庆大霉素致豚鼠耳蜗毛细胞凋亡时Caspase-3的表达

目的探讨庆大霉素所致耳蜗外毛细胞的损伤特点及耳毒性机制。方法豚鼠随机分3个组,分别腹腔注射庆大霉素、庆大霉素加速尿、生理盐水各连续6天,比较用药前后各组豚鼠畸变产物耳声发射（distortion product otoacoustic emissions,DPOAE）变化、耳蜗铺片、毛细胞凋亡情况及Caspase-3在毛细胞的表达。结果注射庆大霉素和庆大霉素加速尿2个组,用药后DPOAE明显下降,耳蜗铺片见毛细胞损伤明显,细胞凋亡发生及Caspase-3免疫复合物阳性表达。结论庆大霉素可致豚鼠耳蜗毛细胞损伤并加速凋亡,Caspase-3在毛细胞凋亡过程中起重要作用。     

蛋白磷酸酶1在D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗中的表达

目的 观察D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗中蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)的定位表达及作用.方法 40只昆明小鼠随机分为对照组和D-半乳糖组,每组20只.D-半乳糖组颈背部皮下注射D-半乳糖(800mg·kg-1·d-1),对照组每日皮下注射等量生理盐水,连续给药8w;停药后检测血浆总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平;免疫荧光法定位PP1在耳蜗的表达,re-al-time PCR法检测耳蜗中PP1 mRNA水平,Western blot法检测小鼠蛋白磷酸酶1核目标亚基(protein phos-phates 1 nuclear targeting subunit,PNUTS)、PP1及caspase-3的表达.结果 与对照组比较,D-半乳糖组小鼠总SOD活力降低而MDA水平升高(均为P<0.01);PP1主要定位表达于小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞及血管纹细胞的胞核和胞浆中,且给予D-半乳糖后,小鼠耳蜗中PP1 mRNA及其蛋白表达水平显著升高,而PNUTS表达减少,caspase-3表达增加(均为P<0.05).结论 PP1在D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节及血管纹细胞中表达,且参与了其耳蜗老化过程.     

石杉碱甲对D-半乳糖诱导老年性聋大鼠听觉功能的影响评估

目的通过测试听性脑干反应和复合动作电位评估石杉碱甲对D-半乳糖致老年性聋大鼠听觉功能的改变。方法出生后3～4 W的Sprague-Dawley大鼠随机分为3组,模型组用5%D-半乳糖(200 mg/kg)行颈背部皮下连续注射8 W制备大鼠老年性聋模型;干预组用5%D-半乳糖(200 mg/kg)和石杉碱甲(0.1 mg/kg)行大鼠颈背部皮下注射;空白组作为对照。用药前、后分别检测大鼠听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)以检测听觉敏感性;复合动作电位(compound actionpotential,CAP)测试耳蜗输出幅度;以成对短声(pair clicks)为时间紧张性刺激,通过各CAP2/CAP2(20 ms)比值与短声间隔的关系函数反映耳蜗时间分辨能力。β-半乳糖苷酶染色下丘衰老细胞。结果 3组动物用药前后ABR阈值无明显改变(P>0.05);和模型组相比,干预组8kHz下80 dBSPL时ABRⅢ波潜伏期、I～V波间期缩短,提示听觉信号从外周到中枢的传入时间减少;以成对短声CAP响应所代表的耳蜗时间分辨力干预组高于模型组,但仍低于对照组;模型组下丘衰老细胞密度最高,干预组次之,对照组最少。结论石杉碱甲可以提高D-半乳糖致老年性聋大鼠与言语识别相关的听觉处理能力,为临床寻找改善老年患者听觉功能药物提供实验支持。     

Bax在D-半乳糖诱导的老化大鼠耳蜗中的作用

目的研究Bax介导的细胞凋亡在D-半乳糖诱导的老化大鼠耳蜗中的作用,探讨老年性耳聋外周听觉系统细胞凋亡的发生机制。方法 36只1月龄雄性Spragua-Dawley大鼠随机分成2组(各18只):1 D-半乳糖组:每日颈背部皮下注射D-半乳糖(500mg/kg),连续8周;2对照组:每日颈背部皮下注射同体积的生理盐水,连续8周。造模完成后,取两组大鼠耳蜗,利用实时定量PCR检测线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)普遍缺失(common deletion,CD)的累积;利用western blot检测Bax蛋白的表达;利用免疫组织化学检测Cleaved caspase-3蛋白的表达;利用原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase(Td T)-mediated deoxyuridine triphosphate(d UTP)nick-endlabelling,TUNEL)染色检测大鼠耳蜗细胞凋亡发生的情况。所有实验数据采用两样本的t检验进行分析。结果和对照组的大鼠相比较,D-半乳糖诱导的老化大鼠mt DNA CD的累积在耳蜗组织中明显增多,差异有统计学意义(t值为6.631,P值<0.01);Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达在耳蜗组织中明显增强,差异有统计学意义(t值分别为20.914、20.043,P值均<0.01)。对照组的大鼠耳蜗没有检测到凋亡细胞,而D-半乳糖诱导的老化大鼠耳蜗底回血管纹检测到少量凋亡细胞。结论 Bax介导的细胞凋亡参与了D-半乳糖诱导的耳蜗老化过程,可能是导致老年性耳聋外周听觉系统细胞凋亡发生的重要原因。     

DPOAE监测一次性大剂量顺铂致豚鼠耳毒性的实验研究

目的观察一次性大剂量顺铂注射后豚鼠畸变产物耳声发射(DPOAE)和内耳形态学的依时性改变,探讨应用耳声发射监测顺铂耳毒性的最佳时机。方法将豚鼠随机分为对照组(A组)及实验组(B、C、D组),每组6只,A组皮下注射生理盐水,B、C、D各组一次性皮下注射顺铂(10mg/kg),分别于给药前及给药后第3(B组)、5(C组)、10(D组)天检测DPOAE,比较给药前、后DPOAE的幅值的变化,并行耳蜗铺片,观察毛细胞缺失率及耳蜗形态学的改变。结果给药后第3天,DPOAE的幅值仅8kHz处有明显改变(P<0.05);给药后第5、10天DPOAE幅值明显降低(P<0.01)。给药后第3、5、10天,耳蜗外毛细胞缺失率分别为4.34%±3.20%、16.14%±9.15%、18.25%±9.04%。在第5、10天后尚可见血管纹充血以及螺旋神经节细胞肿胀缺失。结论顺铂的耳毒性主要作用于耳蜗底回、中回的外毛细胞,用药后第3~5天应用畸变产物耳声发射检查能早期发现其耳毒性损伤。     

孕鼠铅暴露对仔鼠血铅水平及听力影响的研究

目的：探讨孕鼠铅暴露对仔鼠血铅水平和听力的影响。方法：Wistar大鼠42只,按雌、雄配对分为5组（A、B、C、D、E组）。A组为正常对照组,进食正常饲料,B、c、D、E组每公斤饲料分别添加醋酸铅0．3、0．9、2．7、8．1g,产仔后恢复正常饲料。大鼠及仔鼠于出生后1、3周分别进行畸变产物耳声发射（DPOAE）、听性脑干反应（ABR）和血铅测定。结果：仔鼠与大鼠血铅水平呈正相关（r=0．5817）;DPOAE测试：大鼠和仔鼠均为一般正常耳蜗反馈曲线;ABR测试：大鼠D组Ⅰ～Ⅲ、Ⅲ～Ⅴ波间期与正常对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。仔鼠c1、c3组反应阈大于正常对照组（均P〈0．05）;仔鼠b1、c1、e1组Ⅰ波潜伏期短于正常对照组（均P〈0．05）。结论：仔鼠血铅水平与母鼠孕期铅暴露的程度相关;孕期低水平的宫内铅暴露对仔鼠听神经中枢段及听觉传导等特别敏感,易造成损伤。     

D-半乳糖诱导的小鼠耳蜗带状突触损伤

目的研究D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗带状突触数量的变化。方法 1)D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型的构建:24只5周龄雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后随机分为2组(每组12只):①对照组:小鼠颈背部皮下注射同体积的生理盐水,每日1次,连续6周;②D-半乳糖组:小鼠颈背部皮下注射1000mg/kg D-半乳糖,每日1次,连续6周;2)ABR检测听小鼠听功能;3)免疫组织化学染色检测小鼠耳蜗线粒体DNA氧化损伤产物8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine, 8-OHdG)的表达;4)免疫组织化学染色检测小鼠耳蜗带状突触突触前标记物CtBP2的数量;5)Western blot检测小鼠耳蜗CtBP2蛋白的表达。结果 1)D-半乳糖诱导的衰老小鼠听功能表现为ABR I波幅值的降低,而无阈值的改变;2)8-OHdG在D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗表达明显增加;3)D-半乳糖耳蜗带状突触数量明显减少;4)CtBP2蛋白在D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗表达明显减少。结论耳蜗带状突触是D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗早期出现的病变部位,D-半乳糖诱导的衰老小鼠可作为研究老年性聋耳蜗带状突触损伤的动物模型。     

不同剂量放射线对小鼠畸变产物耳声发射和外毛细胞Prestin蛋白表达的影响

目的 探讨单次不同剂量放射线照射对小鼠畸变产物耳声发射(DPOAE)和耳蜗外毛细胞Prestin蛋白表达的影响及放射线照射导致感音神经性聋的可能机制.方法 选取48只健康的Balb/c小鼠随机分成4组,每组12只(耳),分别给予0(对照组)、8(第1组)、12(第2组)、16 Gy(第3组)放射剂量的放射线照射,在照射后第7天对4组小鼠行DPOAE检测,同时分别采用Western-Blot分析和荧光实时定量中PCR检测4组小鼠耳蜗组织Prestin蛋白及Prestin mRNA表达的变化情况.结果 放射线照射第7天时,第1、2和3组小鼠3、4、6、8、10和12 kHz DPOAE幅值均较正常对照组小鼠明显降低(均P<0.05),正常对照组、第1、2和3组小鼠3、4、6、10、12 kHz DPOAE幅值依次减小(均P<0.05);第1、2和3组小鼠耳蜗组织Prestin蛋白及Prestin mRNA的表达均较正常对照组小鼠下降(均P<0.05),正常对照组、第1组、第2组和第3组小鼠耳蜗组织Prestin蛋白及Prestin mRNA的表达依次下降(均P<0.05).结论 单次放射线照射可损伤小鼠的听觉功能,使小鼠耳蜗外毛细胞Prestin蛋白及Prestin mRNA的表达下调,下调程度与照射剂量的大小呈正相关性;放射线致感音神经性听力损失可能与其导致耳蜗外毛细胞Prestin蛋白表达下调有关.     

内质网应激在顺铂诱导离体小鼠耳蜗毛细胞凋亡中的作用

目的 研究内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在顺铂诱导离体培养小鼠耳蜗毛细胞凋亡中的作用.方法 选取出生后3d的健康昆明小鼠380只(760耳),分离出耳蜗基底膜760条,体外培养24 h后,随机分为对照组和4、8、16 μg/ml顺铂组,每组190条,对照组加入2 ml新鲜培养基,顺铂组分别加入2 ml含不同浓度顺铂(4、8、16 μg/ml)的新鲜培养基,再继续培养24 h后,应用Hoechst 33258荧光染色观察耳蜗毛细胞凋亡情况,并应用Western blot检测ERS标志物葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)和内质网凋亡途径标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteinyl aspartate specific proteinase 12,caspase-12)在耳蜗毛细胞中的表达.结果 4、8、16 μg/ml顺铂组耳蜗毛细胞凋亡率分别为10.53％±0.50％、27.12％±2.64％和60.01％±2.75％,均高于对照组(3.67％±0.76％),呈现明显的量效关系;不同浓度顺铂组耳蜗GRP 78和caspase-12的蛋白表达水平亦较对照组明显增高(P＜0.01),并随顺铂浓度增大而显著增强(P＜0.01).结论 顺铂可诱发小鼠耳蜗毛细胞ERS,ERS可能在其诱导的小鼠耳蜗毛细胞凋亡中发挥了作用.     

小儿类听神经病的耳蜗微音电位研究CSCD

目的研究类听神经病(auditory neuropathy spectrum disorder,ANSD)病例的耳蜗微音电位(cochlear microphonic potentials,CMs)特征,探索CMs起源。方法回顾性分析2007年1月~2010年1月于首都医科大学附属北京同仁医院确诊的ANSD 33例(49耳),2~75月龄,平均(19±17)月龄,中位数16月龄,依据CMs、畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emission,DPOAE)和中耳分析仪/颞骨CT检测结果分为3个组,中耳正常且DPOAE引出组26耳,中耳正常且DPOAE未引出组16耳,中耳异常组7耳。结果当刺激声强度为100 dB nHL时,有DPOAE组CMs幅值(0.45±0.12)μV,无DPOAE组CMs幅值为(0.37±0.08)μV,两组之间有显著性差异(P=0.008);而中耳异常组全部记录到CMs,且其幅值与DPOAE未引出的中耳正常组无明显差别。结论在ANSD中部分病例外毛细胞功能会发生损害,表现为OAEs消失、CMs持续存在。而这种情况下的CMs单纯来自于内毛细胞的可能性较小,更可能来自于部分受损外毛细胞与部分或全部内毛细胞。     

不同给药途径对拟老化豚鼠听功能的影响

目的探讨通过耳后局部注射和腹腔注射神经生长因子（NGF）对拟老化豚鼠内耳的作用和机制。方法选择4月龄耳廓反应灵敏的纯种豚鼠30只。随机分为3组。每组10只。A组（对照组）腹腔注射5％D-半乳糖300mg／kg;B组分别腹腔注射5％D-半乳糖300mg／kg和NGF 1000U／kg;C组分别腹腔注射5％D-半乳糖300mg／kg和耳后皮下注射NGF 1000 U／kg。每组每日注射2次,连用4周。各组豚鼠实验前后行ABR测试,处死后分别做透射电镜和TUNEL检测。结果C组豚鼠较B组豚鼠ABR阈值明显降低,TUNEL阳性的毛细胞、螺旋神经节细胞明显减少,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论耳后注射较腹腔注射NGF能更有效地保护拟老化豚鼠的听功能。     

NADPH氧化酶在D-半乳糖诱导的老化大鼠听觉系统氧化损伤过程中的作用

目的研究NADPH氧化酶（NADPH oxidase,NOX）在D-半乳糖诱导的老化大鼠外周听觉系统耳蜗和中枢听觉系统听皮层组织中的表达,探讨老年性耳聋氧化性损伤的发生机制。方法 48只1个月龄雄性Spragua-Dawley大鼠按数字随机法分成两组,每组各24只。D-半乳糖组：每日颈背部皮下注射D-半乳糖（500 mg/kg）,连续8周;对照组：每日颈背部皮下注射同体积的生理盐水,连续8周。造模完成后,取两组大鼠外周听觉系统耳蜗和中枢听觉系统听皮层组织,利用免疫组织化学法检测DNA氧化损伤生物标记物8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG）;利用实时定量PCR检测线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）普遍缺失（common deletion,CD）和NOX基因的表达;利用Western blot检测NOX蛋白表达;应用Taqman PCR检测mt DNA CD。所有实验数据采用两样本的t检验进行分析。结果 D-半乳糖组和对照组大鼠相比较,D-半乳糖诱导的老化大鼠8-OHdG的表达在耳蜗和听皮层组织中明显增多,两组比较差异具有统计学意义（t分别为6.341、10.589,P均〈0.05）;NOX3基因和蛋白的表达在耳蜗组织中明显增强,两组比较差异具有统计学意义（t分别为8.491、18.983,P均〈0.05）;NOX2基因和蛋白的表达在听皮层组织中明显增强,两组比较差异具有统计学意义（t分别为3.548、8.219,P均〈0.05）;mtDNA CD的累积在耳蜗和听皮层组织中明显增多,两组比较差异具有统计学意义（t分别为9.796、7.901,P均〈0.05）。结论在听觉系统老化过程中,NOX是活性氧的重要来源,可能是导致老年性耳聋氧化性损伤发生的重要原因。     

ototoxicity of styrene

Styrene is extensively used in industry,but its ototoxicity,in particular in the pregnant female and the offspring,is still not well understood.In the current study,young adult male rats and pregnant f...     

Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures

The amphipathic molecule dimethyl sulphoxide (DMSO) is a solvent often used to dissolve compounds applied to the inner ear; however, little is known about its potential cytotoxic side effects. To address this question, we applied 0.1-6% DMSO for 24h to cochlear organotypic cultures from postnatal day 3 rats and examined its cytotoxic effects. DMSO concentrations of 0.1% and 0.25% caused little or no damage. However, concentrations between 0.5% and 6% resulted in stereocilia damage, hair cell swelling and a dose-dependent loss of hair cells. Hair cell damage began in the basal turn of the cochlea and spread towards the apex with increasing concentration. Surprisingly, DMSO-induced damage was greater for inner hair cells than outer hair cell whereas nearby supporting cells were largely unaffected. Most hair cell death was associated with nuclear shrinkage and fragmentation, morphological features consistent with apoptosis. DMSO treatment induced TUNEL-positive staining in many hair cells and activated both initiator caspase-9 and caspase-8 and executioner caspase-3; this suggests that apoptosis is initiated by both intrinsic mitochondrial and extrinsic membrane cell death signaling pathways.     

细胞色素C在老年SD大鼠耳蜗不同阶段凋亡坏死毛细胞中表达的变化

目的：观察细胞色素c在老年SD大鼠不同阶段凋亡、坏死毛细胞中表达的变化,探讨老年大鼠耳蜗毛细胞死亡的机制。方法：16只SD大鼠分组：青年组8只,2～3月龄;老年组8只,24～26月龄。应用电位反应测听仪检测不同频率短纯音（4、8、16、32和40kHz）诱发的青年组和老年组大鼠双侧ABR。听觉功能测试后,解剖取出双耳听泡,分离耳蜗基膜。分别用细胞核DNA染料碘化丙锭染色不同月龄大鼠耳蜗基膜细胞核,细胞色素C免疫荧光染料标记大鼠耳蜗基膜细胞的细胞色素c蛋白,荧光显微镜下观察不同月龄大鼠耳蜗基膜细胞荧光染色的变化。结果：老年组大鼠的不同频率ABR阈值均高于青年组（P〈0．01）。微弱拘细胞色素c荧光标记物存在于青年组大鼠耳蜗基膜毛细胞质（细胞膜的内侧,线粒体存在部位）,增强的细胞色素C免疫反应物存在于老年组大鼠耳蜗基膜细胞。细胞色素c阳性反应见于：①细胞核型不变;②碘化丙锭染色略有加深,细胞核型不变;③细胞核轻微核固缩;④核肿胀的毛细胞。相反,部分核固缩≤3／4核的毛细胞细胞色素C阳性反应物减少或消失,核缺失区域的毛细胞未见细胞色素c阳性反应物。老年大鼠耳蜗基膜凋亡毛细胞线粒体释放的细胞色素c存在核内转移现象。结论：细胞色素c免疫荧光染色为老年耳蜗基膜毛细胞退行性变早期的细胞生物学标记之一。细胞色素C向细胞核内的转移,可能与老年大鼠耳蜗凋亡毛细胞染色质凝聚相关。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向内耳毛细胞样细胞分化的研究

目的 探讨体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向耳蜗毛细胞样细胞分化的可行性.方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并加以鉴定.分离出生1～3 d的乳鼠耳蜗Corti器,与骨髓间充质干细胞在体外共培养14 d.通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学染色对分化细胞的特异性分子指标(myosinⅦa、math1及calretinin)进行鉴定.结果 免疫细胞化学染色显示诱导分化后的细胞myosinⅦa、math1和calretinin表达阳性,RT-PCR提示分化后的细胞可表达毛细胞的标志物myosinⅦa和math1.结论 体外培养的骨髓间充质干细胞可诱导分化为具有毛细胞分子标志物的毛细胞样细胞.     

硫酸链霉素引起的大鼠体外培养耳蜗毛细胞凋亡

目的 探讨在离体培养条件下硫酸链霉素是否通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的激活而导致大鼠耳蜗毛细胞凋亡.方法 将出生后3～4 d的大鼠耳蜗基底膜取出进行离体培养,培养过夜后用0.1 mmol/L硫酸链霉素培养液继续培养24 h.终止培养前1 h应用碳氧荧光素标记的肽荧光甲基酮(carboxyfluorescein labeled peptide fluoromethyl ketone,FAM-peptide-FMK)标记的caspase-6,caspase-8,或caspase-9指示剂作用1 h,然后应用异硫氰酸四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine iso-thiocyanate,TRITC)标记的鬼笔环肽(phalloidin)标记毛细胞的纤毛和表皮板,再应用Topro-3 DNA探针对细胞核进行染色,最后在共聚焦显微镜下观察.结果 1 mmol/L硫酸链霉素引起的耳蜗毛细胞缺失在底回约为80%,在顶回约为20%.经链霉素作用后,耳蜗毛细胞的细胞核发生浓缩和碎裂,同时可见cmpase-6,caspase-8和caspase-9阳性表达.结论 硫酸链霉素可以引起离体培养的大鼠耳蜗毛细胞凋亡,上游和下游的caspase激活可能是其主要途径.     

AIF and endoG translocation in noise exposure induced hair cell death

Activation of caspases is a key element in the apoptotic process. However, mitochondria also play an important role via the release of proapoptotic proteins. This study investigated the roles of mitochondria-related apoptosis inducing factor (AIF) and endonuclease G (endoG), mitochondrion-specific nucleases, as well as caspase-3, an important mediator of apoptosis, in noise exposure induced hair cell death. Guinea pigs were exposed for 4h/day to broadband noise at 122 dB SPL for 2 days. After the noise exposure, the cochleae were examined for the activity of caspase-3 with carboxyfluorescein-labeled fluoromethyl ketone (FMK)-peptide inhibitors. The cochleae were further examined for AIF and endoG translocation from the mitochondria by immunohistochemistry. Noise exposure triggered activation of caspase-3 in apoptotic hair cells. In the normal organ of Corti, AIF and endoG were co-localized to the mitochondria. After noise exposure, AIF translocated into the nuclei of apoptotic and necrotic hair cells. The translocation of endoG from mitochondria into the nucleus was also found in apoptotic OHCs. These findings indicate that mitochondria-released proapoptotic proteins, AIF and endoG, are important factors in a noise-induced hair cell death pathway.