胞内Smad2、Smad3蛋白表达的调控作用和差异。方法：取生长良好的第5代人牙髓细胞，分为实验组和对照组，实验组用5ng／mL TGF—β3刺激并培养6、12、24、48h，对照组不予刺激。提取各组总蛋白质，分别用Smad2、Smad3抗体进行Western印迹杂交。结果：与对照组相比，Smad3在TGF—β3刺激后6h、12h，其蛋白表达量无明显变化，而在刺激后24h表达量明显下降，刺激48h后表达十分微弱；Smad2在对照组以及刺激后各时间组，其蛋白表达量无显著变化。结论：人牙髓细胞内存在Smad2、Smad3蛋白的表达，TGF—β3对二者表达的调控方式有所不同，刺激后期Smad3表达水平的下调可能与TGF-β3负反馈调节自身的信号有关。     

TNF-α和槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达的影响及姜黄素对其影响的作用

目的:探讨TNF-α和槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达的影响及姜黄素对其影响的作用。方法:体外培养口腔黏膜成纤维细胞,分别用100～10 000 U/mL TNF-α和10～40μg/mL槟榔碱作用于细胞24～72 h, CCK-8实验检测细胞增殖,ELISA测定细胞中羟脯氨酸的表达。用5～40μmol/L的姜黄素作用于2种处理的细胞,检测细胞增殖和羟脯氨酸蛋白的表达。结果:TNF-α促进细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达(P<0.05),槟榔碱抑制细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达(P<0.05)。40μmol/L的姜黄素作用于TNF-α和槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞,在24 h和48 h时抑制细胞增殖(P<0.05)。不同浓度的姜黄素作用于TNF-α和槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞,均能抑制羟脯氨酸合成(P<0.05)。结论:TNF-α可促进口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达,槟榔碱能抑制口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达,较高浓度姜黄素能减弱TNF-α的刺激作用,增强槟榔碱的抑制作用。     

rhIL-1α/rhTGF-β1诱导下大鼠髁突软骨细胞PRG4的表达

目的:观察rhTGF-β1对rhIL-1α作用下大鼠髁突软骨细胞蛋白多糖4(PRG4)表达的影响.方法:酶消化法获取髁突软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定.细胞上清液中加入10 ng/ml的rhIL-1α,48 h后加入10 ng/ml的rhTGF-β1.不同时间点应用RT-PCR检测PRG4 mRNA的表达情况,ELISA法检测PRG4蛋白的分泌变化.结果:加入rhIL-1α 24、48、72 h组的PRG4表达量与对照组均有统计学差异(P<0.05),且逐渐降低.48 h组再加入rh TGF-β1 24h后PRG4表达量与对照组无统计学差异(P>0.05),而48 h后与各组均有统计学差异(P<0.05),且最高.结论:rhTGF-β1可以上调髁突软骨细胞PRG4的表达,且可逆转IL-1α的下调作用.     

转化生长因子β3对脂多糖诱导的成骨细胞中IL-6表达的影响

目的:探讨转化生长因子β3 (transforming growth factor β3,TGF-β3)对成骨细胞内炎性细胞因子IL-6表达的影响,及其发挥抗炎作用的机制.方法:20 μg/mL牙髓卟啉单胞菌脂多糖(lipopolysaccharide of Porphyromonas endodontalis,Pe-LPS)刺激人成骨肉瘤细胞系MG63,构建成骨细胞炎症模型.取不同浓度(5～20 ng/mL)的人重组蛋白生长因子TGF-β3和TGF-β1,分别与20 μg/mL P.e-LPS共同作用于MG63细胞24 h后,利用实时荧光定量PCR检测细胞内IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测培养液上清中IL-6的表达水平.以10 ng/mL TGF-β3预处理细胞30 ain后,再与20 μg/mL P.e-LPS共同作用20 min,Western印迹法检测细胞内ERK1/2蛋白磷酸化的表达.采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:实时荧光定量PCR结果显示,单独20 μg/mL P.e-LPS作用下,MG63细胞内IL-6的表达显著增高(P＜0.01);TGF-β1在低浓度条件下(5～10 ng/mL)对IL-6的表达无显著作用,仅在20 ng/mL时可显著抑制IL-6的表达(P＜0.05).不同浓度的TGF-β3与Re-LPS共同作用均可显著抑制IL-6的表达(P＜0.01).ELISA结果显示,10～20 ng/mL TGF-β3可在蛋白水平上对IL-6有显著抑制作用(P＜0.05).单独P.e-LPS作用时,可使MG63细胞内ERK1/2蛋白的磷酸化水平升高(P＜0.01);而当TGF-β3与P.e-LPS共同作用时,ERK1/2的磷酸化被抑制(P＜0.05).结论:相同浓度条件下,TGF-β3比TGF-β1对成骨细胞炎症的抑制作用更为显著,ERK1/2信号机制参与了TGF-β3的抗炎过程.     

碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜成纤维细胞整合素β1亚单位mRNA表达的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人牙周膜成纤维细胞整合素β1亚单位mRNA表达的影响,探讨bFGF在牙周组织再生中的意义.方法 体外培养人牙周膜成纤维细胞,分别用质量浓度0.1、1.0、10.0ng·mL-1的bFGF刺激细胞,培养24、48、72 h,采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测牙周膜成纤维细胞内整合素β1亚单位mRNA表达的变化.结果 bFGF可促进入牙周膜成纤维细胞内整合素β1亚单位mRNA的合成,在培养24、48、72 h时,1.0 ng·mL-1组整合素β1亚单位表达均明显高于对照组;培养72 h时各实验组整合素β1亚单位表达均明显高于培养24、48 h时..结论 bFGF通过提高整合素β1亚单位mRNA的表达,促进牙周膜成纤维细胞的黏附,在牙周组织修复再生中起作用.     

四种生长因子对体外培养的人牙乳头细胞表达核心结合因子a1的研究

目的：探讨4种生长因子对体外培养的人牙乳头细胞中核心结合因子a1（core binding factor al，cbfal）表达的影响。方法：体外培养人牙乳头细胞，转染pcDNA3-cbfal重组质粒，G418筛选建立稳定表达cbfal的细胞模型PC-3，分别在正常细胞和PC-3细胞中加入不同浓度的BMP-2、TGF-β1、FGF-2、EGF，采用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学的方法，观察这4种生长因子在人牙乳头细胞中对cbfal基因表达、蛋白合成、蛋白表达部位的影响。结果：200ng／mLBMP-2和50ng／mL的FGF-2刺激正常人牙乳头细胞6h后cbfal的表达明显升高，而20和40ng／mL的TGF-β1作用12h，能抑制稳定转染cbfal基因的细胞中cbfal mRNA的表达；EGF则对人牙乳头细胞中cbfal的表达没有显著影响。结论：BMP-2和FGF-2可以上调人牙乳头细胞中cbfal的表达，TGF-β1对cbfal的表达有抑制作用，EGF则对人牙乳头细胞中cbfal的表达没有显著影响。     

锌指E盒结合同源框2在人牙髓组织和细胞的表达

目的：检测锌指E盒结合同源框2（ZEB2）在人牙髓组织和细胞中的表达,并初步探讨其意义。方法：制作牙髓组织石蜡切片,荧光原位杂交技术（FISH）检测 ZEB2的表达;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测正常及TGF-β1刺激下人牙髓细胞（hDPCs）中ZEB2 mRNA表达水平;制作hDPCs细胞爬片, FISH检测ZEB2的表达。结果： FISH结果显示ZEB2在牙髓组织中主要表达于成牙本质细胞层,在牙髓细胞呈弱阳性表达。 RT-qPCR结果显示TGF-β1的作用促进ZEB2的表达,且具有浓度和时间依赖性,5ng/ml TGF-β1刺激ZEB2表达达最大（P〈0.05）;5ng/ml TGF-β1刺激后, ZEB2 mRNA在24h内表达逐渐上调,24h达峰值（P〈0.05）。 FISH结果示ZEB2在正常hDPCs胞质和胞核均呈弱阳性表达, TGF-β1刺激24h后ZEB2表达增强,胞核表达明显。结论： ZEB2在牙髓组织中主要表达于成牙本质细胞层,正常hDPCs中弱阳性表达,而TGF-β1可促进hDPCs中ZEB2表达,提示ZEB2可能通过参与TGF-β1信号通路调控hDPCs的成牙本质向分化过程。     

microRNA-223在牙龈卟啉单胞菌诱导牙龈成纤维细胞炎症调控的研究

目的 探讨microRNA-223在牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharides, P.g-LPS)诱导牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts,GFs)炎症过程中对相关炎症因子表达水平的调控作用。 方法 采用慢病毒转染、干扰GFs中的microRNA-223的表达,在最适P.g-LPS刺激浓度(800 μg/L)分别刺激过表达、抑制以及正常表达microRNA-223的GFs,采用实时聚合酶联反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达水平变化,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测其蛋白水平的变化。 结果 LPS刺激GFs产生炎症反应时,细胞内microRNA-223以及相关促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA和蛋白表达水平较正常细胞中的表达量明显上调。当细胞内microRNA-223上调时,促炎因子的mRNA和蛋白表达水平也会上调(P<0.001);当细胞内microRNA-223下调时,促炎因子TNF-α、IL-1β的蛋白水平会显著下降(P<0.001)。 结论 当GFs受P.gingivalis-LPS刺激发生炎症时,microRNA-223的表达量增多,上调促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6,进一步加重组织细胞的炎症。