组织因子途径抑制物2对角膜基质细胞表达MMPs的影响

目的:探讨组织因子途径抑制物(TFPI-2)与体外角膜基质细胞基质金属蛋白酶(MMPs)表达的关系。方法:体外兔角膜基质细胞原代、传代培养;脂质体介导人类TFPI-2真核表达载体pBos-Cite-neo/TFPI-2转染基质细胞,G418筛选阳性细胞,RT-PCR和Western-blot技术检测转染前后三组角膜基质细胞(转染TFPI-2基因组K-TFPI-2、转染空载体组K-V、未转染组K-P)中TFPI-2mRNA以及相应蛋白质的表达水平;利用明胶酶谱法分析比较转染前后三组角膜基质细胞表达MMPs的活性差异。结果:K-TFPI-2组角膜基质细胞TFPI-2mRNA和蛋白质的表达较K-P和K-V组显著上调(mRNA:0.79±0.02vs0.51±0.03和0.48±0.02,P=0.000和P=0.000;蛋白质:24.5±0.8vs15.5±0.5和14.9±0.9,P=0.000和P=0.000);与K-P和K-V组相比,K-TFPI-2组细胞表达MMP-1,2的活性下降(MMP-1:12.3±0.7vs16.7±1.2和15.9±0.7,P=0.001和P=0.003;MMP-2:15.4±1.3vs18.2±1.1和17.8±1.1,P=0.027和P=0.046)。结论:TFPI-2表达可明显抑制角膜基质细胞表达MMPs的活性,为进一步开展角膜新生血管性疾病的基因治疗提供实验依据。     

NS398对白介素1α诱导兔角膜基质细胞环氧化酶2表达的抑制

目的探讨氮-2,环己氧-4,硝基苯-甲基磺胺（NS398）对白介素1α（IL-1α）诱导的兔角膜基质细胞环氧化酶2（COX-2）表达的影响。方法体外培养兔角膜基质细胞,实验组分别以含0、25、50、100、200μmol／LNS398的培养液孵育2h后加入IL-1α诱导COX-2表达,24h后实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR）检测兔角膜基质细胞中COX-2基因表达的差异,四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同浓度NS398对细胞生长的影响,并与对照组进行比较。结果Real—Time PCR结果显示IL—1α诱导后24h各组COX-2 mRNA表达量差异有统计学意义（F=988．45,P〈0．01）;对照组与各实验组以及各实验组之间COX-2 mRNA表达量进行多重比较可见,0μmol／LNS398浓度组与对照组之间差异无统计学意义（q=1．3322,P〉0．05）,其他NS398浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（q=34．7896,48．3298,65．8010,70．8131,P〈0．01）,随培养液中NS398浓度的增加,IL-1α刺激后兔角膜基质细胞中COX-2 mRNA表达量不断下降（q=36．1218,49．6620,67．1332,72．1453,13．5402,31．0114,36．0235,17．4712,22．4833,5．0121,P〈0．01）;MTT法检测结果显示,100μmol／L、200μmol／L的NS398对兔角膜基质细胞生长均有明显的抑制作用（q=12．7693,20．9087,P〈0．01）。结论NS398能够有效抑制IL-1α诱导的兔角膜基质细胞COX-2的表达,但超过一定浓度会对细胞产生明显毒性作用。     

阳离子脂质体介导的p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响

目的 探讨阳离子脂质体介导的外源标志基因LacZ转染人角膜基质细胞的有效性和安全性及p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响。方法 （1）利用阳离子脂质体lipofectamine^TM reagent介导的外源标志基因LacZ的质粒DNA转染人角膜基质细胞,行X－gal染色,确定转染率;（2）利用免疫细胞化学和四甲基偶氮唑盐法,观察阳离子脂质体lipofectamine^TM reagent介导p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响;（3）用0．5％锥虫蓝染色观察各组细胞活性率。结果 阳离子脂质体lipofectamin^TM reagent可介导含标志基因LacZ的质粒DNA对人角膜基质细胞的转染,在1：4和1：8两组中均观察到转染率随转染时间延长而增高,随观察时间延长而降低,在质粒DNA／脂质体比例为1：8,转染时间为24h,观察2d时达高峰,为40．5％;阳离子脂质体lipofectamine^TM reagent介导外源p21WAF1基因转染可提高人角膜基质细胞中p21蛋白的表达,并抑制该细胞的增殖;0．5％锥虫蓝染色显示各组细胞活性率均≥90％,未见明显细胞毒性。结论 阳离子脂质体可介导外源目的基因对人角膜基质细胞安全、相对高效的转染;其介导的p21WAF1基因转染可抑制人角膜基质细胞的增殖;并无明显细胞毒性反应。     

反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞增生的影响

目的探讨反义cyclinD1基因转染后人角膜基质细胞增生的改变。方法人角膜组织来源于北京大学第一医院眼库体外培养人角膜基质细胞,采用第2代或第3代细胞用于实验。利用阳离子脂质体lipofectamine介导反义cyclinD1基因转染入体外培养的人角膜基质细胞。同时设非转染组（以PBS代替cyclinD1质粒及lipofectamine）及lipofectamine转染组（以PBS代替反义cyclinD1质粒）作为对照。应用免疫细胞化学法观察lipofectamine介导反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞中cyclinD1蛋白表达的影响,应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法观察其对人角膜基质细胞增生的影响,并用质量分数0.5%锥虫蓝染色观察活细胞比率。结果非转染组和lipofectamine转染组均有大量人角膜基质细胞的细胞核cyclinD1染色呈棕褐色,反义cyclinD1转染组只有少量人角膜基质细胞细胞核cyclinD1染色呈棕褐色。与非转染组和lipofectamine转染组比较,反义cyclinD1转染组在转染后2、6、10dcyclinD1蛋白在培养的人角膜基质细胞中的表达明显降低,差异均有统计学意义（t=6.050、t=5.180、t=5.040,P〈0.01;t=6.190、t=5.670、t=5.010,P〈0.01）,而非转染组与lipofectamine转染组间比较,差异均无统计学意义（t=1.120、t=1.310、t=1.010,P〉0.05）。转染后2、6、10d,反义cyclinD1转染组人角膜基质细胞的A570值分别低于非转染组和lipofectamine转染组,差异均有统计学意义（t=5.830、t=5.210、t=4.920,P〈0.01;t=5.130、t=5.010、t=4.850,P〈0.01）,说明抑制了基质细胞的增生,而非转染组与lipofectamine转染组间比较,差异均无统计学意义（t=1.110、t=1.230、t=1.120,P〉0.05）。0.5%锥虫蓝染色显示各组活细胞比率均在90%以上,未见明显的细胞毒性。结论阳离子脂质体介导的反义cyclinD1基因转染在转染后一定时间内可降低人角膜基质细胞中cyclinD1蛋白的表达,抑制人角膜基质细胞的增生,未见明显细胞毒性,为角膜基质过度愈合反应的基因治疗奠定了基础。     

大鼠opticin表达基因小发夹RNA真核表达质粒的构建及鉴定

　　目的　构建针对大鼠opticin表达基因(OPTC)的特异性小发夹RNA(shRNA)真核表达质粒。方法　用DNA重组技术将针对大鼠OPTC基因不同位点所设计的4个shRNA序列克隆到真核表达质粒中。根据构建的4对质粒设置shRNA-1组、shRNA-2组、shRNA-3组、shRNA-4组,同时只加转染试剂不加质粒的细胞设为正常对照组,转染阴性质粒的细胞为阴性对照组。用脂质体lipofectimine 2000将4个shRNA质粒分别转染至体外培养的原代大鼠睫状体非色素上皮(NPE)细胞,转染后采用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测OPTC基因的mRNA及opticin蛋白的相对表达量和抑制率。结果　各组质粒转染大鼠NPE细胞后,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4组细胞OPTC mRNA相对表达较正常对照组均明显下调(F=10.239,P＝0.000),各组OPTC mRNA抑制率为85.7%、62.87%、54.87%、48.77%。各质粒干扰组细胞opticin蛋白表达较正常组均有不同程度下降(F=17.870,P=0.000),各组opticin蛋白抑制率为78.7%、34.6%、31.1%、16.8%。结论　OPTC基因干扰质粒shRNA-1可以有效抑制大鼠睫状体NPE细胞opticin的表达。      

小干扰RNA沉默 HlF-1α对缺氧状态下脉络膜黑色素瘤细胞中MMP-2表达的影响

目的：：以小干扰RNA沉默人眼脉络膜黑色素瘤细胞中的低氧诱导因子-1( hypoxia inducible factor-1, HIF-1)基因,在缺氧状态下观察其对人眼脉络膜黑色素瘤( human uveal melanoma cell,OCM-1)细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。方法：将脉络膜黑色素瘤细胞分为正常组与缺氧组,其中将缺氧组再分成单纯缺氧组、干扰组、脂质体对照组、阳性对照组和阴性对照组;对正常组细胞用含有浓度为10％的胎牛血清和1％的双抗(青-链霉素混合液)的DMEM 高糖培养基进行培养。在缺氧组人眼OCM-1细胞的培养瓶中加入100μmol/ L CoCl2以构建肿瘤细胞内部的缺氧微环境。干扰组转染HIF-1α siRNA,阴性对照组转染无义siRNA,阳性对照组转染β-actin siRNA,脂质体对照组转染空脂质体。RT-PCR 检测细胞中HIF-1α和MMP-2 mRNA 的表达,行Western-blot 检测HIF-1α和MMP-2蛋白的表达。结果：与正常组相比,单纯缺氧组HIF-1α蛋白的表达增高(P<0.05),而其mRNA 表达量无明显变化(P>0.05); MMP-2 mRNA 及蛋白的表达升高(P<0.05)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA 表达下降(P <0.05),证实转染成功;干扰组HIF-1αmRNA 和MMP-2 mRNA 和蛋白表达均下降(P<0.05),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。结论：缺氧条件下可以提高人眼脉络膜黑色素瘤细胞中 HIF-1α蛋白的表达,而且HIF-1α蛋白的表达水平可以影响MMP-2的转录与翻译,从而可能进一步影响人眼脉络膜瘤细胞的外周浸润和远处转移能力。     

人血管内皮细胞生长抑制因子基因转移抑制角膜新生血管的实验研究

目的 探讨以阳离子脂质体介导重组人pcDNA4-血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)基因转移对角膜新生血管的抑制作用.方法 实验研究.40只健康成年新西兰大白兔(40只眼),采用随机数字表法分为4组:A组(10只兔)为阳离子脂质体-重组人pcDNA4-VEGI基因转染组;B组(10只兔)为空白载体转染组;C组(10只兔)为阳离子脂质体转染组;D组(10只兔)为空白对照组.自行构建真核表达的重组人血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)基因,并检测重组基因的正确性;角膜缝线法制作兔角膜新生血管模型,用结膜下注射的方法将阳离子脂质体包裹的VEGI重组质粒(pcDNA4-VEGI)转染入兔角膜,裂隙灯显微镜下观察记录各组兔角膜新生血管长出的时间、角膜新生血管的长度和数量,并分别于基因转染后1、3、7、14及21 d以免疫组织化学方法观察VEGI基因表达情况,观察其对角膜新生血管的抑制作用.采用SPSS 10.0单因素方差分析行数据统计.结果 计算机自动测序证实成功构建真核表达的重组人VEGI基因;动物实验中基因转染组角膜新生血管平均出现时间为6.3 d,对照组分别为3.1、3.2、3.2 d不等,差异有统计学意义(F=39.838,P=0.00);基因转染后第3天,转染组实验兔未出现角膜新生血管,对照组已有部分兔眼出现角膜新生血管;转染后第7天,转染组实验兔的角膜新生血管纤细,累及钟点数局限于缝线周围,对照组兔的角膜新生血管最长为2.9 mm,血管密集;转染后第14天,转染组兔角膜新生血管最长达4.0 mm,对照组新生血管最长达6.4 mm,累及钟点数为3.2个;各时间段基因转染组角膜新生血管长度、平均面积与对照组相比,差异均有统计学意义.A组角膜新生血管长度与B组相比,第7、14、21天q值分别为17.386、20.944、8.892,P值均＜0.01;与C组相比,第7、14、21天q值分别为19.488、19.795、7.483,P值均＜0.01;与D组相比,第7、14、21天q值分别为19.583、20.413、8.941,P值均＜0.01.A组角膜新生血管面积与B组相比,第7、14、21天q值分别为30.238、57.820、35.543,P值均＜0.01;与C组相比,第7、14、21天q值分别为32.607、57.843、36.653,P值均＜0.01;与D组相比,第7、14、21天q值分别为33.873、57.590、34.724,P值均＜0.01.免疫组织化学显示角膜上皮、基质、新生血管管壁细胞的VEGI表达阳性.结论 利用人工合成引物和聚合酶链反应方法可以将连接于原核表达载体的VEGI基因切下并连接于真核表达载体;阳离子脂质体能够介导重组人VEGI基因转染入角膜组织并使其分泌VEGI蛋白,对角膜新生血管有抑制作用.     

脂质体介导外源基因体外转染兔角膜内皮细胞条件的优化

目的:观察阳离子脂质体LipofectamineTM 2000是否能介导目的基因转移至兔角膜内皮细胞,并优化转染条件。方法:体外培养兔眼角膜内皮细胞,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,通过体外细胞转染实验,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件,荧光显微镜观察目的基因的表达。结果:角膜内皮细胞内可见脂质体介导的绿色荧光蛋白表达,LipofectamineTM在细胞融合度为80%~90%,脂质体/DNA为3L/g,脂质体的量为1.8μL,转染时间为5h时,转染效率最高。结论:阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至角膜内皮细胞内,GFP可作为报告基因优化脂质体转染条件。     

脂质体介导兔角膜内皮细胞基因转染的观察

目的观察阳离子脂质体Lipofectamine2000能否介导目的基因转移至兔角膜内皮细胞内及脂质体潜在的毒副作用。方法RT-PCR检测特异性胶原Ⅷ进行细胞鉴定,通过体外细胞转染实验优化阳离子脂质体与质粒DNA的浓度和比例,选择Lipo-fectamine^TM 2000/pEGFP-N1比值3∶1,脂质体体积分别为0μL、6μL、9μL、12μL转染兔角膜内皮细胞,荧光显微镜观察目的基因的表达,透射电镜观察细胞超微结构。结果RT-PCR扩增得到单一产物,与预期的扩增序列大小完全一致,角膜内皮细胞内可见脂质体介导的绿色荧光蛋白表达,Lipofectamine^TM 2000浓度能显著影响其对兔角膜内皮细胞的转染效率,存在最佳浓度,在35mm培养皿中,3μg DNA与9μL脂质体转染效率最高,透射电镜显示12μL脂质体可导致细胞器出现肿胀、崩解现象。结论阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至角膜内皮细胞内,在35mm培养皿中,12μL脂质体对角膜内皮细胞有一定的毒副作用。     

脂质体介导Bcl-xL基因体外转染人角膜基质细胞的动态表达

目的:观察脂质体LipofectamineTM(LF)2000介导Bcl-xL基因在人角膜基质细胞中表达的时间规律。方法:Bcl-xL/LF2000载体复合物转染人角膜基质细胞,转染后1～15d,采用定量RT-PCR及流式细胞计数法检测目的基因Bcl-xL表达阳性细胞率,观察目的基因在角膜基质细胞中表达的时间变化规律。结果:RT-PCR及流式细胞计数法均显示:在转染后1d开始检测到Bcl-xL表达阳性细胞,阳性率在转染后3d最高(48.3%),此后逐渐降低,转染后15d有少量细胞仍表达Bcl-xL基因。结论:LF2000能有效介导外源基因Bcl-xL转染人角膜基质细胞。     

人β神经生长因子基因转染体外培养猫角膜内皮细胞促进分裂再生的研究

目的 探讨人β神经生长因子真核表达载体(pcDNA4-13-NGF)转染体外培养猫角膜内皮细胞并促进细胞分裂再生的机制,为将该基因应用于促进人角膜内皮细胞再生的研究打下基础.方法 为实验研究.通过EffecteneTM脂质体介导将自行构建并经测序证实的人pcDNA4-B-NGF转染到体外培养的猫角膜内皮细胞中.采用分组对照的方法研究转染前后猫角膜内皮细胞分裂再生能力.转基因后48 h通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色方法分别在mRNA和蛋白水平检测人β神经生长因子(β-NGF)的表达.转基因后96 h采用细胞四甲基偶氮唑盐染色(MTT)测量吸光度值、细胞有丝分裂指数、流式细胞仪检测G1期细胞比例及细胞损伤后愈合面积测量等方法检测目的 基因对猫角膜内皮细胞增殖活性的作用.结果 EffecteneTM脂质体可有效介导重组真核表达载体peDNA4-β-NGF转染到经改良方法体外培养的猫角膜内皮细胞中,转染效率为11.3%,并促进该细胞表达β-NGF.正常对照组β-NGF/β-actin比值结果为3.14,加脂质体组为3.23,pcDNA4质粒转染组为3.21,pcDNA4-β-NGF重组质粒转染组为4.53.培养液、正常对照组、加脂质体组、pcDNA4质粒转染组及pcDNA4-β-NGF重组质粒转染组平均A值分别为0.178±0.007、0.482±0.033、0.488±0.017、0.520±0.021及0.623±0.041.正常对照组、加脂质体组、pcDNA4质粒转染组及pcDNA4-β-NGF重组质粒转染组细胞有丝分裂指数分别为3.3%、3.0%、3.1%及7.7%.正常对照组、加脂质体组、pcDNA4质粒转染组及pcDNA4-β-NGF重组质粒转染组G1期细胞比例分别为68.1%、51.6%、60.4%及87.9%.结论 人β-NGF基因可通过EffecteneTM脂质体介导有效转染到体外培养的猫角膜内皮细胞中,并促进细胞分裂再生,为进一步将此基因转入人角膜内皮细胞的研究提供实验经验.     

I型单纯疱疹病毒感染对人角膜上皮细胞基质金属蛋白酶-2和黏着斑激酶表达的影响

背景研究表明,I型单纯疱疹病毒（HSV-1）感染可导致角膜上皮细胞（CECs）基质金属蛋白酶（MMPs）表达、分泌和活性改变。黏着斑激酶（FAK）对MMPs的表达、释放和激活起着重要的调节作用。人角膜上皮感染HSV-1后FAK的表达变化鲜有报道。目的探讨HSV-1感染对体外培养的人CECsMMP-2和FAK表达的影响。方法以HSV-1（F株）感染体外培养的人CECs,应用逆转录PCR（RT—PCR）、免疫印迹法、免疫组织化学法分别于感染后2、20、40h检测人CECsMMP-2、FAK及磷酸化黏着斑激酶（p-FAK）的表达情况。结果RT．PCR法检测结果显示,感染细胞的MMP-2mRNA、FAKmRNA较非感染细胞（即加入无病毒无血清培养液的阴性对照组）的表达明显增强,不同时间点间比较差异无统计学意义,组别与时间点间不存在交互作用（MMP-2mRNA：F目目=0．968,P=0．436;F蚴I=47．649,P=0．000;F女Ⅱ#目=0．757,P=0．536．FAKmRNA：F时间=0．658,P=0．631;F组别=35．182,P=0．000;F交互作用=1．386,P=0．137）。Westernblot法检测结果显示,感染后2h时p-FAK、FAK、MMP-2在感染细胞与非感染细胞间差异均无统计学意义（P’0．05）,感染后20h、40h感染细胞的蛋白表达较非感染细胞均明显增强（P〈0．05）。免疫组织化学染色检测结果显示,随着感染时间的延长,MMP-2、FAK、p-FAK蛋白染色阳性细胞数目增多。结论在HSV-1感染早期,FAK的激活可刺激MMPs活性增强,从而加速角膜溃疡及坏死性病变的形成。     

Expression of cyclooxygenase-2 in corneal cells after photorefractive keratectomy and laser in situ keratomileusis in rabbits

PURPOSE: To compare the expression pattern of cyclooxygenase-2 (COX-2) in rabbit corneal cells after photorefractive keratectomy (PRK) and laser in situ keratomileusis (LASIK) with the same refractive correction. SETTING: Department of Ophthalmology, Wakayama Medical University, Wakayama, Japan. METHODS: Thirty adult albino rabbits were used in the study. Photorefractive keratectomy or LASIK was performed in 1 eye of each animal for the same refractive correction. Each animal was killed after healing intervals up to 6 months. Paraffin sections of the cornea were processed for immunohistochemistry for COX-2 and NFkappaB (p65). RESULTS: After PRK, the central and peripheral corneal epithelia up-regulated COX-2 at 3 days; the central epithelium was positive at 4 weeks. Central and peripheral epithelia returned to negative 3 months later. After LASIK, the central epithelium on the corneal flap up-regulated COX-2 at 1 and 2 weeks; it returned to negative at 4 weeks. The peripheral epithelium was labeled with the antibody. Keratocytes around the stromal incision between the flap and the stromal bed up-regulated COX-2 and returned to negative at 3 months. COX-1 was not detected immunohistochemically in corneal tissue during the healing intervals after both procedures. Nuclear factor kappaB was detected in the cytoplasm and nuclei of migrating corneal epithelial cells 1 day after PRK, was positive in the cytoplasm at 3 days and negative in cytoplasm and nuclei at week and later. CONCLUSIONS: Migrating injured epithelium expressed COX-2 until week 4 during post-PRK healing. Central uninjured epithelium as well as stromal keratocytes expressed COX-2 from 3 days to 2 weeks after LASIK. Uninjured peripheral epithelium also expressed COX-2 at 4 weeks. Activation of stromal keratocytes may induce expression of COX-2 in overlying uninjured epithelium via the inflammatory cytokine(s)/NFkappaB pathway.     

腺病毒与慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的有效性对比研究

目的观察比较腺病毒载体(adenovirus vector,AV)与慢病毒载体(lentivirus vector,LV)分别介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent proteins,EGFP)对体外培养的兔角膜基质细胞(rabbit corneal stroma cells,RCSC)的转染效率,探讨较优一种病毒载体作为角膜基因治疗载体的可行性。方法行离体RCSC原代、传代培养及鉴定;实验分为转染组(AV-EGFP转染组和LV-EGFP转染组)和对照组,观察转染组在不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)及感染后24h、48h、72h在倒置荧光显微镜下EGFP的表达情况,流式细胞技术检测转染效率。结果 AV-EGFP转染组感染RCSC后从24～48h就开始可见明显的绿色荧光,起始时间早于LV-EGFP转染组(48h)。LV-EGFP转染组在MOI≤1000时,随着MOI值增大,检测到的细胞转染率逐渐增大,两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05);AV-EGFP转染组在MOI>10时,随着MOI值增大,检测到的细胞转染率逐渐增大,两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05);而在同一MOI值下(MOI>1),LV-EGFP较AV-EGFP转染效率更高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 AV与LV均可有效转染离体RCSCs同一MOI值下(MOI>1),LV转染效率更高。     

血管内皮生长因子shRNA表达质粒抑制鼠角膜新生血管与血管内皮细胞中血管内皮生长因子的表达

目的 探讨RNA干扰对大鼠碱烧伤后角膜新生血管(CNV)与血管内皮细胞(EC)中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及作用机制.方法 实验研究.采用DNA重组技术设计合成针对VEGF mRNA的3条shRNA寡核苷酸片段,构建真核表达质粒VEGF shRNA1、2、3,然后将质粒通过脂质体介导分别转染EC,逆转录聚合酶链反应和Western blot免疫印迹法分别检测EC中VEGF mRNA和蛋白的表达及干扰效率,并筛选出干扰效率最高的质粒(VEGF shRNA3质粒)进行体内实验.将20只SD大鼠按完全随机设计方法分为两组,分别为实验组10只和对照组10只,建立大鼠碱烧伤后CNV模型.实验组于结膜下注射VEGF shRNA3质粒后,显微镜下观察CNV生长情况,7 d后利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)与Western blot法分别检测实验组和对照组角膜组织VEGF mRNA和蛋白的表达.多组间差异显著性检验用单因素方差分析,两组CNV面积比较采用重复测量的方差分析.结果 经酶切及测序证实重组质粒构建成功.VEGF shRNA1、2、3质粒均可下调VEGF mRNA和蛋白的表达,其中VEGF shRNA3质粒的抑制作用较强,VEGF mRNA和蛋白的抑制率分别为68.92%和66.22%.体内实验中碱烧伤后3、5、7 d,实验组CNV长度较对照组明显降低,差异有统计学意义(F=355.744,P=0.000);实验组CNV面积较对照组明显降低,差异有统计学意义(F=402.700,P=0.000);实验组VEGF mRNA和蛋白在角膜组织中的表达较对照组明显降低,抑制率分别为41.84%和41.86%.结论 构建的VEGF shRNA质粒能右效抑制EC中VEGF mRNA和蛋白的表达.结膜下注射VEGF shRNA3质粒能显著抑制碱烧伤后CNV的形成与VEGF的表达.     

siRNA沉默CTCF基因对牛角膜内皮细胞p27蛋白表达的影响

目的 探讨RNA干扰技术沉默结缔组织生长因子(CTGF)基因表达对p27蛋白表达的影响.方法 实验研究.设计并合成CTGF特异性小干扰RNA(siRNA),用脂质体转染入培养的牛角膜内皮细胞,正常对照组仅加入培养基而未进行siRNA转染.逆转录聚合酶链反应法观察基因沉默效果,免疫印迹法观察1.00μg/L转化生长因子β2作用下角膜内皮细胞内p27蛋白表达.采用单因素方差分析进行统计学分析.结果 CTGF siRNA成功转染入培养的牛角膜内皮细胞并有效沉默CTGF mRNA表达,转染24、48及72 h CTGF mRNA表达分别为正常对照组的17.3%、24.4%及41.7%,与正常对照组比较,差异有统计学意义(F=389.9,P<0.05).在转染36 h时,p27蛋白表达明显下降(F=299.3,P<0.05).结论 CTGF特异性siRNA能有效沉默细胞内CTGF mRNA表达,下调角膜内皮细胞p27蛋白的表达.